Metody otrzymywania zwierząt transgenicznych

Daniel Machnio

W ciągu ostatnich 20 lat, zwierzęta transgeniczne stały się jednym z głównych obiektów badawczych wykorzystywanych przez wiele nauk biologicznych . Wyróżniamy cztery główne drogi otrzymywania zwierząt transgenicznych: 1 - transplantacja jąder komorkowych, 2 - modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (ang. Embryonic Stem Cells), 3 - mikroiniekcja DNA do zygoty, 4 - transfer DNA przy pomocy wirusów. Dzięki metodzie 3 i 4 otrzymuje się zwierzęta z wysoką ekspresją elementów genetycznych. Natomiast metoda ES pozwala wyłączyć wybrany gen, tzw. "knock out" tylko u mysz, w pozostałych gatunkach wykorzystujemy metodę numer 1. Obecnie intensywnie rozwijane są metody indukowalnej/warunkowej ekspresji genów. Spowodowane jest to potrzebą uzyskania zwierząt, w których ekspresja lub „knock-out” wybranego genu obecne są tylko w określonych komórkach ciała lub w czasie zależnym od badacza. Głównymi systemami tego typu są: system Cre/lox - umożliwiający „knock-out” genu ograniczony tylko do pewnego typu komórek oraz system tetracyklinowy - umożliwiający włączanie i wyłączanie ekspresji wprowadzanego genu w dowolnym czasie.

• Pierwsze próby otrzymania zwierząt transgenicznych datuje się na początek lat 80 XX wieku. Powstały one w wyniku połączenia dwóch dziedzin naukowych: biologii molekularnej oraz biologii doświadczalnej. Embriologowie nauczyli się sztuki hodowania zarodków poza ustrojem oraz rozwinęli techniki manipulacji nimi. W miarę rozwoju biologii molekularnej uzyskano możliwości dowolnego konstruowania fragmentów DNA a następnie wprowadzenie ich do genomu gospodarza.

Czym są zwierzęta transgeniczne ?

Są to zwierzęta, do genomu których wprowadzono nowy gen, heterologiczny (z innego organizmu) w taki sposób , aby znalazł się on zarówno w komórkach somatycznych jak i komórkach pasma płciowego dzięki czemu podlega dziedziczeniu. Jest to trwała modyfikacja genetyczna. Technika uzyskiwania takich organizmów różni się w zależności od tego czy mamy do czynienia z rośliną czy zwierzęciem. Wyróżniamy następujące metody wprowadzania egzogennego DNA do komórek zwierząt:

• przypadkowe wbudowanie fragmentu liniowego DNA

• modyfikacja własnego genomu w wyniku wprowadzenia obcego DNA (technologia knock out i knock in

• insercja całego sztucznego obiektu genetycznego np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC ( Bacterial Artificial Chromosome) lub sztucznego chromosomu drożdżowego YAC (Yeast Artificial Chromosome).

Sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych

Wyróżniamy kilka metod, które wykorzystujemy do procesu transgenizacji zwierząt hodowlanych oraz laboratoryjnych:

• transfer wirusowy DNA

• mikroiniekcja DNA do zygoty

• transplantacja jąder komórkowych

• modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES.

TRANSFER WIRUSOWY DNA - metoda ta bazuje na infekcji przy pomocy retrowirusów oraz lentiwirusów. Główną przewagą tej metody nad pozostałymi jest wyjątkowo duża wydajność sięgająca nawet 80% transgenicznego potomstwa. Ponadto retrowirusy i lentiwirusy mają zdolność do integracji z genomem gospodarza po wniknięciu do jego komórki. W przypadku retrowirusów ograniczeniem metody stało się wyciszenie ekspresji genów ( obecnych w sekwencji wbudowanego do genomu gospodarza) podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej pozbawione są lentiwirusy które stanowią jedną z klas retrowirusów. Lentiwirusy są zdolne do infekcji zarówno dzielących i jak i nie dzielących się komórek i ta cecha sprawiła, że są szeroko stosowane jako wektory w terapiach genowych. Do otrzymania zwierząt transgenicznych z zastosowaniem lentiwirusów wykorzystano dwie metody: infekcje jednokomórkowych zarodków oraz infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES .

