Wprowadzenie

Jedną z zasadniczych cech organizmów eukariotycznych jest obecność jądra, czyli przedziału komórkowego zawierającego materiał genetyczny. Powoduje to, że wszelkie procesy molekularne związane z DNA takie jak replikacja, rekombinacja i transkrypcja zachodzą w wydzielonej przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Również i inne etapy ekspresji genów nie związane z DNA, jak następująca równocześnie z transkrypcją lub po niej obróbka RNA, zachodzą wewnątrz jądra komórkowego. Na terenie jądra DNA podlega wieloetapowemu, hierarchicznemu procesowi kondensacji, dzięki któremu jego długość, zbliżająca się u wyższych eukariontów po całkowitym rozprostowaniu do kilku metrów, ulega pozornemu skróceniu o 10- do 50000 rzędów wielkości (Spencer i Dave, 1999; Pikaard 1998). Kondensacja genomowego DNA stwarza potencjalny problem zapewnienia jednoczesnego (lecz selektywnego) dostępu dla czynników białkowych do sekwencji genowych i regulatorowych zawartych w DNA równocześnie z szybką i efektywną przebudową struktur DNA zwiniętego wewnątrz jądra i wchodzącego w bliski kontakt z białkami kondensującymi Do wytworzenia tychże struktur nukleoproteinowych (noszących nazwę chromatyny) dochodzi w pierwszym rzędzie poprzez oddziaływania DNA z silnie zasadowymi białkami histonami (van Holde, 1989; Ramakrishnan, 1997). W wyniku tych oddziaływań tworzy się podstawowa jednostka strukturalna chromatyny nukleosom (Kornberg, 1974; Olins i Olins, 1974). Nukleosom jest głównym elementem procesu zwijania DNA wewnątrz jądra i zarazem kluczowym czynnikiem warunkującym dostęp do DNA. Cząstki nukleosomowe zawierające DNA i histony widoczne są pod mikroskopem elektronowym jako koraliki (ang. beads-on-a-string) o średnicy 10 nm, ulokowane na 2 nanometrowej nici DNA (Oudet i wsp., 1975). Każdy koralik stanowi cząstkę rdzeniową nukleosomu zawierającą DNA o długości ok. 146 par zasad nawinięty w blisko dwu zwojach na oktameryczny rdzeń białkowy złożony z dwóch cząsteczek histonów H2A, H2B, H3 i H4. Piąty histon, noszący nazwę łącznikowego lub histonu H1, wiąże się do nukleosomu i ułatwia organizowanie się nukleosomów w strukturę wyższego rzędu, włókno 30 nm. Histony podlegają modyfikacjom posttranslacyjnym, takim jak acetylacja i fosforylacja, co ma znaczenie dla kontroli transkrypcji i regulacji cyklu komórkowego, a także ogólnej i lokalnej struktury chromatyny (Ramakrishnan, 1997). Generalnie chromatyna kompetentna transkrypcyjnie ma strukturę rozluźnioną, co w obrazie spod mikroskopu elektronowego widoczne jest jako miejsca jasne. Taka struktura nosi ogólną nazwę euchromatyny. Jej przeciwieństwem jest ciemna i gęsta elektronowo struktura nieaktywnej transkrypcyjnie heterochromatyny.

Rola chromatyny w zjawiskach związanych z DNA, takich jak transkrypcja, ważnych dla właściwego przebiegu procesów różnicowania i rozwoju komórek oraz organizmów nie ogranicza się tylko do funkcji biernego rusztowania utrudniającego lub uniemożliwiającego zachodzenie tychże zjawisk. Do zajścia tych procesów konieczne jest współdziałanie statycznych i dynamicznych elementów struktur chromatynowych. Kluczowe znaczenie mają tu specyficzne czynniki modyfikujące chromatynę, zdolne do jej aktywacji lub represji (Dreyfuss i Struhl, 1999). W zachodzeniu większości procesów biochemicznych z udziałem chromatyny pośredniczą wielkie kompleksy zawierające liczne białka. Kompleksy te porównuje się do wewnątrzkomórkowych maszyn molekularnych. Ich skład podlega ścisłej regulacji, co zapewnia wysoką wierność ekspresji genów. Łączenie się z DNA głównych składników aparatu transkrypcyjnego, jak i ich działanie, ułatwione jest dzięki licznym czynnikom przebudowującym chromatynę, a wykorzystującym ATP. Ich zasadniczą funkcją jest reorganizacja nukleosomów poprzez zmianę kontaktów DNA z histonami (Tyler i Kadonaga, 1999).

Histony i nukleosomy

Histony zostały wykryte jako główny białkowy składnik jądra komórkowego już pod koniec ubiegłego stulecia (Kossel, 1884). Jako że ich sumaryczna zawartość w komórce zbliżona jest do zawartości DNA, przez długi czas sądzono, że same mogą stanowić materiał genetyczny. Histony są białkami zasadowymi podatnymi na ekstrakcję kwasem i w większości silnie konserwowanymi ewolucyjnie. Szczególnie silnej konserwacji ewolucyjnej podlegają histony rdzenia nukleosomu: H2A, H2B, H3 i H4, słabszej zaś histon łącznikowy H1 (DeLange i wsp., 1969).  Podstawowe własności histonów rdzeniowych i łącznikowych przedstawiono na rysunku 1.

Histony rdzeniowe i nukleosom

Rdzeń nukleosomu złożony jest z czterech białek, występujących w liczbie dwóch cząsteczek. Są to histony H2A, H2B, H3 i H4, których wspólną cechą jest motyw strukturalny zwany fałdem histonowym (ang. histone fold) (Arents i Moundrianakis., 1995). Składa się on z położonej centralnie długiej helisy i połączonej z nią po obu stronach za pomocą pętli i krótszych helis. Oprócz środkowej części globularnej w skład histonów rdzeniowych wchodzą ogony końca aminowego (N-końcowego) i karboksylowego (C-końcowego). W nieobecności DNA struktura ogonów jest nieustalona.  Mogą one jednak przybierać konkretne struktury po związaniu się do DNA. I tak badania nad poddanym mutagenezie histonem H4 drożdży wykazały, że ogon N-końca zawierający odcinek silnie zasadowy tworzy pod wpływem DNA - wraz ze stosunkowo słabo naładowanym sąsiadującym segmentem - amfipatyczną helisę ? (Johnson i wsp., 1992).

Cząstka rdzeniowa nukleosomu otworzona jest z czterech dimerów histonowych [2x (H2A-H2B) i 2x (H3-H4)]. Połączenia między cząsteczkami heterodimerów nosi nazwę uścisku ręki (ang. handshake motif). Histony tworzą heterodimery również  in vitro, tj. w roztworze. Dimery H3-H4 tworzą także w roztworze tetramer (H3-H4)x2 (Eickbush i Moundrianakis, 1979). Zdolność do łączenia się w dimery i tetramery oraz struktura motywu uścisku ręki charakteryzuje również niektóre czynniki transkrypcyjne, np. dwie podjednostki czynnika TFIID z Drosophila, dTAFII42 i dTAFII62 (Xie i wsp., 1996). Motyw taki występuje również w białku HMfB z hipertermofilnej archebakterii Methanothermus fervidus (Starich i wsp., 1996).

Tworzenie tetrameru zachodzi głównie poprzez oddziaływania hydrofobowe. W przeciwieństwie do heterodimeru H3-H4, heterodimer H2A-H2B nie tworzy struktur tetramerycznych. Dwa dimery H2A-H2B łączą się natomiast z tetramerem H3-H4 tworząc oktamer histonowy, zarówno in vivo w nukleosomie, jak i in vitro przy wysokiej sile jonowej. Oktamer nukleosomowy przypomina kształtem dysk, wokół ktorego owinięty jest DNA w postaci 1,65 zwoja płaskiej, lewoskrętnej superhelisy (Rys. 2) (Rhodes, 1997; Luger i wsp., 1997).

DNA wchodzący i wychodzący z nukleosomu przytrzymywany jest przez końce motywu strukturalnego histonu H3. Każdy z heterodimerów wiąże około 30 par zasad  DNA Interesująca wydaje się być funkcja pełniona przez ogony histonów budujących cząstkę nukleosomową, a związana z oddziaływaniem nukleosomów ze sobą. I tak końce aminowe histonów H3 i H2B przechodzą przez kanały małego rowka DNA, dzięki czemu co 20 par zasad wystaje jeden z ogonów. Natomiast wystający ogon aminowy histonu H4 kontaktuje się w wielu miejscach z powierzchnią dimeru H2A-H2B z sąsiedniego rdzenia nukleosomowego, co może ułatwiać tworzenie się chromatynowych struktur wyższego rzędu, czyli kondensację chromatyny. Histony oddziaływają z DNA wyłącznie  poprzez kontakt ze szkieletem fosfodwuestrowym nici DNA po wewnętrznej powierzchni supehelisy. DNA przytwierdzone jest do zrębu histonowego poprzez oddziaływania elektrostatyczne i wiązania wodorowe z grupami fosforanowymi, oraz kontakty niepolarne z grupami deoksyrybozy, co oznacza, że nie dochodzi do interakcji histonów z zasadami azotowymi DNA, a zatem, że pakowanie DNA w nukleosomy jest w zasadzie niezależne od jego sekwencji nukleotydowej.

Histony łącznikowe

Histon łącznikowy H1 wiąże się do nukleosomu ułatwiając organizowanie się nukleosomów w struktury wyższego rzędu (Finch i Klug, 1976; Thoma i wsp., 1979). Białko to nie podlega równie silnej konserwacji ewolucyjnej co pozostałe histony. Znanych jest wiele wariantów sekwencyjnych H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju danego organizmu. Na przykład w erytrocytach ptaków zamiast histonu H1 występuje głównie histon H5, w którym wiele reszt lizynowych zastąpione zostało przez reszty argininowe. Histony łącznikowe niemal wszystkich typów charakteryzują się podobną budową: zawierają centralną domenę globularną, odporną na proteolityczne działanie trypsyny i bogatą w aminokwasy hydrofobowe, otoczoną przez końce (ogony) aminowy i karboksylowy o strukturze mało ustalonej w środowisku wodnym. Ogony są silnie zasadowe; w szczególności w końcu karboksylowym ponad połowę reszt  stanowią argininy i lizyny. Domena globularna utworzona jest z wiązki trzech ?-helis, i znajdującą się C-końcu strukturą ?-szpilki (struktura helisa-skręt-helisa, ang. helix-turn-helix, HTH) (Zlatanova i van Holde, 1996; Gajiwala i wsp., 2000). Białka tego typu składają się z trzech
-helis (H), trzech zwojów
(Z) i trzech łączących je pętli (P), ułożonych w następującym porządku: H1-Z1-H2-P1-H3-P3-Z2-S1-Z3. Trzecia pętla łącząca drugi i trzeci zwój
tworzy wystającą strukturę nazywaną skrzydłem (ang. wing) i oznaczoną symbolem S1. W niektórych białkach tego typu obecna jest jeszcze druga pętla skrzydła, S2. Obecność struktury tego typu pozwala na wydzielenie z grupy białek typu HTH podrodziny zawierającej motyw tak zwanej skrzydlatej helisy (ang. winged-helix motif). Obecny jest on m. in. w obszarze wiązania do DNA bakteryjnego białka CAP (białko aktywatora katabolicznego), w motywie rozpoznawania DNA z czynnika transkrypcyjnego - jądrowego receptora hepatocytów HNF-3/forkhead Drosophila i ssaków (Lai i wsp., 1993), oraz w histonie łącznikowym, mimo że sekwencje tych białek  i histonu H1/H5 wykazują niski stopień homologii (Clark i wsp., 1993). Układ trzech elementów strukturalnych histonu H1 (krótszego końca aminowego, globuli i dłuższego ogona karboksylowego) jest na tyle charakterystyczny, że stał się kryterium przynależności danego białka do rodziny H1. Mimo to, niektóre białka zaliczane do tej grupy na podstawie innych cech nie zawierają środkowej globuli. Należy do nich m. in. histon H1 z pierwotniaka (orzęska) Tetrahymena (Wu i wsp., 1986).

Część globularna w histonie H1 wykazuje najwyższy stopnień konserwacji ewolucyjnej; różnice sekwencyjne zarówno ewolucyjne, jak i pomiędzy różnymi wariantami z tej samej tkanki czy organizmu - zlokalizowane są głównie w silnie naładowanych ogonach. Za pomocą analizy NMR i dyfrakcji rentgenowskiej kryształów części globularnej histonu H1 stwierdzono przed kilkoma laty, że w obrębie cząsteczki obecne są dwa miejsca wiązania do DNA: jedno zawierające motyw skrzydlatej helisy umożliwiające wiązanie do dużej bruzdy DNA, zaś drugie w postaci silnie konserwowanego regionu bogatego w aminokwasy zasadowe, położone po drugiej stronie cząsteczki (Ramakrishnan i wsp., 1993).

Stanowi to wyjaśnienie zaobserwowanych cech tego białka: (i) zdolności histonu H1 do spinania dwóch cząsteczek DNA na powierzchni nukleosomu, (ii) preferencyjnego wiązania histonu łącznikowego do krzyżujących się podwójnych nici DNA (sztucznych czteroniciowych rozgałęzień) w stosunku do wiązania się do liniowego, dwuniciowego DNA, (iii) jego zdolności do zaginania DNA pomiędzy nukleosomami w ten sposób, że tworzy on strukturę łodyżki (ang. stem) (Vignali i Workman, 1998).

Białka zawierające motyw helisa-skręt-helisa wykorzystują do rozpoznawania i wiązania się do DNA powierzchnię trzeciej helisy (służącą do specyficznego wiązania się do dużego rowka DNA), pętlę S1 oraz koniec karboksylowy pętli S2.  Niedawno odkryto, że w pewnych białkach z tej grupy, takich jak białko hRFX1, przypominających strukturalnie globulę histonu H5, istnieje alternatywny sposób rozpoznawania DNA, w którym drugi i trzeci zwój ?, wraz z łączącą je pętlą skrzydłem S1, oddziałuje z dużym rowkiem DNA, podczas gdy ?-helisa H3 kontaktuje się z małym rowkiem (Gajiwala i wsp., 2000),. Do wiązania się globuli histonu H5 do dużego rowka DNA poprzez skrzydło S1 niezbędna jest obecność w białku konserwowanego aminokwasu, lizyny 85 (lub argininy 58 w białku hRFX1). Jego usunięcie w H5 poprzez zamianę na glutaminę lub kwas glutaminowy powoduje utratę zdolności ochrony nukleosomowego DNA przez globulę H5 przed trawieniem enzymatycznym (patrz dalsza część tego podrozdziału) (Buckle i wsp., 1992). Obecnie wydaje się, że białka typu HTH można podzielić na dwie klasy pod względem wykorzystywania każdego z obu dostępnych im sposobów oddziaływania z DNA: pierwsza grupa, do której zaliczają się takie białka jak HNF3 i E2F4 wiążą się do dużego rowka poprzez zasadową helisę trzecią, zaś do drugiej grupy można zaliczyć pozostałe białka, w tym globulę H5 i hRFX1, kontaktujące się z DNA poprzez zasadową pętlę skrzydło S1 (Gajiwala i wsp., 2000).

Trawienie chromatyny nukleazą z Micrococcus powoduje uwolnienie formy przejściowej, zwanej chromatosomem, który składa się z odcinka DNA długości 168 par zasad nawiniętych na oktamer nukleosomowy i związanego z nim histonu H1 (Noll i Kornberg, 1977, Rys. 3).

Dalsze działanie nukleazą powoduje odłączenie histonu H1 i strawienie kolejnego odcinka DNA długości 20 par zasad, uwalniając cząstkę rdzeniową nukleosomu zawierającą DNA o długości 146 par zasad (Rys. 3). DNA położone poza nukleosomami nosi nazwę DNA łącznikowego.

Centralna domena globularna histonu H1 zdolna jest do ochrony odcinka DNA długości 20 par zasad również wtedy, gdy N- i C-końcowy ogony zostały usunięte. Obecnie istnieje kilka konkurencyjnych modeli  wiązania cząsteczki histonu łącznikowego do nukleosomu.

