Politechnika Łódzka

Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie 8

Oksydoreduktazy

Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia

Semestr: IV

Grupa dziekańska: III

Dzień tygodnia: Czwartek 8³⁰

Data wykonania ćwiczenia: 19.05.11r.

Szczepaniak Dominik, nr 20

Szewczuk Michał, nr 21

Zabłocki Miłosz, nr 25

Poprawa I

Data oddania: 13.06.11r.

WSTĘP TEORETYCZNY

Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące procesy utleniania oraz redukcji substratu. Ich działanie polega na przenoszeniu elektronów i protonów z donora na akceptor, co prowadzi do zmiany stopnia utlenienia zarówno jednego, jak i drugiego związku.

Oksydoreduktazy dzieli się na 5 grup:

- dehydrogenazy

Katalizują one bezpośrednie odwodorowanie substratu. Ich rolą jest także przenoszenie elektronów i protonów z substratu na koenzym

- reduktazy

Te enzymy katalizują przenoszenie protonów i elektronów, ewentualnie samych elektronów, pomiędzy przenośnikami

- oksygenazy

Katalizują przyłączenie tlenu do związku organicznego

Dzielą się na

• Oksygenazy właściwe zwane dioksygenazami. Ich zadaniem jest kataliza procesu polegającego na wbudowaniu do cząsteczki substratu, całej cząsteczki tlenu

• Oksygenazy mieszane zwane monooksygenazami lub hydroksylazami. Podobnie jak oksygenazy właściwe, katalizują proces wbudowywania tlenu do cząsteczki substratu, z tą różnicą, że oksgenazy mieszane wbudowują tylko jeden atom tlenu z dwuatomowej cząsteczki tlenu. Wymagają dodatkowego donora wodoru do redukcji drugiego atomu tlenu

- oksydazy

Ich rolą jest przenoszenie elektronów i protonów z donora na tlen cząsteczkowy. Produktami takiego działania jest utleniony związek organiczny i najczęściej woda (czasem nadtlenek wodoru)

Dzielą się na:

• Oksydazy wytwarzające wodę (miedzioproteiny)

• Oksydazy wytwarzające nadtlenek wodoru tzw. oksydazy flawinowe bądź flawoproteidy

- enzymy rozkładające nadtlenek wodoru

Jak sama „nazwa” wskazuje, są to enzymy rozkładające nadtlenek wodoru. Zaliczają się do nich

• Peroksydazy - katalizują przeniesienie odłączonych atomów wodoru z substratów na nadtlenek wodoru

• Katalazy - rozkładają nadtlenek wodoru bez żadnego dodatkowego substratu. Może wykazywać również aktywność peroksydazy poprzez katalizowanie oderwania atomu wodoru od substratów organicznych.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1.Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego

Do doświadczeń wykonywanych w tym zadaniu będziemy używać ekstraktu enzymatycznego, który, dla rzodkiewki, należy przygotować w następujący sposób:

- rzodkiewkę obrać ze skórki - skórka rzodkiewki zawiera polifenole będące barwnymi substancjami, przeszkadzającymi w późniejszym określeniu barwy podczas miareczkowania

- obraną rzodkiewkę zetrzeć na tarce, a następnie odważyć z tego 20g

- wrzucić odważoną ilość do erlenmayerki, dodać 0,5g węglanu wapnia (buforuje on środowisko) i zalać wodą destylowaną tak, aby cała objętość była równa około 200cm³, całość zamieszać

- przygotowaną mieszaninę odstawić na 15 minut celem ekstrakcji enzymów

- po 15 minutach przesączyć ją na lejku przez watkę - uzyskany przesącz to właśnie ekstrakt enzymatyczny

W podobny, lecz trochę inny sposób, przygotowane zostały także ekstrakty enzymatyczne z: banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

2.Analiza jakościowa

Dzięki przeprowadzonej analizie jakościowej będziemy mogli stwierdzić czy w badanym surowcu znajdują się oksydoreduktazy i pobieżnie określić ich ilość, bez dokładnych wartości. Wykrywane będą: katalaza, oksydaza orto-difenolowa oraz peroksydaza.