MIKROINIEKCJA DNA DO ZYGOTY - metoda ta opiera się na mikroiniekcji DNA (w postaci sztucznych chromosomów lub liniowego) do jednego z przedjądrzy jednokomórkowego zarodka - zygoty używając do tego procesu mikrochirurgicznej szklanej pipety. Przedjądrza mają tą cechę, że zawierają materiał genetyczny pochodzący zarówno od ojca jak i od matki tuż przed połączeniem się w jedno jądro komórkowe, które w późniejszym okresie kieruje prawidłowym rozwojem zarodka. Do dowolnie wybranego przedjądrza wstrzykiwany jest roztwór DNA, po czym nastrzyknięte zygoty hoduje się in vitro aż do osiągnięcia stadium dwukomórkowego. Minusem tego etapu jest brak możliwości dokładnego kontrolowania objętości wstrzykiwanego roztworu DNA. Proces mikroiniekcji DNA daje szanse przeżycia tylko połowie zarodków, które następnie umieszczane są w jajowodach samic - matek zastępczych. Po około trwającej 3 tygodnie ciąży u gryzoni rodzi się około 30% przetransformowanych zarodków wśród których około 15% posiada w swoim genomie zintegrowany transgen. Metoda mikroiniekcji opiera się na przypadkowej integracji wstrzykniętego transgenu z genomem gospodarza i nie ma możliwości wyboru lokalizacji takiej integracji. Ponadto nie ma możliwości kontroli liczby kopii transgenu wbudowanego w genom, które często układają się tandemowo. Uzyskany transgeniczny osobnik może posiadać badany transgen we wszystkich komórkach swojego organizmu lub może być chimerą. Chimera z definicji to taki organizm, którego komórki ciała nie są identyczne pod względem genetycznym. W przypadku zwierząt oznacza to, że niektóre komórki posiadają transgen a inne nie. Taka sytuacja może się zdarzyć, gdy integracja transgenu do genomu nastąpiła po pierwszym podziale komórkowymi tylko w jednej linii komórek potomnych zwanych blastomerami. W sytuacji kiedy transgen nie znajduje się w komórkach płciowych założycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie będzie on przekazywany następnym pokoleniom, co uniemożliwi wyprowadzenie linii transgenicznej oraz przeprowadzenie badań. Jedną z najważniejszych zalet metody mikroiniekcji DNA jest brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA. Dokonuje się iniekcji DNA pochodzącego z plazmidów (ok.10 kpz), kosmidów (ok. 45 kpz), a także DNA ze sztucznych chromosomów BAC, YAC.

• Rys. Mikroiniekcja DNA

• Rys. Przedjądrza

TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH - jest to jedyna metoda pozwalająca na uzyskanie klonów liczących większą liczbę osobników. Usuwane są oba przedjądrza zygoty lub chromosomy z niezapłodnionych oocytów, a następnie wprowadzane są na ich miejsce jądra z blastomerów zarodków. Wprowadzenie uzyskuje się różnymi metodami : mikrochirurgiczną transplantacją , metodą fuzji komórkowych czego odmianą jest elektrofuzja itd. Wszystkimi wyżej wymienionymi metodami podejmowano próby klonowania przedstawicieli takich gatunków jak myszy , króliki , owce i innych. Należy jednak podkreślić , że były to manipulacje komórkami niezróżnicowanymi - komórkami embrionalnymi, a więc zachowującymi pewną naturalną totipotentność. Zupełnie odrębną metodą są próby klonowania z wykorzystaniem dorosłych , zróżnicowanych komórek ssaczych. Najsławniejsza owca świata - Dolly powstała w ten właśnie sposób. Po raz pierwszy udało się sklonować organizm korzystając z komórki dorosłego ssaka. Materiał genetyczny dorosłej , somatycznej komórki jednej owcy wprowadzono do cytoplazmy komórki jajowej pozbawionej jądra drugiej owcy i implantowano do macicy trzeciej. W tym przypadku należy jednak zachować nieco sceptycyzmu. Przede wszystkim dlatego , że eksperymentu tego nie udało się jeszcze nikomu powtórzyć. Ponadto próba ta udała się tylko raz na niemal trzysta. Ponieważ wiadomo skądinąd , że z podobną częstością występują w tkance , z której pobrano komórki , komórki niezróżnicowane a także , że owca , od której je pobrano była w ciąży , sklonowane zwierzę może być pomyłką lub przypadkiem. Technika jaką zastosowano wiąże się ponadto ze sporym ryzykiem deformacji rozwojowych a także jej istotną wadą jest bardzo niska wydajność. Daleka więc jeszcze droga do sukcesu w tej dziedzinie. Jednak wyścig już się zaczął.