Pierwszy z nich (Allan i wsp., 1980) przyjmuje, że histon łącznikowy leży na osi symetrii nukleosomu, wiążąc się do DNA wchodzącego i schodzącego z nukleosomu, tym samym chroniąc go przed strawieniem symetrycznie po obu stronach (10 par zasad z każdej z nich). Badania neutronowych widm dyfrakcyjnych chromatosomów i wiązania globularnej części H1 do natywnych nukleosomów wskazują jednak, że takie wiązanie może nie być symetryczne. Mimo to histon może łączyć się z dwiema nićmi DNA (po ich stronie zewnętrznej) za pomocą dwu obecnych w nim miejsc wiązania, chociaż niesymetrycznie względem osi nukleosomu (Rys. 4b, Zhou i wsp., 1998). W pracach tych, zmierzających do ustalenia miejsca wiązania histonu H1 do nukleosomu, wykorzystano chromatosomy pozbawione histonów łącznikowych, trawione nukleazą z Micrococcus. Takie chromatosomy poddawano następnie rekonstytucji, używając domen globularnych H1 poddanych uprzednio specyficznym mutacjom punktowym, zamieniających reszty seryny na reszty cysteiny. Możliwe było związanie tych ostatnich do DNA, a następnie zmapowanie miejsc oddziaływań poprzez trawienie alkaliczne. Badanie to pozwoliło na ustalenie, że histon łącznikowy wiąże się w pobliżu osi symetrii nukleosomu przy pomocy drugiego miejsca wiązania, podczas gdy motyw wiązania DNA typu skrzydlatej helisy wchodzi w kontakt z dużym rowkiem pierwszego skrętu helisy DNA chromatosomu. W ten sposób N-końcowy odcinek histonu łącznikowego zbliża się do DNA łącznikowego, zaś ogon C-końcowy do nici DNA wchodzących i opuszczających cząstkę nukleosomu, dzięki czemu możliwe są jego oddziaływania z którąkolwiek z nich. Od modelu tego znacznie odbiega obraz wiązania się histonu H1 do nukleosomu zaproponowany przez Wolffego i współpracowników (Rys. 4a, Pruss i wsp., 1996). Model ten zakłada, że H1 również wiąże się do nukleosomu asymetrycznie, kontaktując się z nukleosomowym DNA blisko 65 70 par zasad od osi symetrii, jednak proponuje, że do wiązania dochodzi wewnątrz zwojów DNA, a nie po ich stronie zewnętrznej. Histon miałby kontaktować się tylko z jedną helisą, co więcej, do wiązania dochodziłoby w oddaleniu od osi. Model ów oparty jest na anlizie wiązania się foto- i radioaktywnych sond molekularnych specyficznych względem dużego rowka DNA, do wyznakowanego radioizotopowo i zrekonstruowanego na nukleosomie odcinka DNA genu 5S rRNA afrykańskiej żaby Xenopus borealis. W oparciu o dane uzyskane z mapowania miejsc wiązania otrzymanych struktur zaproponowano model wiązania histonu łącznikowego wewnątrz zwojów DNA po jednej stronie analizowanej sekwencji. W ten sposób C-końcowa część histonu H1 znajdowałaby się na skraju nukleosomowego DNA, gdzie mogłaby wchodzić w kontakt z łącznikowym DNA. Model ten nie wyjaśnia jednakże zdolności wiązania DNA przez cząsteczkę histonu H1 za pomocą drugiego, mniej ustrukturalizowanego motywu wiązania, chociaż proponuje, że motyw ten mógłby służyć do kontaktów z sąsiednimi cząsteczkami nukleosomowymi, ułatwiając kondensację włókien nukleosomowych. Obecnie przyjmuje się, że model ten nie jest zgodny z danymi doświadczalnymi, i powinien zostać odrzucony.

Badania zmian konformacji zależnych od stężenia soli za pomocą mikroskopu elektronowego pozwoliły na stwierdzenia, że histony łącznikowe pełnią ważną funkcję w wytwarzaniu i utrzymywaniu struktur chromatynowych wyższego rzędu (Finch i Klug, 1976). Za pierwszą z tych struktur uznano układ sześciu nukleosomów  przypadających na jeden skręt superhelisy i skręconych wzdłuż włókna o długości około 11 nm i grubości 30nm (struktura solenoidu, Rys. 5). Nowsze prace z użyciem promieniowania jonizującego zdolnego do wywoływania pęknięć w sąsiadujących ze sobą miejscach w DNA dowodzą, że sąsiadujące nukleosomy tworzą strukturę zygzakowatą, w której DNA łącznikowy przebiega właściwie w prostej linii, zaś DNA nukleosomowy ma ustaloną pozycję rotacyjną (Rydberg i wsp., 1998). Chromatyna jest zdolna do kondensacji nawet przy braku histonu H1, wraz z wzrostem stężenia soli, jednak struktura jej włókien jest  wówczas zaburzona. Również struktura włókien chromatynowych rozprostowanych przy niskiej sile jonowej zależna jest od obecności histonu H1: w chromatynie zawierającej histon H1 DNA wchodzi i opuszcza nukleosomy po tej samej stronie, dając charakterystyczny zygzakowaty obraz rozprostowanych włókien, podczas gdy w chromatynie pozbawionej histonu łącznikowego miejsca wejścia i zejścia DNA z nukleosomu są znacznie bardziej przypadkowe, dając strukturę koralików na nitce (Thoma i wsp., 1979).

Z nietypową budową histonu H1 mamy do czynienia u drożdży. Jak do tej pory nie wyizolowano z nich cząsteczek tego białka, co może świadczyć o tym, że do kondensacji jego chromatyny histon łącznikowy nie jest potrzebny. Mimo to,  poznanie pełnej sekwencji genomu Saccharomyces cerevisiae pozwoliło na ustalenie, że zawiera on otwartą ramkę odczytu kodującą przypuszczalny homolog histonu H1 (Hho1p), chociaż  homologia ogranicza się tu do środkowej globuli (Ushinsky i wsp., 1997; Landsman, 1996). Co dziwniejsze, białko to posiada dwie takie globulę o długości około 80 aminokwasów, przy czym jedna z nich niemal całkowicie zastępuje koniec karboksylowy obecny w kanonicznym histonie H1. Podjęto również próbę ustalenia biologicznej funkcji tego histonu u drożdży (patrz dalsza część Wstępu).

Ogony histonów i oddziaływania z innymi białkami

Wystające z cząsteczki rdzeniowej nukleosomu ogony histonów rdzeniowych nie są niezbędne do utrzymania jego integralności strukturalnej (Luger i wsp., 1997). Są jednakże konieczne do kondensacji chromatyny: oprócz opisanej już funkcji stabilizowania trójwymiarowego układu nukleosomów (Zlatanova i wsp., 1998), w którym uczestniczą ogony histonu łącznikowego H1 i histonu H3, do utworzenia umiarkowanie zwiniętej konformacji chromatyny niezbędne są ogony histonów H3 i H4 (Moore i Ausió, 1997), zaś do powstania - przy fizjologicznej sile jonowej - konformacji chromatyny ściśle zwiniętej wymagana jest obecność ogonów wszystkich histonów rdzeniowych. N-końcowe ogony histonów rdzeniowych uczestniczą w oddziaływaniach z innymi chromosomalnymi białkami histonowymi i niehistonowymi. I tak na przykład N-końcowa część histonu H4 (odcinek K16 N25) wiąże się do dimeru H2A H2B położonego na sąsiednim nukleosomie, i może być zaangażowana w ustalanie miejsca wiązania się nukleosomu do konkretnej sekwencji DNA, czyli w jego pozycjonowanie (Luger i wsp., 1997). Ogon drożdżowego histonu H4 pełni ważną rolę w wygaszaniu ekspresji genów w końcowych odcinkach chromosomów, czyli w tak zwanym silencingu telomerów (FischerAdams i Grunstein, 1995). Ogony histonów H3 i H4 mogą brać udział zarówno w regulacji konkretnych genów, jak i w procesie składania nukleosomu (patrz dalej). Co ciekawe, u drożdży usunięcie ogona końca aminowego histonu H3 albo H4 nie prowadzi do zmniejszenia żywotności, lecz usunięcie obu z nich prowadzi do śmierci komórek drożdżowych (Morgan i wsp., 1991; Ling i wsp., 1996).

Z N-końcami histonów H3 i H4 mogą również oddziaływać białka niehistonowe, co prowadzi do wytworzenia struktur chromatynowych ułatwiających lub utrudniających transkrypcję. I tak, do nukleosomów wiążą się białka HMG-14 i HMG-17 (ang. High Mobility Group), powodując rozluźnienie włókien chromatynowych wyższego rzędu i ułatwiając transkrypcję. Z rozplataniem struktur chromatyny związany jest koniec karboksylowy HMG-14, który łączy się z końcem aminowym histonu H3 (z jego resztami aminokwasowymi 20  50) (Trieschmann i wsp., 1998). Również inne białko z tej grupy, oczyszczone HMG-1, wiąże się ściśle do histonu H1 (Smerdon i Isenberg, 1976), chociaż wysunięto przypuszczenie, że wiązanie to może być wynikiem niespecyficznych oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy ujemnie naładowanym ogonem białka HMG-1 a ogonami H1 obdarzonymi dodatnim ładunkiem (Cary i wsp., 1979).

Wskazówką dla istnienia oddziaływań pomiędzy białkami HMG-1 i HMG-2 z H1, a być może również i ich konkurencji o wiązanie z łącznikowym DNA czy nawet nukleosomem, było wyizolowanie mononukleosomów zawierających HMG-1 lub HMG-2, lecz pozbawionych histonu H1 (Jackson i wsp., 1979). W doświadczeniach sprawdzających bezpośrednie współzawodnictwo HMG-1 i histonu H1 o wiązanie do poczwórnie rozgałęzionego DNA nie udało się zaobserwować kompleksów o strukturze trzeciorzędowej zawierających oba białka, co wskazuje, że zajmują one te same, lub pokrywające się miejsca na rozgałęzieniu, a być może również na nukleosomie (Varga-Weisz i wsp., 1994). Mimo to udało się ustalić, że sposób wiązania się białek z grupy HMG (takich jak HMG-I(Y) oraz HMG-1) i histonu H1 do struktur DNA tego typu jest różny, i że białka te wprowadzają nieco odmienne zmiany w tworzone przez siebie kompleksy z DNA (Hill i wsp., 1999). Różnica ta wynika przypuszczalnie z różnych ról pełnionych przez białka z obu grup w procesach molekularnych, takich jak rekombinacja genetyczna, zachodzących w chromatynie. Współzawodnictwo o miejsca wiązania do DNA białka HMG-I(Y) i histonu H1 wynika również z wykrytej niedawno obecności w tych białkach konserwowanych ewolucyjnie domen, takich jak motyw typu haka AT (ang. AT-hook) odpowiedzialnych za wiązanie do traktów bogatych w pary AT w DNA, oraz z obecności w aminowej części cząsteczki białka HMG-1(Y) motywu homologicznego do domeny globularnej histonu H1 (Krech i wsp., 1999).

U drożdży N-końcowe ogony histonów H3 i H4 wiążą się do reprymujących transkrypcję, działających in trans białek Sir2, Sir3, Sir4 i Rap1, prowadząc do powstania chromatynowych domen o zablokowanej transkrypcji (struktur heterochromatynowych) (Grunstein, 1998). N-końcowe odcinki drożdżowych histonów H3 i H4 wiążą się także do ogólnych represorów Ssn6/Tup1 (Edmondson i wsp., 1996). Do N-końcowego ogonu histonu H3 przyłączają się również represory transkrypcyjne Groucho z Drosophila i jego ssacze homologi oraz podobne do transducyny białka Enhancer of split (Palaparti i wsp., 1997).

Kowalencyjne modyfikacje histonów

Histony ulegają licznym modyfikacjom potranslacyjnym, takim jak acetylacja, fosforylacja, glikozylacja, ubikwitynacja i ADP-rybozylacja. Większość modyfikacji dotyczy aminokwasów w N-końcowych ogonach histonów (Rys. 6).

• Ubikwitynacja histonów

• Acetylacja histonów

• Metylacja histonów

• Fosforylacja histonów

Ubikwitynacja histonów

Odwracalnej ubikwitynacji podlegają histony H2A, H2B i H3. Modyfikacja ta polega na przyłączeniu do grupy ?-aminowej lizyny końca karboksylowego ubikwityny, silnie konserwowanego białka liczącego 76 aminokwasów. Najsilniej modyfikowanym histonem u wielokomórkowych organizmów eukariotycznych jest H2A (ok. 10% cząsteczek, w porównaniu z 1 2% w histonie H2B), przy czym często występuje modyfikacja wielokrotna. Jest ona związana z wysoką aktywnością transkrypcyjną. Wprowadzenie ubikwitynowanego histonu H2B do nukleosomu może zmieniać strukturę nukleosomu i wyższych poziomów organizacji chromatyny (Davie i Murphy, 1990).

Acetylacja histonów

Histony rdzeniowe ulegają odwracalnej acetylacji wybranych reszt lizynowych ogonów N-końcowych. W nukleosomie znajduje się w sumie 26 miejsc acetylacji (Spencer i Davie, 1999). Modyfikacja histonów rdzeniowych poprzez acetylację prowadzi do głębokich zmian na wszystkich szczeblach struktur chromatynowcyh. Zaburzeniu ulega zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu (Garcia-Ramirez i wsp., 1995), zwiększa się rozpuszczalność chromatyny przy fizjologicznej sile jonowej, stabilizowana jest rozwinięta struktura nukleosomu sprzyjająca transkrypcji (Walia i wsp., 1998). Przypuszcza się, że acetylacja ogonów histonów rdzeniowych utrudnia zwijanie ogonu N-końcowego, zaburzając tym samym powstawanie

struktur chromatynowych wyższego rzędu, a także odsłaniając nukleosomowe DNA oraz ułatwiając wiązanie i  działanie czynników transkrypcyjnych (Workman i Kingston, 1998). Ponadto acetylacja może wpływać na oddziaływania białek represyjnych kontaktujących się z ogonami N-końcowymi. Na przykład, skutkiem acetylacji są zaburzenia wiązania domeny końcowej z represorem Tup1 (Edmondson i wsp., 1996).

Enzymami katalizującymi odwracalną acetylację histonów są acetylotransferazy (HAT) i histonowe deacetylazy (HDAC). Badania ostatnich lat pozwoliły na ustalenie, że pierwsze z nich pełnią jednocześnie funkcję koaktywatorów transkrypcji, podczas gdy drugie są jej korepresorami. Tym samym udało się udowodnić związek modyfikacji kowalencyjnej białek chromosomowych (acetylacji histonów rdzeniowych) z ekspresją genów. Jedną z pierwszych odkrytych acetylotransferaz histonowych było białko p55 Tetrahymena, spokrewnione z drożdżowym białkiem Gcn5 (Brownell i wsp., 1996), znanym już uprzednio jako aktywator

transkrypcji. Możliwe okazało się zniesienie działania Gcn5  poprzez zaburzenie jego oddziaływania z białkiem Ada2, będącego składnikiem kompleksu adaptorowego, niezbędnego do zajścia transkrypcji (Candau i wsp., 1997). Ponadto udowodniono, że Gcn5 wchodzi w skład dużych kompleksów białkowych, zdolnych do acetylacji in vivo histonów: są to kompleksy Ada i SAGA (Grant i wsp., 1997). Pierwszy zawiera białka Ada3 i Ada2 i ma masę cząsteczkową równą 0,8 MDa, zaś drugi (Spt-Ada-Gcn5-acetylotransferaza) ma masę 1,8 MDa i zawiera białka Spt, czynniki związane z transkrypcją przez polimerazę RNA II (TAFII) i białko Tra-1, będące homologiem białka TRRAP (ludzkiego białka transformacyjnego związanego z domenami transkrypcyjnymi) (Grant i wsp., 1998). To ostatnie białko jest zaś związane z chorobą AT (ataxia

teleangiectasia). Inną acetylotransferazą histonów jest ludzkie białko PCAF. Jego domena C-końcowa przypomina drożdżowe GCN5; i również ono stanowi część dużego kompleksu zawierającego ponad 20 białek, w tym PAF400, białko o masie 400 kDa, będące ludzkim homologiem białka TRRAP (Vassilev i wsp., 1998). Białko to odgrywa rolę w modulacji aktywności czynnika p53 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA przez promieniowanie ultrafioletowe: PCAF acetyluje koniec karboksylowy białka p53, powodując jego wiązanie do specyficznych sekwencji w DNA (Liu i wsp., 1999). PCAF zdolny jest również do acetylacji niehistonowych białek HMG-17 i HMG-14 związanych z nukleosomami (Herrera i wsp., 1999), powodując ich zmniejszone powinowactwo do nukleosomu. Inną acetylotransferazą histonową jest koaktywator transkrypcyjny CBP/p300. Białko to jest w stanie acetylować wszystkie cztery histony wewnątrz nukleosomu, jak również liczne czynniki transkrypcyjne, takie jak p53 i GATA-1 (Liu i wsp., 1999). CBP jest ponadto składnikiem holoenzymu polimerazy II RNA (Davie i Chadee, 1998). Do pozostałych białek o niedawno odkrytych funkcjach acetylotransferaz histonowych należą m.in. Esa1 - składnik wielobiałkowego drożdżowego kompleksu NuA4 o masie 1,3 MDa, zdolnego do acetylacji histonów H2A i H4 wyizolowanego ostatnio również z Tetrahymena (Ohba i wsp., 1999). Aktywność acetylotransferazy histonowej wykazują także duże kompleksy związane z rearanżacją (przebudową) struktur chromatynowych, a nie zawierające białka Gcn5: Swi/Snf i Srb/Mediator, konieczny do właściwej regulacji transkrypcji przez polimerazę II RNA (Carlson, 1997, patrz dalszy ciąg Wstępu).