Ćwiczenie wykonane dla ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Równocześnie, przez inne grupy, ćwiczenie to zostało wykonane dla banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

Wykonanie ćwiczenia:

W sześciu probówkach umieścić po 5 ml ekstraktu enzymatycznego. Następnie do każdej z nich (oprócz probówki nr 1) dodać inny odczynnik:

1 - nie dodawać nic, jest to próba odniesienia, na podstawie której będziemy opisywać zmiany w pozostałych probówkach

2 - dodać 10 kropli 1% roztworu H₂O₂

3 - dodać 10 kropli 1% roztworu katecholu

4 - dodać 10 kropli 1% roztworu pirogalolu

5 - dodać 10 kropli 1% roztworu katecholu i 10 kropli 1% roztworu H₂O₂

6 - dodać 10 kropli 1% roztworu pirogalolu i 10 kropli 1% roztworu H₂O₂

Przeprowadzone obserwacje razem z oceną aktywności enzymów zostały zamieszczone w tabeli 1.

Tabela 1. Wyniki analizy jakościowej aktywności katalazy, oksydazy orto-difenolowej i

peroksydazy w ekstrakcie enzymatycznym z rzodkiewki

Wykrywany enzym	Nr probówki	Zawartość próby	Opis próby	Wynik analizy
Próba odniesienia	1	Ekstrakt	Lekko mętny, lekko biały roztwór	x
Katalaza	2	Ekstrakt + H2O2	Roztwór pozostał lekko biały i mętny, lecz zaczęły wydzielać się pęcherzyki gazu	++
Oksydaza orto-difenolowa	3	Ekstrakt + katechol	Roztwór pozostał lekko mętny z delikatnym białym zabarwieniem	-
		4	Ekstrakt + pirogalol	Roztwór zabarwił się na lekko żółty kolor	-
	Peroksydaza	5	Ekstrakt + katechol + H2O2	Roztwór zabarwił się na kolor brunatny i wydzielały się pęcherzyki gazu	+++
		6	Ekstrakt + pirogalol + H2O2	Roztwór zabarwił się na kolor pomarańczowo-brązowy i wydzielały się pęcherzyki gazu	+++

„-” - brak aktywności enzymu

„+/-” - znikoma aktywność enzymu

„+” / „++” / „+++” - mała / średnia / wysoka aktywność enzymu

Wnioski:

W probówce nr 2 o obecności katalazy świadczą wydzielające się pęcherzyki gazu. Tłumaczy to reakcja katalizowana przez ten właśnie enzym:

Ta reakcja pokazuje nam, że pęcherzyki gazu to cząsteczkowy tlen ulatniający się z probówki zawierającej tą próbę. Aktywność katalazy oceniona została jako średnia.

Probówki nr 3 i nr 4 posłużyły do wykrycia oksydazy o-difenolowej. Jak widać, w probówce nr 3, roztwór nie zmienił swojego wyglądu ani konsystencji i pozostał taki jak próba odniesienia. Świadczy to o braku aktywności tejże oksydazy, czyli jednocześnie o braku jej obecności w badanym ekstrakcie enzymatycznym. Podobnie jest w przypadku probówki nr 4. Roztwór pozostałby taki, jaka jest próba odniesienia, gdyby nie fakt, że roztwór pirogalolu ma kolor lekko żółty i po dodaniu do probówki zabarwił on badany roztwór na wspomniany kolor. Gdyby w ekstrakcie enzymatycznym z rzodkiewki oksydaza orto-difenolowa była obecna, to w próbie z katecholem zaszłaby następująca reakcja:

W probówkach nr 5 i nr 6 użyte odczynniki umożliwiły nam wykrycie enzymu zwanego peroksydazą. O obecności tego enzymu świadczy zabarwienie roztworu na kolory zbliżone do brązowego, które są skutkiem powstawania barwnych związków, np. purpurogaliny z pirogalolu, przy udziale peroksydazy. Powstające równocześnie pęcherzyki gazu to wydzielający się gazowy CO₂. Ponieważ powstałe barwy były intensywne, aktywność peroksydazy została oceniona jako wysoka. W próbie z pirogalolem reakcja zachodziła według następującego schematu:

3.Analiza ilościowa

Analiza ilościowa posłuży nam do określenia dokładniejszej, liczbowej wartości aktywności enzymu, dzięki czemu będziemy mogli porównać ze sobą aktywności wszystkich wykrywanych enzymów z badanego surowca. Tak jak w poprzednio wykrywane będą: katalaza, oksydaza orto-difenolowa oraz peroksydaza.

Ćwiczenie wykonane dla ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Równocześnie, przez inne grupy, ćwiczenie to zostało wykonane dla banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

Oznaczanie aktywności katalazy

Zasada oznaczenia:

W metodzie tej stosuje się miareczkowanie roztworem KMnO₄ w obecności H₂SO₄ roztworu, w którym znajduje się nierozłożony przez katalazę H₂O₂, aby wykryć go ilościowo. Różnica objętości zużytego KMnO₄ na miareczkowanie próby odniesienia, a próby właściwej odpowiadać będzie ilości rozłożonego H₂O₂ pod wpływem katalazy.

Wykonanie ćwiczenia:

Należy zrobić dwie próby, z czego jedna będzie próbą odniesienia, w której reakcja nie będzie zachodzić, a druga próbą właściwą:

1. próba odniesienia - w erlenmayerce umieścić 10 ml ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki oraz 25 ml wody destylowanej, następnie dodać 5 ml 10% kw. siarkowego (VI) (inaktywuje on enzymy z ekstraktu), a potem 3 ml 1% H₂O₂.

2. próba właściwa - tak jak poprzednio, do erlenmayerki wlać 10 ml ekstraktu enzymatycznego oraz 25 ml wody destylowanej, lecz tym razem po dodaniu tych dwóch substancji dodajemy 3 ml 1% H₂O₂. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut i po tym czasie dodać do roztworu 5 ml H₂SO₄ w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.

Obie próby miareczkuje się 0,1 M roztworem KMnO₄ do barwy różowej, która nie zniknie w ciągu 30 sekund. Zachodzi wtedy reakcja według następującego schematu:

2KMnO₄+5H₂O₂+4H₂SO₄ → 2KHSO₄+2MnSO₄+8H₂O+5O₂

Wyniki miareczkowań

Próba odniesienia - 29,3 ml

Próba właściwa - 12,1 ml

Jednostką aktywności (1U - 1 unit) katalazy jest 1 μmol H₂O₂ rozłożony w temperaturze 20°C w ciągu jednej minuty. Aktywność tą podaje się w jednostkach aktywności enzymatycznej zawartej w 1 gramie produktu. Aktywność katalazy liczymy ze wzoru:

CAT - aktywność katalazy w ekstrakcie [U/g]

a - objętość KMnO₄ zużyta na miareczkowanie próby odniesienia (29,3 cm³)

b - objętość KMnO₄ zużyta na miareczkowanie próby właściwej (12,1 cm³)

V_ekstr - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki (200 cm³)

250 - miano 0,1M KMnO₄ wyrażone w μmolach H₂O₂

V_enz - objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki pobrana do oznaczania (10 cm³)

m_prod - naważka produktu (rzodkiewki), z której otrzymano cały ekstrakt (20 g)

t - czas reakcji enzymatycznej (30 min)

Jednostką aktywności (1U) katalazy jest 1 μmol H₂O₂ rozłożony w temperaturze 20°C w ciągu jednej minuty

Oznaczanie aktywności oksydazy orto-difenolowej

Zasada oznaczenia:

Oznaczenie to polega na spektrofotometrycznym zbadaniu barwnych produktów, które powstają z utlenienia katecholu. Utlenienie to zachodzi w obecności tlenu atmosferycznego i oksydazy o-difenolowej.