MODYFIKACJA PIERWOTNYCH KOMÓREK ZARODKOWYCH - dzięki tej metodzie uzyskujemy precyzyjną modyfikację interesującego nas genu lub locus w genomie. Komórki ES izoluje się z blastocysty, dzięki czemu uzyskuje się komórki niezróżnicowane, które charakteryzują się możliwością wbudowania się do tkanek rozwijającego się zarodka po ponownym umieszczeniu w blastocyscie. Modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych daje szansę na przekształcenie komórek ES in vitro w bardzo precyzyjny sposób. Bazą do wprowadzenia genów do komórek ES jest metoda elektroporacji ( traktowanie komórki polem elektrycznym), rzadziej natomiast używana jest do tego celu lipofekcja lub metoda wapniowa. Aby wprowadzić DNA w interesujące nas miejsce, wybrany fragment wyposażony jest w sekwencję genu selekcyjnego (sekwencja ta otoczona jest przez sekwencje homologiczne do modyfikowanego genu). W jądrze komórkowym następuje rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana genomowej sekwencji na sekwencje dowolnie wybraną przez badacza. Insercja nowego fragmentu DNA skutkuje dezaktywacją funkcji genu, w którym ta insercja zaszła (efektem procesu jest komórka z wyłączonym genem knock-out). Produkty ekspresji genu selekcyjnego zawartego na wprowadzonym fragmencie DNA umożliwiają wyselekcjonowanie tych komórek klonów, w których następuje właściwa wymiana (rekombinacja homologiczna). Komórka w której doszło do wymiany i wyłączenia wybranego przez nas genu proliferuje w odpowiednich warunkach selekcyjnych. Komórki potomne przenosi się do blastocysty w której przekształcone komórki ES łączą się z niezmodyfikowanymi komórkami zarodkowymi dającymi jeden organizm. Powstała chimera cechuje się obecnością komórek ze zmienionym genotypem (wyłączonym genem knock-out). Jeżeli komórki ES - knock out zasiedlą tzw. sznury płciowe, czyli komórki z których ukształtują się komórki rozrodcze, to taki osobnik ma szansę przekazać nową cechę - knock -out genu następnym pokoleniom. Potomstwo chimer jest heterozygotyczne i dopiero krzyżówka dwóch zygot daje osobnika homozygotycznego za całkowicie wyłączonym genem na obu chromosomach homologicznych. Wyłączanie genów stosuje się aby poznać funkcje dowolnego genu poprzez zanalizowanie anomalii powstałych homozygot typu knock-out

• Rys. Modyfikacja komórek zarodkowych

Warunkowa/indukowalna ekspresja genów

W wielu sytuacjach otrzymywanie zwierząt transgenicznych wprowadza zmiany w obrębie genomu (np. nadekspresję lub knock-out) , które dają o sobie znać przez całe życie od momentu powstania organizmu we wszystkich komórkach ciała ( zwierzęta knock-out). Taka sytuacja wymusza powstanie problemów podczas analizy wyników przeprowadzonych eksperymentów ( u części myszy typu knock-out). Występują efekty kompensacji funkcji brakującego genu przez inne geny homologiczne lub pokrewne. W niektórych sytuacjach, gdy badany gen odgrywa kluczową rolę podczas rozwoju, jego delecja powoduje śmierć zarodka co wstrzymuje dalsze etapy badań. Dlatego wyzwaniem dla naukowców jest praca nad systemem warunkowej/indukowalnej ekspresji genów, które umożliwiają ekspresję typu knock-out wybranego genu tylko w określonych typach komórek oraz specyficzność promotora. Przykłady warunkowej/indukowalnej ekspresji genów podano poniżej.