Acetylacja histonów odgrywa ważną rolę w procesie transkrypcji. Histonowe acetylotransferazy drożdży (SAGA, NuA4, NuA3 i Ada) i Tetrahymena (NuA4) ułatwiają transkrypcję z matryc nukleosomowych (patrz dalej), lecz nie z nagiego DNA. Co istotne, enzymy wykazują działanie jedynie w obecności acetylokoenzymu A, źródła reszt acetylowych (Ohba i wsp., 1999; Steger i wsp., 1998). Acetylazy histonowe aktywują transkrypcję poprzez wzmocnienie etapów inicjacji i elongancji. Za proces wzmocnienia tego typu może odpowiadać złożona wielobiałkowa cząsteczka, zwana enhancosomem (cząstką wzmacniającą transkrypcję). Na przykład enhancosom IFN? złożony jest z białek NF-?B, IRF1, ATP2/c-Jun i HMG-I(Y), białka które jest zasadniczym elementem strukturalnym chromosomów. Po uformowaniu, kompleks taki przyłącza aktywnie białko CBP (poprzez podjednostkę p65 białka NF?B), które następnie przeprowadza acetylację histonów H3 i H4 w sąsiadujących ze sobą nukleosomach. Prowadzi to do przebudowy struktury chromatyny, czego wynikiem jest przyciągnięcie holoenzymu polimerazy RHA II i uruchomienie ekspresji genu IFN? (Merika i wsp., 1998).

Niedawno stwierdzono, że histony łącznikowe H1 i H5 mogą pełnić w chromatynie funkcję specyficznego represora acetylacji rdzeniowego histonu H3 (Herrera i wsp., 2000). Blokowanie acetylacji dotyczy wyłącznie histonu H3 związanego w mono- lub oligosomach (kilku nukleosomach ułożonych wzdłuż nici DNA), nie zaś wolnych histonów. Za inhibicję tego typu odpowiedzialne są ogony histonu łącznikowego wprowadzające zawadę steryczną dla aktywności acetylotransferazy histonowej. Mimo to, kompleks transacetylazy zawierający czynnik PCAF jest w stanie przełamać blokadę spowodowaną przez ogony histonów łącznikowych.

W przeciwieństwie do acetylacji, deacetylacja histonów prowadzi do zablokowania (represji) struktur chromatynowych. Histony ssaków są deacetylowane przez duże kompleksy zawierające wiele białek, takie jak kompleksy mSin3A i NuRD (Knoepfer i Eisenman, 1999; Kouzarides, 1999; Ayer, 1999). Pierwszy z nich zawiera korepresory mSin3, N-CoR, SMRT, RbAp48, RbAp4 i c-Ski (Nomura i wsp., 1999). W skład drugiego kompleksu, zdolnego do przebudowy chromatyny, wchodzą N-CoR, MTA2, Mi2 i RbAP46/48 (Grozinger i wsp., 1999). Kompleksy deacetylaz wykazują również aktywność wobec innych niż histony białek chromosomowych, takich jak acetylowane białka HMG i czynniki transkrypcyjne. Podobna przebudowa struktury chromatyny może wiązać się z jednoczesną aktywacją ekspresji genów przez indukcję deacetylaz histonowych w określonym punkcie różnicowania komórek. Na przykład ekspresja mysich deacetylaz mHDA1 i mHDA2, homologicznych z drożdżową deacetylazą RPD3, jest ściśle powiązana ze stanem zróżnicowania komórek, podobnie jak ma to miejsce w przypadku jednego z wariantów rozwojowych histonu H1, H1
(patrz dalsza część Wstępu, Verdel i Khochbin, 1999).

Oprócz znaczenia w regulacji transkrypcyjnej, acetylacja i deacetylacja histonów pełni bardzo ważną rolę podczas rozwoju i różnicowania komórek. Białka p300 i PCAF stanowią ważny element procesu miogenezy (różnicowania komórek mięśniowych) (Puri i wsp., 1997), jak i szeregu innych szlaków rozwojowych, takich jak różnicowanie erytrocytów, limfocytów i melanocytów. Mutacje genów acetylaz wywołują poważne choroby genetyczne u ludzi, takie jak zespół Rubinsteina-Taybiego, objawiający się opóźnieniem umysłowym i charakterystycznymi deformacjami szkieletu (Giles i wsp., 1995). Znany jest także związek acetylaz i deacetylaz histonowych z innymi groźnymi stanami chorobowymi, w tym z procesami nowotworowymi (Archer i Hodin, 1999). Najsilniejszego na to dowodu dostarcza ostra białaczka mieloidalna (AML), w której odnajduje się przemieszczony gen CBP połączony albo do domniemanej acetylazy MOZ (Kamine i wsp., 1996) lub też do domniemanego regulatora homeotycznego białaczki mieszanego pochodzenia (MLL) (Sobulo i wsp., 1997). Z rakiem związane są także deacetylazy histonowe (HDAC). Na przykład mutacje w białku retinoblastoma (RB), będącym supresorem procesu nowotworzenia, które znoszą jego oddziaływania z  HDAC, prowadzą do rozwoju raka, tak jak dzieje się to również w przypadku zablokowania tego oddziaływania przez onkoproteiny wirusowe (np. białko E7 wirusa HPV) (Kouzarides, 1999).

Metylacja histonów

Metylacji podlegają histony rdzeniowe H2B, H3 i H4. Modyfikacja ta  związana jest z acetylacją (Hendzel i Davie, 1989), choć występowanie obu tych modyfikacji nie jest od siebie uzależnione. Metylacja histonów jest modyfikacją stosunkowo trwałą i podlegającą powolnym przemianom. Analiza nieodwracalnej metylacji i odwracalnej fosforylacji histonu H1 w cyklu komórkowym u śluzowca Physarum polycephalum pozwoliła na stwierdzenie, że metylacja zachodzi wcześniej niż fosforylacja (Jerzmanowski i Maleszewski, 1985). Istnieją przesłanki do przypuszczeń, że metylacja związana jest z aktywacją transkrypcyjną, a być może również z procesami nowotworowymi, przynajmniej w modelowej ludzkiej linii komórkowej HeLa (Annunziato i wsp., 1995).

Fosforylacja histonów

Fosforylacji ulegają zarówno histony rdzeniowe, jak i łącznikowe. W przypadku histonów łącznikowych H1 i histonu H3 grupa fosforanowa zostaje przyłączona do reszt serynowych i treoninowych  tych białek w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego (patrz dalej), przy czym jej najwyższy poziom przypada na fazę mitozy. W histonie H1 fosforylacji ulegają reszty Ser/Thr położone w obrębie ogonów N- i C-końcowych (Rys. 7), podczas gdy fosforylacja tych reszt w histonie H3 ogranicza się do ogona N-końcowego (van Holde, 1989).

Co więcej, fosforylacja histonu H3 ogranicza się wyłącznie do stadium mitozy i jest niezbędnym warunkiem prawidłowej kondensacji i segregacji chromosomów w metafazie (Wei i wsp., 1999). Dowodu na taką rolę odwracalnej fosforylacji histonu H3 dostarczyły badania na makronukleusie Tetrahymena, w których doświadczalna zamiana seryny-10, podlegającej modyfikacji, na alaninę, prowadzi do zaburzeń kondensacji chromosomów mitotycznych i mejotycznych. Inne prace, przeprowadzone z wykorzystaniem modelu komórek mysich (Cobb i wsp., 1999) wskazują jednak, że fosforylacja histonu H3 nie może być wyłącznym czynnikiem wywołującym kondensację chromosomów w metafazie.

Obecnie uważa się, że fosforylacja histonów, podobnie jak acetylacja, powoduje rozluźnienie struktury chromatyny: i tak na przykład w mysich fibroblastach poddanych stymulacji czynnikami wzrostowymi i estrami forbolu histon H3 podlega szybkiej fosforylacji jednocześnie z aktywacją transkrypcyjną genów wczesnej odpowiedzi c-fos i c-jun. Ustalono, że ufosforylowana forma histonu wiąże się z uaktywnionymi formami tych genów (Mahadevan i wsp., 1991; Chadee i wsp., 1999).

Związek fosforylacji histonu H1 z cyklem komórkowym i stanem struktury chromatyny był od wielu już lat przedmiotem intensywnych badań. Nasilona fosforylacja histonu H1 podczas mitozy skłoniła niektórych badaczy do postawienia tezy, że modyfikacja ta jest czynnikiem inicjującym proces kondensacji chromosomów (Bradbury i wsp., 1973), a tym samym impulsem wywołującym podziały mitotyczne (Bradbury i wsp., 1974). Wykorzystanie do badań zwierzęcych linii komórkowych poddających się procesowi synchronizacji pozwoliło na ustalenie, że liczba grup fosforanowych przyłączanych początkowo do reszt serynowych w C-końcowej, a następnie do reszt treoninowych w aminowej części histonu łącznikowego zmienia się wraz fazą cyklu w ten sposób, że osiąga maksimum podczas metafazy mitotycznej (Hohman i wsp., 1976): podczas gdy na cząsteczkę histonu H1 w interfazie przypadają 1 3 grupy fosforanowe, w czasie mitozy (począwszy od jej najwcześniejszego stadium profazy, aż do ostatniego telofazy) przypada ich już od 3 do 6, czemu odpowiada zmiana struktury (kondensacja) chromatyny widoczna pod mikroskopem elektronowym (Gurley i wsp., 1978). Ważną cechą modyfikacji histonu H1 przez fosforylację jest jej zróżnicowany zakres w stosunku do kolejnych wariantów sekwencyjnych (izotypów) histonów łącznikowych obecnych w danym rodzaju komórek lub organizmów. Na przykład ludzka linia komórkowe HeLa posiada dwie główne subfakcje histonów H1: H1A i H1B (Ajiro i wsp., 1981a). Występują one w podobnych ilościach, lecz ich poziom fosforylacji różni się znacznie w trakcie całego cyklu komórkowego, nie tylko zaś w trakcie mitozy. Fosforylacja histonu H1B jest niemal dwukrotnie mocniejsza niż wariantu H1A i zachodzi w części aminowej białka w trakcie całego cyklu komórkowego, podczas gdy w białku H1A region ten ulega

fosforylacji wyłącznie w czasie mitozy. Dokładniejsze badania tego zjawiska pozwoliły na ustalenie, że oba warianty histonu łącznikowego zajmują różne, nieprzypadkowe miejsca w chromatynie, i że różnią się także liczbą miejsc podatnych na fosforylację zależną od replikacji DNA (Ajiro i wsp., 1981b). Także sześć wariantów sekwencyjnych histonu H1 myszy podlega zróżnicowanej modyfikacji fosforylacyjnej w kolejnych fazach cyklu komórkowego. I tak, podczas gdy wariant H1b przyłącza w późnej fazie S trzy grupy fosforanowe, a w fazie M pięć, do histonu H1
przyłącza się ich w fazie S tylko jedna, a w fazie M - trzy (Talasz i wsp., 1996). Inne prace wykorzystujące przeciwciała specyficzne względem ufosforylowanych i zdefosforylowanych izoform H1 dowodzą, że odmienne fosfoformy histonu H1 zajmują odrębne domeny chromatynowe. I tak w makronukleusie Tetrahymena ufosforylowany histon H1 występuje na skraju ciałek chromatynowych i w otaczającej je euchromatynie, zaś histon H1 pozbawiony grup fosforanowych jest obecny w elektronowo gęstej heterochromatynie (Lu i wsp., 1995).

Głównym akceptorem grup fosforanowych w cząsteczkach histonu H1 pochodzących ze zwierzęcych komórek interfazowych jest ogon aminowy, w którym lokuje się blisko 60% wbudowywanych grup fosforanowych (Hohman, 1983). Z inną sytuacją mamy do czynienia w przypadku niższych eukariontów, takich jak śluzowiec Physarum polycephalum, w którego histonie H1 główne miejsca fosforylacji znajdują się we większej, C-końcowej części cząsteczki (Jerzmanowski i Maleszewski, 1985). Co więcej, fosforylacja histonów łącznikowych w niższych eukariontów wydaje się być znacznie bardziej intensywna i trwała histon H1 Physarum jest zdolny do przyjęcia podczas mitozy aż 20 grup fosforanowych, z których od ośmiu do szesnastu pozostaje przyłączone do cząsteczki H1 również w fazie G2.

Interesujący wydaje się być przypadek histonu H1 u Drosophila: stwierdzono, że istnieje związek pomiędzy bardzo obniżoną fosforylacją histonów H1 i H2A z chromatyny jej chromosomów politenicznych (w porównaniu z diploidalną chromatyną zarodkową), a znacznym spadkiem zawartości gęstej, nieaktywnej traskrypcyjnie heterochromatyny (Holmgren i wsp., 1985). Ponadto przedstawiono dowody, że fosforylacja histonu H1 Drosophila jest stała i niezależna od replikacji DNA, cyklu komórkowego, ani przejściowej stymulacji hormonalnej (Talmange i Blumenfeld, 1987). Dodatkowo, modyfikacja ta zachodzi w obrębie globularnego fragmentu cząsteczki, chociaż dochodzi do niej również w trzech innych miejscach położonych na końcu aminowym.

Dążąc do ustalenia związku fosforylacji histonu H1 i mitotycznej kondensacji chromosomów poddawano komórki bodźcom termicznym i działaniu inhibitorów enzymatycznych. Podniesienie temperatury hodowli komórek FM3A ponad dopuszczalną dla nich granicę zmniejsza fosforylację histonu H1 i wywołuje nienormalną kondensację chromatyny; również w komórkach tsBN2 poddanych działaniu niefizjologicznej temperatury dochodzi na hiperfosforylacji histonu H1 i do przedwczesnej kondensacji chromatyny (ang. premature chromatin condensation, PCC) (Matsumoto i wsp., 1980; Ajiro i wsp., 1983). Także defosforylacja

histonu H1 przy pomocy inhibitora topoizomerazy II, VM26 (Roberge, 1990), lub inhibitora kinazy białkowej, staurosporyny (Thng i wsp., 1994) prowadzi do dekondensacji chromatyny, co mogłoby wskazywać na rolę pełnioną przez H1 w wywołaniu tego procesu. Jednakże wiadomo, że doświadczenia z użyciem podobnych inhibitorów o szerokim spektrum działania obciążone jest potencjalnym niebezpieczeństwem wystąpienia efektów plejotropowych (Dou i wsp., 1999, patrz dalszy ciąg tego podrozdziału).