Wykonanie ćwiczenia:

Podobnie jak w oznaczaniu aktywności katalazy tutaj także przygotowujemy 2 próby - jedna kontrolna, która posłuży do kalibracji spektrofotometru i druga - właściwa:

1. próba kontrolna - do probówki wlewamy 4 ml roztworu katecholu 10 mM oraz 2 ml buforu fosforanowego

Mierzymy absorbancję próby kontrolnej przy długości fali λ = 420 nm jednocześnie kalibrując spektrofotometr

2. próba właściwa - do probówki wlewamy 4 ml roztworu katecholu 10 mM oraz 1,5 ml buforu fosforanowego, a następnie przed samym pomiarem absorbancji dodajemy 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Szybko mieszamy i wstawiamy do spektrofotometru w celu zmierzenia absorbancji wobec próby kontrolnej. Zapisujemy wynik, czekamy minutę i ponownie zapisujemy nowy wynik

Wyniki pomiarów absorbancji:

Absorbancja roztworu na początku reakcji enzymatycznej - 0,012

Absorbancja roztworu po minucie reakcji enzymatycznej - 0,016

Jednostką aktywności oksydazy orto-difenolowej jest przyrost absorbancji o 0,01 w temperaturze 20°C w ciągu jednej minuty w warunkach prowadzenia oznaczenia (1u). Aktywność tą podaje się w jednostkach aktywności enzymatycznej zawartej w 1 gramie produktu. Aktywność oksydazy orto-difenolowej liczymy ze wzoru:

Aktywność PPO - aktywność oksydazy o-difenolowej [u/g _produktu]

ΔA - przyrost absorbancji w ciągu minuty (0,016 - 0,012 = 0,004)

V_ekstr - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki (200 cm³)

0,01 - współczynnik przeliczeniowy jednostki aktywności

V_enz - objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki użyta w oznaczeniu (0,5 cm³)

m_prod - naważka produktu (rzodkiewki), z której otrzymano cały ekstrakt (20 g)

Oznaczanie aktywności peroksydazy

Zasada oznaczenia:

Metoda oznaczania aktywności peroksydazy również wykorzystuje metody spektrofotometryczne. Barwne produkty dające zabarwienie roztworowi to produkty utleniania gwajakolu przez nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy. Trzeba więc zmierzyć absorbancję powstałego barwnego produktu wobec próby kontrolnej na początku reakcji enzymatycznej i po minucie jej trwania.

Wykonanie ćwiczenia:

Przygotować dwie probówki. Do pierwszej wlać: 5 ml buforu fosforanowego, 1 ml roztworu gwajakolu i 1 ml ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Powstały roztwór stanowi próbę kontrolną, przy użyciu której należy skalibrować spektrofotometr. Robimy to przy długości fali λ = 436 nm.

W drugiej probówce umieszczamy te same substancje, a następnie przed samym pomiarem absorbacji, dodajemy 2 krople 12,3 mM H₂O₂. Szybko mieszamy i natychmiast mierzymy absorbancję wobec próby kontrolnej. Odczekujemy minutę (czasem dłużej) i ponownie spisujemy wartość absorbancji.

Wyniki pomiarów absorbancji:

Absorbancja roztworu na początku reakcji enzymatycznej - 0,003

Absorbancja roztworu po minucie reakcji enzymatycznej - 0,032

Jednostką aktywności peroksydazy jest przyrost absorbancji o 0,01 w temperaturze 20°C w ciągu 1 minuty w warunkach prowadzenia oznaczenia. Aktywność tą podaje się w jednostkach aktywności enzymatycznej zawartej w 1 gramie produktu. Aktywność peroksydazy liczymy ze wzoru:

Aktywność POD - aktywność oksydazy o-difenolowej [u/g _produktu]

ΔA - przyrost absorbancji w ciągu minuty (0,032 - 0,003 = 0,029)

V_ekstr - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki (200 cm³)

0,01 - współczynnik przeliczeniowy jednostki aktywności

V_enz - objętość ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki użyta w oznaczeniu (1 cm³)

m_prod - naważka produktu (rzodkiewki), z której otrzymano cały ekstrakt (20 g)

Wszystkie wyniki dla wszystkich surowców zebrane zostały w tabeli 2.