System Cre/Lox

System ten ma tą własność, że komórki ES poddaje się modyfikacji celem wprowadzenia do badanego genu pewnych sekwencji bez naruszenia struktury tego genu ( technologia knock-out). W tym przypadku sekwencja badanego genu jest zastępowana przez taka samą sekwencję otoczoną miejscami loxP ( krótkimi sekwencjami rozpoznawanymi przez enzym rekombinazę Cre, która usuwa DNA zawarty między nimi). W takiej postaci komórki ES wstrzykuje się do blastocysty w celu wyhodowania myszy ze zmiennym genotypem. Myszy te, posiadające sekwencje, które chcemy usunąć (otoczone są one sekwencjami LoxP) krzyżujemy z myszami posiadającymi gen rekombinazy Cre. W zależności od właściwości promotora, który kieruje ekspresją, wycięcie genu nastąpi tylko w tych komórkach, gdzie będzie znajdował się ten enzym. Przykładem promotora, który wykazuje specyficzność do pewnego rodzaju komórek (neuronów pobudzających przodomózgowia) jest promotor genu α podjednostki CaMKII. Fragment promotora αCaMKII (o długości 8,5 kpz) zastosowano do otrzymania myszy αCaMKII-Cre . Otrzymano 14 linii myszy transgenicznych, które następnie skrzyżowano z myszami posiadającymi gen β-galaktozydazy pod promotorem β-aktyny, przy czym promotor i gen były rozdzielone sekwencją z kodonem „stop” dla transkrypcji. Sekwencja „stop” była ponadto otoczona miejscami loxP, wskutek czego ekspresja β-galaktozydazy możliwa była tylko po usunięciu tej sekwencji rozdzielającej przez rekombinazę Cre. W jednej z linii myszy obserwowano ekspresję β-galaktozydazy (świadczącej o zaistniałej rekombinacji Cre-loxP) tylko w komórkach pola CA1 hipokampa w mózgu. Opisaną linię myszy αCaMKII-Cre skrzyżowano ponadto z myszami posiadającymi gen dla receptora NMDAR1 otoczony sekwencjami loxP. Uzyskano w ten sposób myszy z „knock-outem” receptora NMDA ograniczonym tylko do niewielkiego regionu mózgu i tylko do pewnych komórek - pole CA1 hipokampa.

• Rys. System Cre/Lox

System tetracklinowy

Systemem, który zezwala również na indukowalną ekspresję genów jest system tetracyklinowy, w którym interesujący nas badany gen znajduje się pod kontrolą promotora tetracyklinowego ( minimalny promotor CMV oraz sekwencja operatora TetO ). W udoskonalonej wersji tego systemu użyto represora oraz odwrotnego aktywatora tetracyklinowego. Oba białka wiążą się z promotorem tetracyklinowym i oddziałują na jego aktywność w sposób zależny od doksycykliny.Deoksycyklina daje możliwość wyboru czasu włączenia i wyłączenia eskpresji genu. Natomiast na promotor kierujący ekspresją represora i aktywatora spada odpowiedzialność za wybór w jakich komórkach lub tkankach system ten będzie działał.

• Rys. System tetracyklinowy

Opis rysunku:

• rtTA - odwrotny transaktywator tetracyklinowy

• tTR - transrepresor tetracyklinowy

• TetP - promotor tetracyklinowy (PCMV*-1)

• X - regulowany gen; DOX - Doksycyklina

Podsumowanie

Najbliższy czas przyniesie nam prawdopodobnie wiele niespodzianek na temat odkryć w dziedzinie otrzymywania zwierząt transgenicznych. Przyczyni się to zapewne do lepszego zrozumienia mechanizmów kierujących realizacją informacji genetycznej i wykorzystania tej wiedzy do coraz to precyzyjniejszego modyfikowania genomu.

---

---