Głównym enzymem odpowiedzialnym za fosforylację białek jądrowych i wpływających na cykl komórkowy u eukariontów jest kinaza histonu H1 o masie 34 kDa (Woodford i Pardee, 1986), zidentyfikowana początkowo jako produkt genu cdc2+ Schizosaccharomyces pombe (Beach i wsp., 1982; Lohka, 1989). Kinaza cdc2 jest strukturalnym i funkcjonalnym homologiem czynnika wywołującego dojrzewanie (ang. maturation promoting factor, MPF), zdolnego do bezpośredniego wywołania mitozy w oocytach z pominięciem wymogu przejścia fazy syntezy białek komórkowych (Dunphy i wsp., 1988). Do tej pory udało się wykryć obecność homologów kinazy p34cdc2 we wszystkich badanych układach eukariotycznych, wliczając w to ludzkie linie komórkowe (Lee i Nurse., 1988; Lohka, 1989). Świadczy to o konserwowanym charakterze tej modyfikacji białek komórkowych. W wielu różnych typach komórek podlegającym podziałom, p34cdc2 ulega przejściowemu pobudzeniu w trakcie przejścia z fazy G2 cyklu komórkowego w stadium mitozy (Arion i wsp., 1988; Lamb i wsp., 1990). Poziom kinazy p34cdc2 pozostaje stały podczas cyklu komórkowego, lecz jego aktywność podlega wahaniom, wynikającym z oddziaływania MPF z cyklinami - grupą białek, które charakteryzuje synteza i degradacja zależna od fazy cyklu komórkowego (Evans i wsp., 1983; Solomon i wsp., 1988; Murray i wsp., 1989). Cykliny (a w szczególności cyklina B) wiążą się do p34cdc2 i są zdolne do jego pośredniej i bezpośredniej kontroli (Draetta i wsp., 1989; Evans i wsp., 1983; Murray i wsp., 1989; Freeman i Donoghue, 1991).

Zanim histon H1 może zostać zmodyfikowany przez kinazę p34cdc2 (MPF) konieczne jest jego częściowe odłączenie od chromatyny (Jerzmanowski i Cole, 1992). Za proces takiego odłączenia mogą w warunkach fizjologicznych odpowiadać inne białka jądrowe, takie jak HMG, nukloplazmina lub topoizomeraza II, uczestnicząca bezpośrednio w kondensacji chromosomów (Adachi i wsp., 1991; Roth i Allis, 1992).

Kinaza p34cdc2 rozpoznaje najczęściej w białkach sekwencję (S/T)-P-X-(R/K) (seryna lub treonina prolina - aminokwas polarny - (arginina-lizyna, lub inny aminokwas zasadowy), modyfikując ją podczas mitozy (Kennelly i Krebs, 1991). Stwierdzono, że modyfikacja taka zdolna jest do zmniejszenia powinowactwa do DNA peptydów zawierających motyw SPKK pochodzących z histonów H1 i H2B występujących u jeżowca Strongylocentrotus purpuratus specyficznie w jądrach, zaś ich defosforylacja to powinowactwo zwiększa. Tym samym, wiązanie zdefosforylowanych domen SPKK do DNA łącznikowego sprzyja ścisłemu pakowaniu chromatyny plemników  poprzez zbliżenie do siebie sąsiadujących nukleosomów (Green i wsp., 1993). Aktywność tej samej kinazy w procesie fosforylacji histonu H1 wykryto również w amitotycznych makronukleusach Tetrahymena (Roth i wsp., 1991), chociaż dzielą się one bez mitotycznej kondensacji chromosomów. Obserwacja ta podważyła związek pomiędzy fosforylacją histonu H1, a tworzeniem w trakcie podziałów komórkowych skondensowanej struktury chromatyny. Co więcej, ustalono, że również u jeżowca histon H1 obecny jest w silnie skondensowanej chromatynie plemników w postaci zdefosforylowanej (Green i Poccia, 1985).

Ostatnio Dou i współpracownicy (1999) przeprowadzili doświadczenie na Tetrahymena, polegające na wymianie w cząsteczce H1 wszystkich pięciu aminokwasów ulegających fosforylacji (seryn i treonin) na alaniny (otrzymując histon H1 niezdolny do podlegania fosforylacji) albo na reszty kwasu glutaminowego (co odpowiada trwale fosforylowanemu histonowi H1). Nie stwierdzono istotnych różnic w ogólnym fenotypie komórek Tetrahymena zawierających zmutowane cząsteczki histonu H1, chociaż druga mutacja wywierała efekt przypominający ten, jaki daje usunięcie histonu H1 w stosunku do aktywacji genu ngoA, oraz do represji innego genu, (którego funkcja nie jest znana) - CyP1. Z drugiej strony brak fosforylacji H1 w pierwszym mutancie powodował skrócenie czasu niezbędnego do pobudzenia ekspresji genu CyP1. Co więcej, ekspresja CyP1 w dzikich komórkach zachodzi wyłącznie po defosforylacji histonu H1. Taka obserwacja zestawiona z omówionymi poprzednio sprzecznymi danymi na temat związku fosforylacji histonu H1 ze strukturą chromatyny sugeruje, że fosforylacja H1 może być raczej specyficznym regulatorem ekspresji genów in vivo, zaś jej mechanizm może polegać na wydajnym odłączaniu histonu H1.

Składanie nukleosomów w chromatynie

W trakcie fazy S cyklu komórkowego powieleniu ulega nie tylko DNA, lecz również otaczające go struktury chromatynowe. Uważa się, że struktura chromatyny ulega przejściowemu zaburzeniu w miejscu przejścia widełek replikacyjnych, i że nowe nukleosomy odkładane są na powstających potomnych niciach DNA.

Powstawanie chromatyny podczas replikacji składa się z dwu odrębnych procesów (Rys. 8; Krude, 1995). W trakcie pierwszego z nich dochodzi do bezpośredniego przenoszenia histonów z nukleosomów wyjściowych na powielone DNA i do odtworzenia nukleosomów, bez szczególnej preferencji dla wiązania się do którejś z dwu nici DNA (Rys. 8a) (Bonne-Andrea i wsp., 1990; Krude i Knippers, 1991; Gruss i wsp., 1993). Wydaje się, że w proces ten jest biernie inicjowany przez widełki replikacyjne.  Drugi, odrębny proces polega na odkładaniu na potomnych niciach DNA nukleosomów z rozpuszczalnych białek histonowych, syntetyzowanych podczas fazy S (Rys. 8b) (Wu i Bonner, 1981). W procesie tym uczestniczą liczne czynniki składania chromatyny (ang. chromatin assembly factors, CAFs) (Ito i wsp., 1997a). W ciągu ostatnich lat poznano wiele białek zdolnych do odkładania histonów na nici DNA w warunkach in vitro, lecz większość z nich składa nukleosomy bez jednoczesnej replikacji DNA i nie wykorzystuje świeżo zsyntetyzowanych histonów.

Pierwszy czynnik składania chromatyny (CAF1), wyizolowany z komórek ludzkich, jest zbudowany z trzech podjednostek: p150, p60 i p50. Ma on zdolność organizowania nukleosomów specyficznie na nowopowstającym DNA podczas replikacji (Smith i Stillman, 1989). Początkowo na DNA odkładane są histony H3 i H4 występujące w postaci tetrameru. W ten sposób tworzy się zawiązek nukleosomu. W drugim etapie dołączane są dwa dimery histonów H2A-H2B, przy czym do tej reakcji nie jest już potrzebny ani CAF1, ani jednoczesna replikacja DNA (Smith i Stillman, 1991).

Czynnik CAF1 wykazuje ścisłą specyficzność substratową względem acetylowanych form histonów H3 i H4 (Smith i Stillman, 1991). I tak histon H4 zostaje przejściowo zmodyfikowany w cytoplazmie na kilku resztach lizynowych ogona aminowego, a następnie jest transportowany do jądra, gdzie ulega wbudowaniu w replikowaną chromatynę: stwierdzono, że w komórkach człowieka histon H4 związany z CAF1 jest mieszaniną czterech izoform niezmodyfikowanej, acetylowanej w jednym, w dwu i w trzech miejscach (w stosunku jak 33:33:33:1 - na lizynie 5, 8 i 12) (Verrault i wsp., 1996). Z podobną sytuacją spotykamy się w przypadku histonu H3, chociaż jego miejsca acetylacji nie są tak silnie konserwowane ewolucyjnie jak ma to miejsce w histonie H4 ((Sobel i wsp., 1995).

Czynnik CAF1 został wyizolowany również z Drosophila i z drożdzy (Kaufman i wsp., 1997; Adams i Kamakaka, 1999). Czynnik drożdżowy ma podobną budowę co CAF1 człowieka i składa się z trzech podjednostek: Cac1/Rlf2, Cac2 i Cac3/Msi1 (Kaufman i wsp., 1997). Co ciekawe, ich utrata nie jest daje fenotypu letalnego, i nie prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego drożdży w fazie G2, co dzieje się wówczas, gdy chromatyna nie zostanie całkowicie złożona (na przykład w wyniku niedoboru świeżo zsyntetyzowanych histonów) (Kim i wsp., 1988). Może to świadczyć o istnieniu innych, niezależnych szlaków składania chromatyny. Przypuszcza się, że mogłyby do nich należeć alternatywne szlaki, w których uczestniczy drożdżowe białko Spt6p lub białka N1/N2 Xenopus (Kleinschmidt i Franke, 1982). Mimo to, mutacja w genach kodujących podjednostki CAF-1 wiąże się ze specyficznym wzorem acetylacji w ogonach  aminowych histonów i prowadzi do powiększenia jądra komórkowego oraz do defektów w wygaszaniu (ang.

silencing) heterochromatynowym miejsc HML i HMR, związanych u drożdży z typem płciowym. Podobne zaburzenia w utrzymaniu wygaszonego transkrypcyjnie stanu chromatyny występują u tych mutantów w telomerach i związane są z niemożnością utrzymania represyjnej struktury chromatynowej, w wyniku niecałkowitego lub niewłaściwego złożenia nukleosomów (Enomoto i Berman, 1998). Fenotyp ten udaje się odwrócić poprzez wprowadzenie do komórki drożdży dodatkowych kopii genów SIR2, SIR3 lub SIR4, kodujących białka strukturalne obecne w wygaszonej transkrypcyjnie heterochromatynie (Enomoto i Berman, 1998). W związku z tym powstało przypuszczenie, że przy nieobecności CAF1 odłożone nukleosomy mogą zawierać niewłaściwie zmodyfikowane histony, co powoduje ich niestabilne wiązanie do białek Sir i prowadzi do defektów wygaszania.

Szlak składania chromatyny przez czynnik CAF1 jest wrażliwy na właściwy poziom i stechiometrię histonów. I tak, usunięcie genów HIR, które regulują biosyntezę histonów prowadzi do spadku ich poziomu i stechiometrii, lecz nie ma wpływu na wygaszanie genów (Kaufman i wsp., 1998). Mimo to, jednoczesne usunięcie tych genów i podjednostek CAF1 prowadzi do pogłębienia derepresji wygaszania miejsc HM i telomerów. Może być to dowodem, że stan wygaszenia powstały przy nieobecności CAF1 jest zależny od ilości białek histonowych. Dodatkowym potwierdzeniem tej hipotezy był wynik doświadczenia z nadprodukcją histonów H3 i H4 w mutancie CAF1, w którym wygaszenie telomerów uległo wzmocnieniu (Kaufman i wsp., 1998).

W odkładaniu histonów H2A/H2B na tetramerze histonów H3-H4 związanych z DNA uczestniczy białko opiekuńcze (ang. chaperone) o masie 56 kDa - Nap1 (białko składania nukleosomu, ang. nucleosome assembly protein-1) (Ito i wsp., 1996). Podczas mitozy tworzy ono kompleks z cykliną B i kinazą Gin4p i ma wpływ na działanie kompleksu kinazy Cdc28/cykliny B (Adams i Kamakaka, 1999). Samodzielnie działające białko Nap1 zdolne jest do odkładania oktamerów histonowych wyłącznie w sposób nieuporządkowany. Do ich właściwego rozmieszczenia niezbędna jest aktywność wyspecjalizowanych kompleksów wielobiałkowych zawierających ATPazę (patrz dalsza część Wstępu).

Po odłożeniu histonów rdzeniowych powstająca chromatyna podlega procesowi dojrzewania, w wyniku którego zajściu następuje regularne rozmieszczanie nukleosomów. Chromatyna taka charakteryzuje się odpornością na trawienie DNazą I, obecnością zdeacetylowanego histonu H4, a u wyższych eukariontów również obecnością histonu H1. Do utworzenia struktury regularnie rozmieszczonych nukleosomów zarówno in vitro jak i in vivo niezbędny jest ATP (Kamakaka i wsp, 1993). Adenozynotrifosforan wykorzystywany jest przez liczne czynniki białkowe zaangażowane w budowę struktur chromatynowych (patrz dalsza część Wstępu). Jednym z nich jest ACF (wykorzystujący ATP czynnik składania i przebudowy chromatyny, ang. ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor), wyizolowany z Drosophila (Ito i wsp., 1997b, patrz dalsza część Wstępu).

Nukleosomy jako regulatory transkrypcji

Kwestią o zasadniczym znaczeniu dla żywotnych procesów biochemicznych zachodzących z udziałem DNA, przede wszystkim transkrypcji, jest zdolność wiązania się czynników transkrypcyjnych do chromatyny, w odpowiedzi na zmiany stanu fizjologicznego komórki. Chromatyna ma różnoraki wpływ na proces transkrypcji, poczynając od nukleosomów uniemożliwiających wiązanie określonych transkrypcyjnych białek regulatorowych i czynników inicjacyjnych, a na przeszkodach dla elongacyjnego działania polimerazy II RNA kończąc (Workman i Buchman, 1993).

Komórki eukariotyczne mogą przyjąć co najmniej dwie strategie wobec nukleosomów blokujących transkrypcję genów: mogą je usunąć na trwałe (lub nie dopuścić do ich utworzenia), lub usuwać je pod wpływem określonego bodźca.

Usunięcie nukleosomów na stałe lub niedopuszczenie do ich utworzenia się jest związane z wytworzeniem w sąsiedztwie promotorów obszaru, trwale wolnego od nukleosomów. Takie obszary trwale pozbawione nukleosomów występują na promotorach genów transkrybowanych konstytutywnie. Mogą one powstać wskutek działania stale obecnych czynników, zadaniem których jest usuwanie nukleosomów (Rys. 9). W tym ostatnim przypadku, czynniki te muszą uzyskać kontakt z miejscami wiązania w momencie, gdy są one wolne od nukleosomów, na przykład bezpośrednio po replikacji DNA, a przed składaniem nukleosomów (patrz poprzednia część Wstępu). Z sytuacją tego typu spotykamy się w przypadku promotorów genów szoku

cieplnego (m. in. hsp70) Drosophila, wiążących czynnik GAGA, który jest niezbędny do zapewnienia dostępu zarówno do samego promotora, jak i poprzedzających (ang. upstream) elementów regulatorowych (Gilmour i wsp., 1989).

Strategia usuwania nukleosomów pod wpływem bodźca polega na takim bezpośrednim lub pośrednim działaniu czynników regulacyjnych, które usuwa nukleosomy związane zarówno z poprzedzającymi miejscami wiązania dla czynników białkowych, jak i z sekwencjami promotorów. Z takim niezależnym od replikacji DNA mechanizmem mamy do czynienia w przypadku drożdżowego promotora PHO5, obejmującego cztery nukleosomy o ustalonej pozycji (Schmid i wsp., 1992). PHO5 jest genem kodującym kwaśną fosfatazę, który ulega indukcji w nieobecności fosforanu w środowisku. W trakcie indukcji układ nukleosomów położonych na promotorze ulega zaburzeniu. W stanie zablokowanym jeden z nukleosomów (nuc-2) przykrywa dwa miejsca wiązania dla aktywatorów białkowych PHO2 i PHO4; inne miejsce wiązania położone jest na DNA leżącym pomiędzy pierwszym a kolejnym nukleosomem od strony 5 (nuc-3). Podczas aktywacji genu PHO5, białko PHO4 wiąże się do miejsca w łączniku i współdziałając z białkiem PHO2  usuwa sąsiadujący nukleosom (nuc-2), co powoduje odsłonięcie drugiego miejsca wiązania dla PHO4 (Almer i Hörz, 1986).  W procesie pobudzania transkrypcji związanej z genem PHO5 i przebudową represyjnej struktury nukleosomowej ważną rolę pełnią także ogony histonów rdzeniowych (patrz wcześniejsza część Wstępu). Na przykład w szczepach drożdży z zablokowaną syntezą histonu H4, lub z H4 pozbawionym ogonów, dochodzi do silnej indukcji genu PHO5 (Han i Grunstein, 1988). Podobnej aktywacji ulega również duża grupa innych genów, takich jak CUP1 i HIS3, co świadczy, że również one (lub ich promotory) podlegają represji nukleosomowej.