Tabela 2. Aktywności enzymów w badanych surowcach według analizy jakościowej i

ilościowej

	ANALIZA JAKOŚCIOWA			ANALIZA ILOŚCIOWA
		Aktywność enzymu
Enzym Surowiec	Katalaza	Oksydaza o-difenolowa	Peroksydaza	Katalaza [U/g]	Oksydaza o-difenolowa [u/g]	Peroksydaza [u/g]
Banan	+++	++	+++	218,33	944	7
		+++	++	+++	224,16	1084	7
	Rzodkiewka	+	-	+++	124,16	58	52
		++	-	+++	143,33	8	29
	Kapusta włoska	+++	+/-	+++	321,67	60	40,9
		+++	+/-	+++	261,25	132	42,5
	Chrzan	+/-	+/-	+++	10	202	437
		+/-	+/-	+++	25,83	128	613

„-” - brak aktywności enzymu

„+/-” - znikoma aktywność enzymu

„+” / „++” / „+++” - mała / średnia / wysoka aktywność enzymu

Tabela 3. Wartości średnie obliczonych aktywności enzymów w badanych surowcach

	ANALIZA ILOŚCIOWA
		Aktywność enzymu
Enzym Surowiec	Katalaza [U/g]	Oksydaza o-difenolowa [u/g]	Peroksydaza [u/g]
Banan	221,245	1014	7
Rzodkiewka	133,745	33	40,5
Kapusta włoska	291,46	96	41,7
Chrzan	17,915	165	525

4.Wnioski

W tym ćwiczeniu celem było obliczenie aktywności wybranych enzymów, a mianowicie enzymów z grupy oksydoreduktaz, którymi są: katalaza, oksydaza orto-difenolowa oraz peroksydaza. Aktywność ta została wyznaczona na dwa sposoby - jednym z nich była analiza jakościowa, a drugim - analiza ilościowa. Analiza jakościowa służy głównie do określenia czy dany enzym w ogóle znajduje się w badanym surowcu, aniżeli do określenia jego dokładnej aktywności, ponieważ patrząc na zmiany w probówkach z badanymi roztworami nie zawsze można trafnie ocenić stopień zmiany.

Za to analiza ilościowa, jak widać, daje nam konkretne wyniki liczbowe, dzięki którym porównywać możemy ze sobą aktywności tego samego enzymu w różnych surowcach.

W tabeli 2. zebrane zostały wyniki aktywności wszystkich badanych enzymów z różnych surowców, którymi były: banan, rzodkiewka, kapusta włoska i chrzan. Patrząc na część tabeli zawierającą wyniki analizy jakościowej od razu możemy stwierdzić, że wszystkie z badanych surowców zawierają katalazy i peroksydazy. Trzeciego badanego enzymu - oksydazy
o-difenolowej, nie znajdziemy za to w rzodkiewce.

Druga część tabeli 2. zatytułowana „analiza ilościowa” mówi nam o tych enzymach nieco więcej. Dla ułatwienia wartości aktywności enzymów zostały uśrednione i zamieszczone w tabeli 3. Surowcem wykazującym największy poziom aktywności katalazy jest kapusta włoska, aktywność ta wynosi 291,46 U/g, najmniejsza aktywność tego enzymu stwierdzona została dla chrzanu i wynosi 17,915 U/g. Jeśli spojrzeć na oksydazę o-difenolową to widać definitywnie, że największy poziom aktywności tego enzymu wykazuje banan, aż 1014 u/g, a najmniejszy rzodkiewka, zaledwie 33 u/g. Trzecim enzymem jest peroksydaza. Jej aktywność najbardziej zauważalna jest w chrzanie - 525 u/g, a najmniej zauważalna w bananie - 7 u/g.