Z podobnym systemem usuwania nukleosomów pod wpływem zewnętrznego bodźca mamy do czynienia w przypadku promotorów mysiego wirusa guzów sutka (MMTV, ang. mouse mammary tumor virus) i promotora genu aminotransferazy tyrozynowej szczura. W skład obszarów organizowanych na tych promotorach przez nukleosomy wchodzą sekwencje odpowiedzi na glukokortykoidy. Pod wpływem stymulacji hormonalnej nukleosomy ulegają przebudowie (Carr i Richard-Foy, 1990); w trakcie tego procesu do specyficznie pozycjonowanej na promotorze cząstki rdzeniowej nukleosomu (Nuc-B) przyłącza się białko receptora glukokortykoidowego (GR).  Następnym etapem aktywacji jest związanie do nukleosomu jądrowego czynnika 1 (NF1), co powoduje usunięcie sześciu pozycjonowanych nukleosomów, utworzenie kompleksu preinicjacyjnego. I  rozpoczęcie transkrypcji (Archer i wsp., 1991; Lee i Archer, 1998).

Część genów wykorzystuje oba mechanizmy usuwania nukleosomów. I tak, w obszarze regulacyjnym genów GAL1/GAL10 drożdży Saccharomyces cerevisiae znajduje się obszar trwale wolny od nukleosomów. Z obszarem tym wiąże się konstytutywnie wyrażany czynnik białkowy GRF2, zajmując także miejsca wiązania indukowalnego białka GAL4 (Fedor i wsp., 1988; Taylor i wsp., 1991). W ten sposób obszar ten jest dostępny dla podstawowego aparatu transkrypcyjnego, chociaż sama sekwencja TATA promotorów genów GAL1 i GAL10 jest zablokowana przez nukleosomy. Dimeryczne białko GAL4 (lub jego pochodne) wiąże się w sposób kooperatywny do nukleosomów, powodując ich destabilizację i aktywację transkrypcji. A zatem, o ile w poprzedzającej sekwencji regulatorowej nukleosomy są trwale usunięte, to w przypadku centralnej części promotorów muszą one ulec wyparciu w odpowiedzi na bodziec.

 W utrzymaniu obszarów wolnych od nukleosomów uczestniczyć mogą również inne białka zdolne do specyficznego oddziaływania z sekwencjami promotorów lub wzmacniaczy transkrypcji (ang. enhancer). Tego typu czynniki mają zdolność do wiązania się do DNA i tworzenia kompleksów z innymi białkami lub do dimeryzacji ze sobą. Białkiem takim jest między innymi Sp1 (Saffer i wsp., 1991). I tak, na zrekonstruowanych minichromosomach małpiego wirusa 40 (SV40) dwie cząsteczki białka Sp1 uczestniczą w wytwarzanie obszarów wolnych od nukleosomów.

Nukleosomy mogą mieć również pozytywny wpływ na proces transkrypcji. Silnie spozycjonowany nukleosom związany z promotorem genu witellogeniny B1 Xenopus umożliwia takie nawinięcie DNA, które zbliża odległe miejsca wiązania dla receptorów estrogenu do bliskich sekwencji promotorowych (Schild i wsp., 1993). Powoduje to wytworzenie pętli, w której sekwencje te znajdują się blisko siebie, co wzmacnia aktywację transkrypcyjną z tego promotora.

Kwestią o kluczowym znaczeniu dla transkrypcji w kontekście chromatyny jest pytanie, w jaki sposób polimeraza RNA może przemieszczać się po matrycy zorganizowanej przez nukleosomy. Badania nad transkrypcją genów ?-globiny, nawiniętych na nukleosomy i transkrybowanych przez polimerazę II RNA  (Felsenfeld, 1992), pozwoliły na zaproponowanie kilku konkurencyjnych modeli rozwiązania tego problemu strukturalnego (Felsenfeld i wsp., 1996). W pierwszym z nich oktamer histonowy pozostaje na swoim miejscu, przypuszczalnie utrzymując się na nici DNA nie podlegającej transkrypcji. Drugi model zakłada, że oktamer ulega rozpadowi i rozprasza się w roztworze, zaś trzeci, że odsuwa się przed przemieszczającą się polimerazą. Wreszcie czwarty model przyjmuje, że oktamer odrywa się od nici DNA, a następnie ponownie się z nią wiąże. W celu zbadania tych możliwości Clark i Felsenfeld (1992) skonstruowali system badań in vitro, w którym połączyli pojedynczą cząstkę nukleosomową z plazmidem w ten sposób, że była ona umieszczona pomiędzy promotorem polimerazy Sp6, a sekwencją terminacji transkrypcji. Wykorzystując ten układ udało się wykazać, że poprawny jest wyłącznie ostatni model, przy czym udowodniono również, że transfer oktameru zachodzi wskutek kontaktu z sekwencją DNA położoną po drugiej stronie transkrybującej polimerazy (Studitsky i wsp., 1994; Studitsky i wsp., 1995; Rys. 10).

Najważniejszą cechą opisanego sposobu omijania nukleosomów przez transkrybującą polimerazę jest mechanizm transferu oktameru histonowego z pozycji przed polimerazą do pozycji za nią, w sposób dzięki któremu oktamer nigdy nie traci kontaktu z DNA (Rys. 10). Ustalono również, że tempo przemieszczania się polimerazy po nici DNA zorganizowanej przez nukleosom jest zmienne i nie zależy od sekwencji DNA, lecz od pozycji zajmowanej przez enzym na powierzchni oktameru histonowego: polimeraza zwalnia swój ruch w chwili, gdy znajdzie się około 20 par zasad w głębi nukleosomu (po przepisaniu 20 par zasad nawiniętego na rdzeń nukleosomu), a po

osiągnięciu pozornej osi symetrii DNA w nukleosomie jej ruch ustaje całkowicie. Przypuszcza się, że w tej właśnie chwili oktamer zostaje przeniesiony. Mimo to, wydaje się, że nukleosomy nie stanowią zawady sterycznej dla polimerazy, a obserwowane spowolnienie ruchu polimerazy wynika raczej z powstawania skręconych struktur przestrzennych, zmieniających tempo przemieszczania się enzymu (Studitsky i wsp., 1995; Felsenfeld, 1996). Warto jednak zastrzec, że w układach eukariotycznych przesuwanie się polimerazy uzależnione jest od istnienia innych mechanizmów wspomagających. Może do nich należeć m. in. acetylacja histonów (patrz wcześniejsza część Wstępu) lub udział  kompleksów destabilizujących strukturę oktameru (patrz część następna).

Wielobiałkowe maszyny komórkowe zaangażowane w przebudowę struktur chromatynowych

Chromatyna wywiera represyjny wpływ na proces transkrypcji. W ewolucji doszło do wykształcenia wyspecjalizowanych kompleksów białkowych, zdolnych do przebudowy struktur chromatynowych. Zawierają one zwykle wiele białek. Do tej pory poznane zostały u muchówek, drożdży i człowieka (Cairns, 1998; Tyler i Kadonaga, 1999; Pazin i Kadonaga, 1997).

U Drosophila poznano trzy takie kompleksy: czynnik przebudowy nukleosomów (NURF, ang. nucleosome remodeling factor) (Tsukiyama i Wu, 1996), kompleks dostępności do chromatyny (CHRAC, ang. chromatin accessibility complex) (Varga-Weisz i wsp., 1995), i ATP-zależny czynnik składania i przebudowy chromatyny (ACF, ang. ATP dependent chromatin assembly and remodeling factor) (Ito i wsp., 1997). Z kolei u drożdży poznano kompleks SWI/SNF (Cairns i wsp., 1994), jak i spokrewniony z nim kompleks remodelowania chromatyny RSC (ang. remodels the structure of chromatin) (Cairns i wsp., 1996). Wszystkie one zdolne są do przebudowy struktur chromatynowych, lecz sposób ich działania jest różny w warunkach in vitro, co sugeruje że in vivo pełnią one odmienne role w procesie składania chromatyny i regulacji transkrypcyjnej.

Badania regulacji transkrypcji u drożdży pozwoliły na odkrycie licznych genów związanych z niezdolnością do zmiany typu płciowego lub z niemożnością fermentacji sacharozy. Pierwsze z nich nazwano SWI (od ang. switch), drugie zaś SNF (od ang. sucrose non-fermenting) (Breeden i Nasmyth, 1987). Produkt jednego z genów pierwszej grupy, SWI2, okazał się identyczny z produktem genu z grupy drugiej i nosi odtąd nazwę SWI2/SNF2. Polipeptyd ten posiada siedem konserwowanych motywów białkowych obecnych w dużej grupie białek wiążących trifosforany nukleotydów. Do tej grupy białek zaliczają się również helikazy DNA i RNA. W dalszych pracach okazało się, że białko to współdziała z innymi partnerami (SWI1/ADR6, SWI3, SNF5 i SNF6) tworząc z nimi kompleks białkowy o masie bliskiej dwóm megadaltonom, niezbędny do właściwej kontroli transkrypcyjnej  (Peterson i Herskowitz, 1992; Cairns i wsp., 1994). Supresorami mutacji swi i snf są między innymi mutacje w genach biosyntezy histonów, co wskazuje, że białka SWI i SNF przeciwdziałają represji nukleosomowej (Winston i Carlson, 1992). Ponadto stwierdzono, że brak białka SWI2/SNF2 lub SWI5 powoduje obniżenie transkrypcji genu SUC2, oraz zmianę okolicy promotora tego genu, zaś oba efekty można odwrócić poprzez obniżenie poziomu histonów H2A i H2B (Hirschhorn i wsp., 1992). Istnieje również doniesienie wskazujące na obecność kompleksu SWI/SNF w bliskim otoczeniu holoenzymu polimerazy II RNA (Wilson i wsp., 1996), chociaż inne prace poddały ten wniosek w wątpliwość (Cairns i wsp., 1996).

Kompleks homologiczny do SWI/SNF wyizolowano również z komórek ludzkich (Wang i wsp., 1996), zaś u Drosophila odkryto pokrewny mu kompleks brahma (brm), zawierający homolog białka SNF2/SNF2  białko brm (Tamkun i wsp., 1992). Kompleks brahma zawiera co najmniej siedem podjednostek, w tym ATPazę. Białko to związane jest z regulacją genów homeotycznych, pełniących niezwykle ważne funkcje podczas różnicowania komórek i rozwoju. Podobne białka, BRG-1 lub konkurujące z nim białko BRM, występuje także u ssaków, łącząc się ze specyficznymi czynnikami BAF, takimi jak IN1, BAF170 i BAF155 (Wang i wsp., 1996; Travers, 1999). Włączenie ich do kompleksu BRG1 w znaczny sposób podnosi jego aktywność, szczególnie tę związaną ze zmianą topologii DNA. Niedawno przeprowadzono doświadczenie, w którym wytworzono linię transgenicznych myszy, całkowicie pozbawionych genu i białka BRM (Reyes i wsp., 1998). Stwierdzono, że homozygotyczne myszy BRM-/- rozwijały się normalnie, chociaż były cięższe o 15% od zwierząt kontrolnych z tego samego miotu. Ponadto, pochodzące z nich fibroblasty wykazywały niezdolność do zatrzymania się na granicy faz G0/G1 cyklu komórkowego. Wyniki te świadczą o udziale białka BRM w proliferacji komórek. Wskazuje również na to zdolność tworzenia przez białko BRG1 kompleksu z produktem genu supresora nowotworowego, Retinoblastoma (RB) (Dunaief i wsp., 1998). Oba białka znajdujące się w kompleksie współdziałają przy hamowaniu cyklu komórkowego. Białko brahma wchodzi ponadto w skład multimerycznych kompleksów trithorax, odkrytych po raz pierwszy u Drosophila melanogaster (patrz dalsza część Wstępu).

Homologi drożdżowych składników kompleksu SWI/SNF wykryto również u roślin (Brzeski i wsp., 1999). Białko BSH z Arabidopsis thaliana ma masę 27 kDa i wykazuje wysoką homologię do odpowiednika drożdżowego genu SWI5, jak i do homologa z Caenorhabditis elegans i homologicznego białka INI1 człowieka (patrz dalej). Co ciekawe, znaczne obniżenie fizjologicznego poziomu białka BSH nie zmniejsza żywotności roślin, lecz wywołuje charakterystyczne zmiany fenotypowe, objawiające się krzaczastym pokrojem i niezdolnością do wydawania nasion. Natomiast u Drosophila całkowity brak homologa genu SWI5 jest letalny (Dingwall i wsp., 1995).

Innym członkiem rodziny SWI/SNF jest ludzki kompleks hSWI/SNF. Zawiera on około 10 podjednostek, w tym hSNF5/INI1, który jest bona fide represorem nowotworowym, często nieobecnym w bardzo złośliwych dziecięcych nowotworach siatkówki (Versteege i wsp., 1998). Funkcje biochemiczne składników hSWI/SNF są podobne do jego drożdżowego odpowiednika (Pazin i Kadonaga, 1997). Istotną różnicę stanowią jednak ich wymagania względem czynników niezbędnych do aktywacji ATPazy: podczas gdy kompleksy zawierające białko ISWI ulegają pobudzeniu wyłącznie przez nukleosomy, do stymulacji białka hSWI2 zdolne są zarówno nukleosomy, jak i wolny DNA.

Do rodziny białek SWI/SNF należy także drożdżowy kompleks remodelujący chromatynę RSC (Cairns i wsp., 1996). RCS ma masę bliską 1 MDa i zawiera 15 podjednostek, w tym ATPazę STH1, niezbędną do funkcjonowania całego kompleksu i homologiczną do białka SWI/SNF2. Homologię do składników kompleksu SWI/SNF wykazują jeszcze dwa inne polipeptydy kompleksu: RSC6 i RSC8. Kompleks RSC jest zdolny, podobnie jak SWI/SNF, do wywołania zależnych od ATP zmian oddziaływań histonów z DNA w zrekonstytuowanych mononukleosomach.  Tym co różni kompleks RSC od SWI/SNF jest wpływ, jaki na wzrost komórek drożdżowych wywierają mutacje w składnikach kompleksu: podczas gdy składniki SWI/SNF kodowane są przez geny, których obecność nie jest konieczna do wzrostu Saccharomyces cerevisiae, trzy komponenty RCS (RSC6, STH1 i RSC8) są kodowane przez geny konieczne do wzrostu (Laurent i wsp., 1992). Co więcej, w przeciwieństwie do SWI/SNF RSC wykazuje zdolność do przenoszenia oktameru histonowego z rdzeniowej cząsteczki nukleosomowej na nagi DNA (Lorch i wsp., 1999). Nowo uformowany kompleks oktameru z DNA wykazuje wszystkie cechy nukleosomu i powstaje z udziałem ATP.

Kolejną rodziną czynników przebudowujących chromatynę jest grupa kompleksów Mi-2/CHD, znana również jako rodzina CHD.  Jak dotąd, zaliczono do niej dwa kompleksy: Mi-2 (wyizolowany z Xenopus) i NuRD (wyizolowany z komórek ludzkich). Zawierają one od 6 do 7 podjednostek, w tym niezbędną do funkcjonowania ATPazę Mi-2/CHD (Tyler i Kadonaga, 1999). Białka CHD zawierają oprócz motywu helikazy dwa motywy strukturalne noszące miano chromodomeny, odpowiedzialne za oddziaływania z innymi białkami, oraz motyw PHD (homeodomeny roślinnej) lub inny motyw odpowiedzialny za wiązanie DNA (Travers, 1999). Chromodomeny występują w wielu białkach związanych z chromatyną (w tym w białku heterochromatynowym 1 (HP1) Drosophila i w białkach z grupy Polycomb (patrz dalsza część Wstępu)). Interesującą obserwacją było ustalenie, że kompleks NuRD posiada dwie podjednostki (HDAC1 i HDAC2) o aktywności deacetylazy histonowej (Xue i wsp., 1998; Lemon i Freedman, 1999). Kompleks ten wchodzi ponadto w bezpośrednie lub pośrednie oddziaływania z metylowanym DNA (Tyler i Kadonaga, 1999).

Z zarodków Drosophila wyizolowano również trzy kompleksy remodelujące chromatynę i wykazujące aktywność ATPazy: NURF, CHRAC i ACF. Należą one, wraz z drożdżowymi kompleksami ISW1 i ISW2 do rodziny ISWI, gdyż wszystkie zawierają ATPazę ISWI (ang. imitation SWI2), homologiczną do białka SWI2 (Ito i wsp., 1997; Tsukiyama i Wu., 1995; Eisen i wsp., 1995). Homologia ta ogranicza się jednak tylko do motywu helikazy, gdyż białko ISWI nie posiada motywu obecnego w karboksylowym końcu SWI2/SNF2, a noszącego miano bromodomeny (Jeanmougin i wsp., 1997). Domena ta służy do zapewnienia oddziaływań pomiędzy białkami. I tak, bromodomena obecna w białku SWI2 (lecz nieobecna w ISWI) wiąże się selektywnie do aminowych ogonów histonów H3 i H4 (Ornaghi i wsp., 1999). Sugeruje się jednak, że białko ISWI może kontaktować się z ogonami histonów H2A i H2B (Travers, 1999). Jak do tej pory nie wykazano zdolności białka ISWI do remodelowania chromatyny. Natomiast jego aktywność ATPazowa stanowi napęd maszynerii remodelującej. Wykazano, że ludzkie homologii SWI2/SNF2 (zawierające ISWI), BRG1 lub hBRM ułatwiają dostęp do DNA zorganizowanego w nukleosom, w sposób zależny od ATP i porównywalny z tym uzyskiwanym za pomocą całych kompleksów (Phelan i wsp., 1999).

NURF zawiera 4 podjednostki i jest zdolny do rozbijania struktury nukleosomu podczas aktywacji transkrypcyjnej. Pierwszego przykładu takiej aktywacji dostarczył model wiązania się in vitro czynnika GAGA do układu nukleosomów zajmujących promotor genu szoku cieplnego hsp70 u Drosophila (Tsukiyama i wsp., 1994). Kompleks NURF wykazuje wysoką specyficzność wobec DNA zorganizowanego w strukturę nukleosomową, przy czym ważną rolę w rozpoznawaniu nukleosomu przez NURF pełnią aminowe ogony histonów (Georgel i wsp., 1998), Stwierdzono również, że rozpoznawanie ogonów histonów przez NURF nie jest związane z ich acetylacją.

NURF nie posiada jednak zdolności do pozycjonowania nukleosomów. Taką aktywność posiada natomiast inny kompleks z rodziny ISWI: ACF. Zawiera on cztery podjednostki, w tym ATPazę ISWI i oprócz pozycjonowania nukleosomów zdolny jest do pośredniczenia w składaniu, a także przebudowie chromatyny (Ito i wsp., 1997). Do złożenia funkcjonalnej chromatyny ACF potrzebuje wyłącznie ATP, DNA, histonów oraz histonowego białka opiekuńczego Nap1 (patrz wcześniejsza część Wstępu), chociaż do pozycjonowania już złożonych nukleosomów Nap1 nie jest potrzebny.

Wydaje się, że proces odkładania nukleosomów w funkcjonalne struktury chromatynowe zachodzi w dwu etapach: w pierwszym z nich działają histonowe białka opiekuńcze niezależne od ATP, zaś w drugim  kompleksy pozycjonujące zawierające ATPazę (Cairns, 1998).

Ważna rola w organizacji struktur chromatynowych przypada kompleksowi CHRAC. Zawiera on siedem podjednostek, wykazując nie tylko aktywność ATPazy, jak pozostałe kompleksy remodelujące Drosophila, lecz także topoizomerazy DNA II (Varga-Weisz i wsp., 1997; Varga-Weisz i wsp., 1995; Corona i wsp., 2000). W jego skład, oprócz ATPazy ISWI, topoizomerazy II i polipeptydu o masie 175 kDa, wchodzą dwa małe białka o masie 14 kDa i 16 kDa, noszące odpowiednio nazwy MARY i JOEY (Corona i wsp., 2000). Wykazują one uderzające podobieństwo do domen zwoju histonowego, przypominając czynniki transkrypcyjne ssaków NF-YB i NF-YC, a także odpowiednio histony H2B i H2A. Co ciekawe, obie podjednostki CHRAC podlegają ścisłej regulacji podczas rozwoju Drosophila  ich ekspresja jest najwyższa we wczesnym rozwoju zarodkowym, zaś dramatycznie obniża się w stadium poczwarki i formy dorosłej owada. Regulacja tego typu może świadczyć o roli, jaką kompleks CHRAC pełni w kontroli podziałów komórkowych, w bezpośrednim ułatwianiu replikacji DNA chromosomów, lub poprzez zmiany wyższego rzędu struktur chromatynowych w kondensacji chromatyny w chromosomy metafazowe i jej dalszej dekondensacji po zakończeniu podziałów (Alexiadis i wsp., 1998).

CHRAC nie jest zdolny do przebudowy struktury mononukleosomów (na wzór NURF i SWI/SNF), lecz jest w stanie przekształcać nieuporządkowane ich układy w pozycjonowane szeregi o minimalnej energii potencjalnej (Ito i wsp., 1997). Zdolność do przebudowy struktur nukleosomowych, jak i zdolność do porządkowania układu nukleosomów charakteryzuje także niedawno poznany ludzki kompleks remodelujący RSF (LeRoy i wsp., 1998; Kornberg i Lorch, 1999). Kompleks ten ma bardzo prostą budowę i składa się

z zaledwie dwu podjednostek: polipeptydu o masie 135 kDa o 75% homologii do białka ISWI Drosophila oraz z polipeptydu o masie 325 kDa o nieznanej dotychczas funkcji. Różne aktywności kolejnych remodelujących kompleksów wielobiałkowych przedstawia rysunek 11.

Wyspecjalizowane aktywujące i reprymujące kompleksy białkowe, potrzebne do podtrzymywania struktury chromatyny i wzoru ekspresji genów

Jedną z zasadniczych kwestii w regulacji rozwoju eukariontów jest utrzymanie wzoru ekspresji genów, który ustala się na wczesnych etapach różnicowania komórek. Po rozpoczęciu procesu różnicowania, komórki realizują ustalony plan rozwojowy, zapisany w genach organizowanych przez struktury chromatynowe. Mechanizmy potrzebne do utrzymania ustalonego wzoru ekspresji genów nazwano pamięcią komórkową i poznano najlepiej u Drosophila (Kennison, 1995; Hagstrom i Schedl, 1997), chociaż wykryto je również u innych eukariontów, w tym u roślin (Preuss, 1999).

U Drosophila tożsamość segmentów ciała zależy od utrzymania ograniczonych przestrzennie wzorów ekspresji genów  homeotycznych. Geny te zebrane są na chromosomach w dwa regiony: Antennapedia i bithorax (Kennison, 1995). Zaburzenia w ekspresji któregokolwiek z genów z tych kompleksów genowych prowadzi do charakterystycznych rozwojowych mutacji homeotycznych. W procesie podtrzymywania pamięci komórkowej uczestniczą białka z dwóch grup trithorax (trx-G) i Polycomb (Pc-G), składające się na ogromne kompleksy białkowe o masie 2 5 MDa (van Lohuizen, 1999). Pierwsze z nich pełnią w chromatynie funkcje aktywatorów transkrypcji, drugie zaś represorów. Przypuszczalny mechanizm działania kompleksów trx-G i Pc-G w chromatynie przedstawia rysunek 12.

Do białek z grupy Polycomb zaliczają się m. in. polycomb (Pc), polycomblike (Pcl), Extra sex combs (Esc) i Enhancer of zeste (E(z)). Utrata jakiegokolwiek z genów kodujących te białka nie zmienia wzoru ekspresji genów homeotycznych, lecz powoduje spadek ich represji na dalszych etapach embriogenezy, prowadząc do mutacji homeotycznych.

Nieduże białko Pc (390 aminokwasów, 44 kDa) w swoim końcu aminowym zawiera konserwowany motyw  chromodomeny (37 aminokwasów), obecny również w drożdżowym białku SWI6, oraz w białku HP1 Drosophila związanym z heterochromatyną i kodowanym przez gen Su(var)205 (Eissenberg i wsp., 1992). To ostatnie białko (patrz poprzednia część Wstępu), związane jest z tak zwanym efektem zmiany barwy w zależności od położenia (PEV, ang. position effect variegation), podczas którego wyciszeniu ulegają geny przemieszczone w pobliże struktur heterochromatynowych. Represja wywierana przez kompleksy białek Pc-G nie musi być jednak, w przeciwieństwie do PEV, związana z heterochromatynizacją.

Doświadczenia przeprowadzone w ostatnich latach wskazują, że u Drosophila i u myszy istnieją dwa funkcjonalne kompleksy białek tej grupy: pierwszy z nich potrzebny jest na wstępnym etapie procesu represji chromatynowej, zaś w jego w skład wchodzą białka Extra sex combs i Enhancer of zeste. Drugi kompleks zawiera m in. białka Polycomb, Posterior sex combs (Psc) i Polyhomeotic (Ph) (van Lohuizen, 1999), a jego znaczenie polega na podtrzymaniu rozpoczętej już represji, którą kompleks Pc-G wywiera w stosunku do konkretnych genów. Przypuszcza się, że w oddziaływaniu z DNA jednego z genów z grupy Polycomb, esc, uczestniczy kompleks Mi-2, w którego skład wchodzi również deacetylaza histonowa (patrz wcześniejsza część Wstępu; Kehle i wsp., 1998). Myszy pozbawione genów Pc-G, lub wyrażające nadmierną dawkę białka bmi-1 (homologa białka psc Drosophila), wykazują charakterystyczne defekty rozwojowe, takie jak zaburzenia szkieletu osiowego oraz zmieniony wzór proliferacji i żywotności komórek krwiotwórczych (Gould, 1997). Podobne efekty obserwowane są w trakcie utraty kontroli nad ekspresją genów homeotycznych u człowieka, co objawia się wrodzonymi defektami rozwoju szkieletu (wielopalczastość) i białaczkami (Look, 1997).

Poza wpływem na geny homeotyczne, białka z grupy Polycomb wiążą się do licznych innych miejsc na chromosomach. I tak, u myszy jednym z nich jest locus INK4a, kodujący inhibitory cyklu komórkowego p16 i p19Arf (Jacobs i wsp., 1999). Nadekspresja białka bmi-1 powoduje zmniejszenie produkcji tych inhibitorów. Związek tych białek ze sobą jest ważny o tyle, że zarówno p16, jak i p19Arf są regulatorami szlaków supresji nowotworowej białek Retinoblastoma (RB) i p53, które stanowią komórkowy mechanizm odliczający podziały komórkowe i chroniący komórki przed unieśmiertelnieniem (Sharpless i DePinho, 1999). Tym samym, kompleksy Pc-G są być może częścią komórkowego zegara odliczającego podziały komórek. Z najbardziej dramatycznym efektem  działania genów z grupy Polycomb mamy do czynienia u myszy pozbawionych genu M33, homologa genu Polycomb Drosophila: u homozygotycznych zwierząt dochodzi do zmiany płci z męskiej na żeńską (Katoh-Fukui i wsp., 1998). Może to przypuszczalnie świadczyć o wpływie represji Pc-G na szlak determinacji płci SRY .

Ostatnio białka z grupy Polycomb odkryto również u roślin (Preuss, 1999). U roślin wyższych, takich jak Arabidopsis, geny te mają wpływ na rozwój zarodka i bielma: mutacje w genach FIE (ang. Fertilization Independent Endosperm; bielmo niezależne od zapłodnienia; Ohad i wsp., 1996) lub FIS (ang. Fertilization Independent Seed, nasienie niezależne od zapłodnienia; Chaudhury i wsp., 1997) są zdolne do pobudzenia wytwarzania bielma, powstawania otoczki nasiennej, wydłużania nasienia, a nawet częściowego rozwoju zarodka bez wcześniejszego zapłodnienia. Takie efekty fenotypowe przypominają apomiksję, będącą formą rozrodu nie powiązanego z zapłodnieniem. Gen FIE wykazuje 40% homologii do genu extra sex combs (esc) z grupy Polycomb Drosophila i genu Embryonic ectoderm development (Eed) ssaków (Ohad i wsp., 1999). Gen FIS2 koduje białko zawierające motyw palca cynkowego i sygnał lokalizacji w jądrze komórkowym, co sugeruje, że może być zaangażowane w kontrolę transkrypcyjną (Luo i wsp., 1999). Innym genem Arabidopsis z grupy Polycomb jest MEDEA (Grossniklaus i wsp., 1998). Mutacje w tym genie powodują przeciwne zjawisko, niż w przypadku genów FIS i FIE: rozrost zarodka kosztem bielma, a następnie obumieranie zarodka w wyniku letalnych zaburzeń w jego rozwoju (Scott i wsp., 1998). MEDEA zawiera domenę SET wykazującą 55% homologii do innego białka z grupy Polycomb - enhancer of zeste (E(z)) Drosophila (Grossniklaus i wsp., 1998). Wszystkie mutacje w roślinnych genach Polycomb wywierają działanie jedynie wówczas, gdy mutację dostarcza haploidalna linia mateczna i dotyczą wyłącznie komórek generatywnych. (W roślinnych mutantach fie i medea nie dochodzi do zaburzeń wzrostu wegetatywnego). Do tej pory w roślinach zidentyfikowano około 10 genów z grupy Polycomb. Należy do nich także gen CURLY LEAF, niezbędny do regulacji genów homeotycznych zaangażowanych w proces kwitnienia (Goodrich i wsp., 1998). Jest wysoce prawdopodobne, że działanie roślinnych białek z grupy Polycomb związane jest z wygaszaniem ekspresji genów w podobny sposób, jak ma to miejsce u Drosophila (poprzez tworzenie represywnych transkrypcyjnie struktur chromatynowych), choć mogą one uczestniczyć również w kontroli równowagi rodzicielskiego składu genomowego, biorąc udział w procesie piętnowania genetycznego (ang. imprinting) (Scott i wsp., 1998).

Podczas gdy białka z grupy Polycomb pełnią w chromatynie funkcje represorów transkrypcyjnych, rola aktywatorów przypada tworzącym kompleksy białkom z grupy trithorax (Orlando i Paro, 1995; van Lohuizen, 1999).

Do białek tych, u Drosophila, należą m. in. polipeptydy kodowane przez gen trithorax: trxI, o masie cząsteczkowej 368 kDa i trxII, o masie 404 kDa. Oba białka zawierają centralny obszar bogaty w cysteiny, przypominający domenę palców cynkowych. Domeny te odnaleziono także w ludzkim białku ALL1 (MLL, HRX), zdolnym do tworzenia przeszło 30 różnych fuzji z innymi polipeptydami komórkowymi, i związanym z licznymi białaczkami (van Lohuizen, 1999). Białko trx wykryto w ponad 16 miejscach na politenicznych chromosomach Drosophila, do których wiążą się również białka z grupy Polycomb. Wiązanie się białek trx do chromosomów jest uzależnione od obecności innych składników kompleksu trx, oraz białek Pc-G. I tak, jeżeli w chromatynie zabraknie białka Enhancer of zeste, od swoich miejsc wiązania na chromosomachodłączają się białka trithorax i Posterior sex combs (należące do Pc-G) (Rastelli i wsp., 1993). Co ciekawe, zarówno w niektórych białkach z grupy trithorax (np. trx), jak i Polycomb (Pcl, E(z)) występują identyczne motywy białkowe, takie jak palce PHD, albo domena SET (Orlando i Paro, 1995). Sugeruje to, że te przeciwstawnie działające białka mogą wykorzystywać podobne mechanizmy molekularne, lub wiązać się do podobnych miejsc na chromosomach.

Do białek trx-G należy również brahma, zawierające bromodomenę i zależną od DNA ATPazę i helikazę (patrz poprzednia część Wstępu). Białko to jest homologiem drożdżowych polipeptydów SWI2/SNF2 i ssaczych białek brg1/brm1. Bromodomena została wykryta również w białku z grupy trx lin-49 Caenorhabditis elegans,  które jest zaangażowane (wspólnie z innym białkiem z tej grupy, lin-59) w regulację normalnego rozwoju męskich przydatków płciowych i odbytu, a także w utrzymywanie właściwej budowy pokładełka (struktury niezbędnej do składania jaj) (Chamberlin i Thomas, 2000).

Biologiczna rola histonu H1

Wprowadzenie

Już od dłuższego czasu obecność i funkcja histonu H1 w chromatynie eukariontów stanowi przedmiot kontrowersji i wątpliwości (Wolffe i wsp., 1997; Crane-Robinson, 1999). Z jednej strony istnieje wiele przesłanek świadczących o ważnej roli, jaką białko to pełni w organizmach żywych. Jednakże w ostatnich latach pojawiają się coraz liczniejsze doniesienia poddające w wątpliwość jego funkcję globalnego represora transkrypcji (Paranjape i wsp., 1994), lub też proponujące alternatywne modele uczestnictwa histonu łącznikowego w różnorodnych procesach życiowych. I tak, histon H1 jest ważnym elementem strukturalnym chromatyny, uczestnicząc w prawidłowym jej składaniu (patrz poprzednia część Wstępu), i występuje u wszystkich eukariontów, w tym u drożdży (Ushinsky i wsp., 1997; patrz poprzednia i następna część Wstępu), a nawet niektórych prokariontów (Kaul i wsp., 1996). Co więcej, podlega licznym modyfikacjom potranslacyjnym, takim np. jak fosforylacja (patrz poprzednia część Wstępu). W większości z dotychczas zbadanych układów  modyfikacje te są ściśle związane z cyklem komórkowym. Ocenia się także, że histon H1 jest niezbędnym czynnikiem strukturalnym procesu zwijania chromatyny w struktury wyższego rzędu, w którym oddziałuje z nukleosomami i DNA łącznikowym (Bednar i wsp., 1998; van Holde i Zlatanova, 1996). U ssaków opisano jego liczne warianty sekwencyjne (patrz dalsza część Wstępu), podlegające stopniowej i ściśle kontrolowanej wymianie podczas rozwoju. I tak, u myszy występuje co najmniej siedem wariantów histonu łącznikowego, w tym warianty somatyczne H1a H1e, wariant specyficzny dla jąder H1t i zastępczy histon łącznikowy (ang. replacement linker histone) H
(Lennox i Cohen, 1984; Franke i wsp., 1998). Z podobną różnorodnością wariantów histonu łącznikowego, i przypuszczalnie pełnionych przez nie ról, spotykamy się również u chruścika (owada dwuskrzydłego) Chironomus thummi (od trzech do czterech wariantów H1, Trieschmann i wsp., 1997), omułka jadalnego (małża) Mytilus edulis (pięć wariantów H1, Drabent i wsp., 1999), jak i w przypadku kurzej linii komórkowej DT40 (sześć wariantów H1, Takami i wsp., 2000; Takami i Nakayama, 1997). Liczne warianty sekwencyjne H1 występują także u roślin (patrz dalsza część Wstępu)

Z drugiej jednak strony, coraz więcej wskazuje na to, że rola histonu H1 może być znacznie bardziej złożona, i że może on działać raczej jako specyficzny regulator ekspresji genów, albo wręcz jako czynnik pozajądrowy, a może nawet pozakomórkowy (patrz dalej).

Histon H1 jako specyficzny regulator ekspresji genów

Oprócz roli elementu strukturalnego chromatyny, histon H1 może wywierać wpływ na ekspresję określonych genów. Ważna rola w tym procesie przypada nukleosomom o ustalonej pozycji (chociaż ostatnie doniesienia zdają się podważać rolę H1 w pozycjonowaniu nukleosomów, przynajmniej u orzęska Tetrahymena (Karrer i VanNuland, 1999)), a także modyfikacjom samego histonu H1. Ustalono na przykład, że fosforylacja histonu H1 jest niezbędna dla szybkiej aktywacji genów z długiego powtórzonego promotora mysiego wirusa guzów sutka (MMTV), przy czym reakcja zachodzi poprzez receptor glukokortykoidowy, w odpowiedzi na związanie hormonu (Lee i Archer, 1998; Thomas, 1999; patrz poprzednia część Wstępu). Przedłużająca się stymulacja hormonalna powoduje, że glukokortykoidy nie są już w stanie pobudzać promotora MMTV, a histon H1 ulega defosforylacji. Usunięcie hormonu odwraca ten efekt. Regulacja aktywacji przez fosforylację H1 wykazuje przy tym specyficzność genową. Mimo, że do defosforylacji H1 dochodzi na terenie całej chromatyny, nie zmienia się poziom transkrypcji innych genów, nawet tych pobudzanych przez glukokortykoidy (np. metalotioneiny). Co ciekawe, nadprodukcja histonowego wariantu H1 (H1
lub H1c) w ssaczej linii komórkowej BALB/c 3T3, zawierającej promotor MMTV, powoduje gwałtowny wzrost ekspresji z tego promotora, oraz opóźnia utratę aktywności promotora MMTV, związaną z przedłużającym się działaniem hormonu (Gunjan i Brown, 1999). Sugeruje się, że taki efekt może być związany z bezpośrednim wpływem histonu H1 na strukturę nukleosomową regionu promotora, a także, że w procesie tym może dochodzić do nasilenia acetylacji histonów rdzeniowych.

Innym, niezwykle dokładnie zbadanym układem, w którym histon H1 wywiera wpływ na ekspresję genów jest kontrola transkrypcji rodziny genów 5S rRNA afrykańskiej żaby szponiastej Xenopus laevis (Bouvet i wsp., 1994; Schlissel i Brown, 1984). Geny należące do tej rodziny dzielą się na dwie klasy: na oocytarne geny 5S, obecne w haploidalnym genomie w liczbie 20000 kopii, i ulegające transkrypcji podczas rozwoju komórki jajowej, lecz następnie stopniowo wygaszane w rozwoju zarodkowym po stadium środkowej blastuli (ang. mid-blastula transition, MBT), i nieaktywne w wszystkich komórkach somatycznych, oraz na somatyczne geny 5S, obecne w liczbie 400 kopii w genomie haploidalnym, i których transkrypcja rozpoczyna się w oocytach od stadium MBT, i trwa również w komórkach somatycznych. Obie sekwencje genowe są niemal dokładnie takie same, chociaż różnią się ich sekwencje otaczające: geny oocytarne otoczone są sekwencjami bogatymi w pary AT, zaś geny somatyczne w pary GC. Sekwencje otaczające geny 5S rRNA mają decydujące znaczenie dla różnicowego hamowania transkrypcji przez histon H1 (Jerzmanowski i Cole, 1990); ekspresja histonu H1 rozpoczyna się podczas stadium MBT, i to właśnie pojawienie się białka H1 w tej fazie i związanie do sekwencji AT-bogatych (nie zaś GC-bogatych) prowadzi do różnicowej ekspresji genów 5S rRNA. Udowodniono, że także sama domena globularna H1 jest w stanie wywołać przełączenie ekspresji

genów (Vermaak i wsp., 1998). Z drugiej strony, ustalono, że usunięcie somatycznego histonu H1 in vivo poprzez zastosowanie specyficznego rybozymu, prowadzi do utrzymania ekspresji oocytarnych genów 5S rRNA w fazach rozwoju zarodkowego, w których geny te ulegają normalnie wyłączeniu (Kandolf, 1994).

Oba rodzaje genów wykorzystują te same czynniki transkrypcyjne, a w szczególności TFIIIA, wiążący się do wewnętrznej sekwencji kontrolnej genów 5S RNA. Różna siła wiązania się histonu H1 do sekwencji bogatych w pary AT i GC powoduje, że oktamery nukleosomowe zajmują odmienne pozycje na genach oocytarnych i somatycznych, odsłaniając w różnym zakresie miejsca wiązania dla TFIIIA. Tym samym, oocytarne i somatyczne sekwencje genowe różnią się powinowactwem do TFIIIA i H1 (Howe i Ausió, 1998)  nukleosom położony na sekwencji oocytarnej ma wyższe powinowactwo do H1, niż do TFIIIA, którego miejsce wiązania położone jest wewnątrz nukleosomu, i tym samym ulega represji. Nukleosom zawierający somatyczny gen 5S wiąże TFIIIA, którego miejsce wiązania leży na skraju nukleosomu, i pozostaje aktywne transkrypcyjnie (Panetta i wsp., 1998). Udowodniono bowiem, że wiązanie histonu H1 nie blokuje transkrypcji z somatycznych nukleosomów X. laevis (Howe i wsp., 1998), chociaż w przypadku nukleosomów oocytarnych histon jest w stanie oddziaływać z bogatymi w pary AT sekwencjami otaczającymi, prowadząc wspólnie z samym genem oocytarnym do reorganizacji struktury chromatyny na długości co najmniej kilku nukleosomów, i do represji transkrypcyjnej (Tomaszewski i Jerzmanowski, 1997; Tomaszewski i wsp., 1998). W tym przypadku, wynikiem działania histonu H1 jest rozsuwanie i formowanie szeregów silnie spozycjonowanych nukleosomów, co może leżeć u postawy tworzenia chromatynowych struktur wyższego rzędu. Co więcej, represja transkrypcyjna, wywoływana przez histon H1 wiążący się do oocytarnego genu 5S RNA i jego sekwencji otaczających, dotyczy nie tylko genów transkrybowanych przez polimerazę III RNA (jak sam gen 5S rRNA), lecz także genów docelowych polimerazy II RNA.

Xenopus jest niezwykle interesującym układem umożliwiającym badanie wpływu histonu H1 również na inne geny niż 5S RNA, a tym samym również na inne programy rozwojowe. Przy wykorzystaniu wycinków zarodków ze stadium moruli udało się ustalić, że histon H1 jest odpowiedzialny za utratę przez tkanki zdolności do rozwoju w kierunku linii mięśniowej (kompetencji mezodermalnej) (Steinbach i wsp., 1997). H1 nagromadzający się podczas fazy MBT powoduje zmniejszenie (zarówno czasowe, jak i przestrzenne) transkrypcji genu czynnika determinacji miogenicznej MyoD, oraz genu brachyury (bra), wykazującego również specyficzność mezodermalną. Użycie rybozymu skierowanego przeciwko mRNA histonu H1A pozwoliło na udowodnienie, że działanie histonu łącznikowego nie polega w tym przypadku na ogólnej represji chromatyny, lecz na specyficznej kontroli określonych genów. I tak, nie należy do nich gen rozwojowy GS17, gen c-fos, ani gen histonu H4, zaś należą geny MyoD i bra. Przedwczesna ekspresja histonów łącznikowych prowadzi zatem do przedwczesnej utraty zdolności do różnicowania w linię mezodermalną, podczas gdy obniżenie poziomu H1 przez działanie rybozymu wydłuża okres kompetencji mezodermalnej.

Powyższe obserwacje potwierdzają znaczenie, jakie histon H1 ma dla właściwej regulacji rozwoju Xenopus laevis. Z drugiej jednak strony, istnieje doniesienie, że usunięcie jedynego wariantu H1 wykrywanego podczas wczesnego rozwoju tego zwierzęcia, B4, nie ma wpływu na składanie chromatyny i powstawanie dorosłych żab (Dasso i wsp., 1994). Równie intrygująca była obserwacja, że także w rozwoju zarodkowym Drosophila nie wykryto białek przypominających H1 (Ner i Travers, 1994).

W celu ustalenia roli pełnionej przez histony łącznikowe w regulacji transkrypcji i ekspresji genów, przeprowadzono w ostatnich latach serię doświadczeń polegających na manipulacji poziomem tych białek w różnych układach badawczych in vivo. I tak, przy zastosowaniu techniki homologicznej rekombinacji powiodła się próba usunięcia z genomu drożdży genu HHO1, kodującego histon H1 (Patterson i wsp., 1998; Escher i Schaffner, 1997). Szczep drożdży pozbawiony H1 był żywotny i nie wykazywał zaburzeń w wygaszaniu telomerów, ogólnej represji transkrypcyjnej, odległej aktywacji genów, ani w rozmieszczeniu nukleosomów, chociaż doszło w nim do 2  3-krotnego  podniesienia ekspresji niektórych genów (np. CYC1). Z podobnym obrazem fenotypowym mamy do czynienia zarówno w przypadku orzęska Tetrahymena, którego można było pozbawić histonu H1 w dużym jądrze (makronuklusie) bez wpływu na ogólny profil transkrypcyjny i żywotność komórek (Shen i wsp., 1995; Shen i Gorovsky, 1996), jak i u kropidlaka (grzyba z grupy workowców) Aspergillus nidulans, u którego usunięcie jedynej kopii genu histonu H1 nie prowadzi do jakichkolwiek zmian fenotypowych (Ramon i wsp., 2000). Trzeba jednak pamiętać, że zarówno histon H1 z drożdży, jak i z Tetrahymena wykazują się nietypową budową (patrz poprzednia część Wstępu); na przykład drożdżowy H1 zawiera dwie domeny globularne, z których pierwsza wykazuje zaledwie 36% homologię do globuli H1 człowieka, a druga 43% (Escher i Schaffner, 1997). Tego typu różnica budowy histonów łącznikowych umożliwiła przeprowadzenie heterologicznej nadekspresji wszystkich siedmiu ludzkich wariantów H1 w drożdżach, bez skutków ubocznych dla tych ostatnich (Albig i wsp., 1998). Z kolei u myszy, usunięcie jednego z siedmiu zasadniczych wariantów H1, histonu H1
, nie wywołało żadnych zaburzeń anatomicznych ani histologicznych w rozwoju (Sirotkin i wsp., 1995). Zwierzęta rozwijały i rozmnażały się normalnie, mimo że całkowicie nieobecne białko H1
nie ulegało zastępowaniu przez inny wariant H1 (Sirotkin i wsp., 1995). Również całkowite usunięcie poprzez rekombinację homologiczną innego wariantu histonu H1 u myszy, H1a (H1.1), nie zaburza ani wzrostu, ani spermatogenezy i płodności zwierząt (Rabini i wsp., 2000). U myszy 10 20 krotna nadprodukcja na poziomie mRNA ludzkiego histonu H1
nie prowadzi do jakichkolwiek zmian anatomicznych, histologicznych i rozwoju, chociaż temu wzrostowi nie towarzyszyła nadprodukcja obserwowana na poziomie białka (Tonjes i wsp., 1997). Z drugiej strony, nadprodukcja histonu H1
w mysich fibroblastach była jednak w stanie wywołać represję transkrypcyjną; co więcej, ustalono, że jest za nią odpowiedzialna środkowa, globularna część histonu H1 (Brown i wsp., 1997). Stwierdzono także, że do proliferacji kurzych komórek DT40 wystarczająca jest obecność tylko jednego z sześciu wariantów histonu łącznikowego (Takami i Nakayama, 1997), przy czym w liniach komórkowych, z których usunięto pięć spośród sześciu wariantów H1, nie zaobserwowano jakichkolwiek zmian w tempie wzrostu, ani w ogólnej strukturze chromatyny, chociaż stwierdzono rozległe zmiany w ekspresji genów. Podobny efekt wywołało w tej samej linii komórkowej również usunięcie jednego wariantu histonu łącznikowego, H1
, co potwierdziła dwukierunkowa elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym (2D-PAGE) (Seguchi i wsp., 1995). Potencjalnie interesującą obserwacją było ponadto stwierdzenie, że pozostawienie tylko jednego genu dla histonu H1 prowadzi do jednoczesnego podwojenia zawartości białek HMG w chromatynie (Takami i Nakayama, 1997). Nieco inne wnioski wypływają natomiast z doświadczeń, w których usunięto histon H1 u grzyba Ascobolus immersus: chociaż wygaszanie genów zależne od metylacji nie ulega zmianom i szczepy pozbawione H1 rozmnażają się i rosną normalnie, to struktura ich chromatyny ulega rozluźnieniu, zaś same kolonie w gwałtowny sposób ulegają zablokowaniu we wzroście po osiągnięciu dojrzałego wieku (Barra i wsp., 2000). Wskazuje to na udział H1 w regulacji specjalistycznych programów rozwojowych, co sugerują również inne dane (patrz dalej).

Badania nad biologiczną rolą histonu H1 przeprowadzono również u roślin. Rzodkiewnik pospolity Arabidopsis thaliana zawiera trzy geny kodujące zarówno dwa warianty histonu łącznikowego, o niemal identycznej masie cząsteczkowej (His1-1 i His1-2) (Gantt i Lenvik, 1991), jak i wariant His1-3 o mniejszej masie cząsteczkowej, występujący w znacznie mniejszej ilości niż dwa główne subtypy (Ascenzi i Gantt, 1997). Ostatnio ustalono, że roślinne geny histonów łącznikowych mogą podlegać ekspresji w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne: i tak, ekspresja histonu His1-3 Arabidopsis ulega indukcji pod wpływem przewlekłego stresu suszy, lecz nie pod wpływem nagłego odwodnienia, zimna, lub wysokiego stężenia soli (Ascenzi i Gantt, 1997). Co więcej, w roślinach nie narażonych na działanie stresu wariant His1-3 jest wyrażany niemal wyłącznie w nowopowstających korzeniach przybyszowych, natomiast w roślinach poddanych stresowi wodnemu głównym miejscem jego ekspresji jest merystem korzeniowy i strefa wydłużania korzenia. Natomiast w pędach, ekspresja H1-3 jest najwyższa w młodych tkankach (Ascenzi i Gantt, 1999a). Przy pomocy przeciwciał specyficznych względem wszystkich trzech wariantów H1 Arabidopsis ustalono także, że w przeciwieństwie do dwóch głównych wariantów histonu łącznikowego (His1-1 i His1-2) wariant indukowany stresem (His1-3) wiąże się do innych miejsc na chromosomach, kontaktując się głównie z sekwencjami nierepetetywnymi (Ascenzi i Gantt, 1999b), nawet w roślinach poddanych stresowi. U podłoża tego zjawiska leży być może regulacja hormonalna. Na przykład u pomidora (Lycopersicon esculentum) odkryto wariant H1, którego ekspresję regulują fitohormony gibereliny (van Heuvel i wsp., 1999). Również  ekspresja  wariantu His1-3 Arabidopsis jest zależna od zewnętrznego bodźca poziomu sacharozy (Ascenzi i Gantt, 1999a); podniesienie stężenia tego cukru w pożywce dla roślin z 1% do 3% powodowało podniesienie poziomu  ekspresji His1-3, podobnie jak ma to miejsce w przypadku genu patatyny, indukowanego sacharozą (Martin i wsp., 1997). Podobny związek indukcji ekspresji histonu łącznikowego zależnej od bodźca zewnętrznego nie został jak do tej pory wykryty u innych organizmów niż rośliny, co może wynikać z ich specyficznego trybu życia, związanego ściśle z miejscem osiedlenia się.  Z kolei u tytoniu występuje co najmniej sześć wariantów histonu H1, których poziom i stechiometria ma decydujące znaczenie dla ekspresji

genów rozwojowych, a w konsekwencji ważnych programów rozwojowych, takich jak kwitnienie (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Jednym z tytoniowych wariantów H1 jest H1-2, wyrażany we wszystkich tkankach rośliny, i wykazujący charakterystyczne oscylacje ekspresji w zależności od cyklu dobowego (Szekeres i wsp., 1995): poziom ekspresji podnosi się pod koniec fazy jasnej, i opada w trakcie fazy ciemnej. Ekspresja genu dla tego wariantu H1 ulega szybkiemu pobudzeniu również w kiełkujących nasionach.

U Arabidopsis, zarówno rośliny o drastycznie obniżonym poziomie wariantu His1-3 (poprzez technikę transformacji antysensownym transkryptem), ani rośliny nadeksprymujące ten wariant, nie wykazywały jakichkolwiek zaburzeń fenotypowych, jak i różnic w odpowiedzi na stres wodny (Ascenzi i Gantt, 1999a). Natomiast w  tytoniu, 2 - 3 krotne podniesienie poziomu histonów łącznikowych (połączone z obniżeniem poziomu określonych własnych wariantów H1) poprzez heterologiczną ekspresję histonu His1-2 z Arabidopsis prowadziło do zmian fenotypowych o różnym natężeniu, chociaż otrzymane rośliny były żywotne (Prymakowska-Bosak i wsp., 1996). Zmiany anatomiczne obejmowały karłowaty pokrój, zaburzenia kwitnienia i budowy kwiatów (częstym obrazem fenotypowym było wydłużenie słupka w stosunku do pręcików, czyli heterostylia) oraz zaburzenia owocowania, a także charakterystyczne zmiany morfologii komórek miękiszowych i ich jąder: chromatyna jądrowa obserwowana w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przybierała charakterystyczną ciemną barwę, odpowiadającą strukturze elektronowo gęstej (Ślusarczyk i wsp., 1999; Prymakowska-Bosak i wsp., 1997). Jednocześnie chromatyna otrzymana z komórek nadprodukujących histon H1 nie wykazywała zaburzeń w  rozmieszczeniu nukleosomów.

Dosyć podobny, chociaż jeszcze głębszy i bardziej złożony obraz fenotypowy wywołało doświadczalne zmniejszenie poziomu głównych wariantów histonów łącznikowych u tytoniu, połączone z wzrostem poziomu mniejszych wariantów histonu H1 (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Rośliny, w których przy pomocy techniki transformacji antysensownym cDNA zmniejszono poziom głównych wariantów somatycznych histonu H1, H1A i H1B, wytwarzały nadmiar mniejszych wariantów, H1C F, z których dwa, H1C i H1D, wykazywały wysoką homologię do wariantu His1-3 Arabidopsis indukowanego stresem suszy (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999), zaś dwa pozostałe, H1E i H1F, znacznie mniejsze niż typowe roślinne histony łącznikowe, takiej homologii nie wykazywały. Rośliny były żywotne i nie wykazywały zaburzeń mitozy ani rozmieszczenia nukleosomów, chociaż dochodziło w nich do rozluźnienia struktury chromatyny i zaburzeń w męskiej linii rozwojowej podczas mejozy, czego objawem była niezdolność do wytwarzania płodnych ziaren pyłku, kwiatów i nasion, oraz owoców. Dodatkowo, zaburzeniu ulegał profil transkrypcyjny niektórych genów związanych z kwitnieniem, takich jak Nap3 (homolog genu homeotycznego APETALA3 (AP3) Arabidopsis) i Ta29 (kodującego białko bogate w glicynę, specyficzne dla tapetum woreczka pyłkowego), przy czym zmiany nie dotyczyły miejsca ekspresji, ale jej czasu. Brak histonu H1 nie miał natomiast wpływu na profil ekspresji (zarówno przestrzenny, jak i czasowy) innego genu, Ta25, kodującego aktynę specyficzną dla pyłku, ani konstytutywnie wyrażanych genów Pbf46 i Ubp1 (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Inne zaburzenia w tych roślinach związane były z deformacją nasion pyłku, które wykazywały zaburzenia cytokinezy i podziałów mejotycznych, a także nie były zdolne do przebycia następującego po mejozie pierwszego podziału mitotycznego, przez co były pozbawione komórki generatywnej i wegetatywnej, pozostając w stanie niezróżnicowanym.

Badania nad rolą histonu H1 przeprowadzone przy wykorzystaniu tytoniu jako modelowego organizmu potwierdzają przypuszczenie, że białko to może uczestniczyć w specyficznej regulacji ekspresji określonych genów, nie jest zaś ogólnym represorem transkrypcji. Jednak w tym miejscu rola histonu łącznikowego się nie kończy. Przez ostatnie lata nagromadziło się wiele doniesień wskazujących na inne, mniej typowe, funkcje histonów łącznikowych, w tym te pełnione przezeń w cytoplazmie, jak i poza nią.

Histon H1 w cytoplazmie

Już stosunkowo wczesne prace pokazały, że w cytoplazmie komórek ssaków występuje duża ilość histonu H1 (Zlatanova i wsp., 1980). Także nowsze badania dowodzą, że w komórkach ssaków histon H1 występuje zarówno na terenie jądra komórkowego, gdzie wiąże się z chromatyną, jak i w cytoplazmie, gdzie może pełnić inne funkcje (Bleher i Martin, 1999). W ludzkich komórkach HeLa histon H1 występuje w dwu zasadniczych formach, różniących się stopniem fosforylacji (patrz poprzednia część Wstępu). Przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec globularnej, zasadniczo nieufosforylowanej domeny histonu H1, oraz przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko hiperfosforylowanym cząsteczkom H1 ustalono, że w cytoplazmie komórek HeLa obecne są liczne miejsca reagujące z przeciwciałami poliklonalnymi, co można było wykryć przy pomocy metod immunocytochemicznych. Jako że do fosforylacji histonu łącznikowego dochodzi na terenie jądra komórkowego (Oliver i wsp., 1974), otrzymany wynik wskazuje na przemieszczanie się histonu H1 z cytoplazmy (gdzie zostaje wytworzony) do jądra (gdzie ulega fosforylacji), a następnie ponownie do cytoplazmy. Wtórny transport silnie ufosforylowanych cząsteczek histonu łącznikowego z chromatyny jądrowej do cytoplazmy rozpoczyna się już podczas wczesnej fazy S cyklu komórkowego, aby osiągnąć maksimum podczas mitozy. Pod koniec fazy syntezy, liczba ufosforylowanych cząsteczek histonu H1 jest wyższa w cytoplazmie, niż w jądrach komórkowych. W końcowej fazie mitozy, telofazie, dochodzi za to do gwałtownego spadku zawartości histonów H1, zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie. Warto jednak zwrócić uwagę na dużą różnicę intensywności sygnałów immunocytochemicznych pomiędzy jądrowym (nieufosforylowanym) a cytoplazmatycznym (ufosforylowanym) histonem H1, świadczącą o tym, że w cytoplazmie histon łącznikowy osiąga przeszło 10-krotnie niższe stężenie, niż w jądrze (Bleher i Martin, 1999). Jaką funkcję może pełnić histon H1 na terenie cytoplazmy? Dane na ten temat nie są w żadnym razie pełne, lecz istnieje kilka niezwykle interesujących doniesień, wskazujących na potencjalne obszary działania histonów łącznikowych na terenie tego kompartmentu komórkowego. I tak, badania nad stabilnością mikrotubul wchodzących w skład wici i rzęsek jeżowców i pierwotniaków pokazały, że histon H1 może być czynnikiem stabilizującym mikrotubule in vivo (Multigner i wsp., 1992). Przy pomocy mikroskopii elektronowej i znakowania specyficznymi przeciwciałami pokrytymi złotem udowodniono, że histon H1 jeżowca Paracentrotus lividus (a także gatunków  Lytechinus pictus i Arbacia lixula) jest w stanie chronić istniejące już mikrotubule witek plemników tych zwierząt przed rozkładem spowodowanym przez niską temperaturę, chociaż badania in vitro pokazały, że nie pobudza procesu składania tubuliny w funkcjonalne mikrotubule (przeczą temu inne badania in vitro, w których wykazano, że histon H1 jest zdolny również do inicjacji procesu składania tubuliny zarówno w zwykłe mikrotubule, jak i dwuścienne  makrotubule (Bohm i wsp., 1990; Unger i wsp., 1988). Dalsze prace pozwoliły na ustalenie, że histon H1 wykazuje podobną funkcję stabilizowania mikrotubul także u organizmów innych niż jeżowce, takich jak słabo spokrewnione ze sobą orzęski Paramecium tetraurelia i Euplotes aediculatus, a także zielenica Chlamydomonas rheinhardii, przy czym w tym przypadku ochronie podlegały mikrotubule odpowiednio z rzęsek i wici. We wszystkich zbadanych układach wykorzystano metodę lokalizacji immunofluorescencyjnej, potwierdzając rolę histonu H1, a także wskazując, że mechanizm stabilizacji mikrotubul zależy od wiązania się pozajądrowego histonu H1 na całej długości wici. Jednocześnie potwierdzono w ten sposób podwójną lokalizację histonu H1 w jądrze, jak i poza nim, chociaż nie ma pewności, czy histon H1 wiążący się do wici nie ulegał specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym. Co ciekawe, same mikrotubule przypominają pod wieloma względami histony (Strahl i Allis, 1999). Tak jak one, są heterodimerami złożonymi z powtarzalnych podjednostek (
- i
-tubuliny), i tak jak one podlegają licznym modyfikacjom posttranslacyjnym, takim jak fosforylacja i acetylacja (Luduena, 1998; Luduena, i wsp., 1992). Ponadto ich koniec karboksylowy oddziałuje z białkami towarzyszącymi (ang. microtubule-associated proteins, MAP). Wysunięto nawet przypuszczenie, że w wyniku ewolucji mikrotubule i DNA przejęły dla własnej regulacji funkcjonalnej te same elementy strukturalne (Multigner i wsp., 1992). Być może jednym z nich jest histon H1.

Wykazano również, że występujący w cytoplazmie histon H1 może być specyficznym regulatorem enzymów zależnych od kalmoduliny (CaM), takich jak kinaza białkowa CAMKII i fosfataza białkowa kalcyneuryna (Rassmusen i Garen, 1993). Ustalono, że histon H1 jest w stanie blokować nie tylko aktywność CaMKII i zależną od CaM stymulację kalcyneuryny, ale także zależną od kalmoduliny autofosforylację CaMKII, przy czym do obserwowanych efektów dochodziło wyłącznie wtedy, gdy histon łącznikowy pozostawał nie związany z DNA. Jego dodanie przywracało aktywność enzymów.

W końcu, w bazie danych GenBank opisano ostatnio białko sedymentujące wraz z rybosomami, zdolne do oddziaływania z cytoszkieletem komórkowym, którego sekwencja odpowiada typowemu histonowi łącznikowemu. W bazie GenBank białko to nosi numer AB021872.

Histon H1 poza komórką

W ciągu kilkunastu ostatnich lat doszło do publikacji wielu prac wskazujących na bardzo nietypowe funkcje histonu H1, w tym te jakie histon łącznikowy miałby pełnić nie tylko poza jądrem, ale wręcz poza cytoplazmą i błoną komórkową, a zatem poza komórką. Prace te wskazują, że H1 może być obecny także w płynach ustrojowych, takich jak surowica krwi i mleko (Waga i wsp., 1986), chociaż nie wiadomo, czy miałby pochodzić z martwych komórek uwalniających materiał jądrowy, czy też raczej być wynikiem aktywnej sekrecji.

Co więcej, wykazano, że histony rdzeniowe, a także histon łącznikowy występują na powierzchni aktywowanych ludzkich limfocytów, erytrocytów, monocytów i płytek krwi (trombocytów), a także wiążą się do hodowanych w kulturze in vitro limfocytów T i B (Kubota i wsp., 1989/1990; Holers i Kotzin, 1985; Watson i wsp., 1995; Emlen i wsp, 1992). Obecność histonów na powierzchni tych komórek jest często przyczyną groźnych chorób autoimmunologicznych związanych z pojawieniem się w krwi obwodowej przeciwciał skierowanych przeciwko histonom. Należą do nich między innymi toczeń rumieniowaty (ang. systemic lupus erythromatosus, SLE) i immunologiczne zapalenie kłębuszków nerkowych (ang. immune glomerulonephritis). Histon H1 może ponadto uczestniczyć w reakcjach zapalnych związanych ze stanami autoimmunologicznymi dzięki swej zdolności łączenia się z bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS), odpowiedzialnym za proces zapalny w zainfekowanych tkankach (Bolton i Perry, 1997).

Stwierdzono także, że histon H1 występuje po zewnętrznej stronie błony komórkowej makrofagów wątrobowych (komórek Kupffera), gdzie służy jako receptor tyreoglobuliny, głównego sekrecyjnego białka tarczycy (Brix i wsp., 1998). Ustalono, że związany z makrofagami histon H1 może również pośredniczyć w endocytozie tyreoglobuliny do wnętrza makrofagów.

Ponadto odkryto, że u myszy histon H1 wykazuje zdolność zapewniania ochrony przed doświadczalnie wywołaną skórną lejszmaniozą (infekcją pasożytem skórnym Leischmania major): dożylne podanie zwierzętom histonu wyizolowanego z pasożytów, jak i zrekombinowanego białka wytworzonego w bakterii Escherichia coli lub syntetycznych peptydów o różnej długości, zmniejszało znacznie rozmiary nacieków wywołanych przez pasożyty (Solioz i wsp., 1999).

W końcu, zaskoczeniem było odkrycie, że histon H1 może wykazywać działanie antynowotworowe, zarówno w przypadku komórek hodowanych in vitro, jak i w mysim modelu zwierzęcym. Stwierdzono, że podanie oczyszczonego histonu H1 hamuje wzrost komórek białaczkowych, niezależnie od ich pochodzenia, stadium rozwoju i dojrzałości (Class i wsp., 1996). Podczas gdy histon łącznikowy nie miał wpływu na normalne, zdrowe komórki krwi i szpiku kostnego, wykazywał działanie cytotoksyczne wobec komórek białaczki Burkitta, działając również w nagich myszach (pozbawionych komórek układu odpornościowego), którym przeszczepiono komórki nowotworowe. Co ciekawe, badania przy pomocy mikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej pozwoliły na stwierdzenie, że cytotoksyczne i antynowotworowe działanie H1 polega na zdolności do poważnego naruszania integralności błony komórkowej i wywoływania tym samym cytolizy i śmierci komórek.

Podsumowując, należy stwierdzić, że o ile rola histonu H1 jako elementu strukturalnego chromatyny w przebiegu i regulacji procesów komórkowych jest wciąż niejasna, to funkcja tego białka ma wiele niezwykle interesujących cech.

---