ILOŚCIOWE OZNACZANIE DROBNOUSTROJÓW

I. Określanie ilości żywych drobnoustrojów:

Stosuje się głównie dwie metody:

1. metodę płytkową na pożywkach stałych (posiew powierzchniowy, posiew wgłębny)

2. metodę oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów w pożywkach płynnych (NPL)

W metodzie płytkowej znając użyte rozcieńczenie, objętość płynu użytego do wysiewu i obliczając liczbę wyrosłych kolonii można łatwo wyliczyć liczbę drobnoustrojów na jednostkę objętość lub wagi badanego materiału.

Metoda liczenia bakterii przez posiew na podłoże stałe zakłada, że liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek lub jednostek wzrostowych (j.t.k -jednostek tworzących kolonie = cfu - ang. colony forming units) w badanym materiale. Na płytce można łatwo odróżnić jako pojedyncze (a zatem policzyć) około 300 kolonii. Dlatego próby zawierające dużą liczbę bakterii należy rozcieńczyć przed posiewem ( zwykle stosuje się szeregi 10-krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym). Należy pamiętać, że hodowle bakterii zażerają w jednym mililitrze miliony (10⁶) lub nawet miliardy (10⁹) komórek.

Dla prób o niewielkiej liczbie bakterii (np. woda wodociągowa) można zastosować metodę sączenia przez filtr membranowy, polegającą na przesączeniu badanej próbki (np. o objętości 100 ml) przez sączek membranowy, a następnie położeniu sączka na podłożu wzrostowym (np. podłożu Endo - w przypadku określania wskaźnika coli w wodzie) i po okresie inkubacji policzeniu kolonii wyrosłych na powierzchni sączka.

Próbkę rozcieńcza się według podanego schematu (Ryc.1). Liczba rozcieńczeń zależy od przewidywanego stopnia zanieczyszczenia badanego płynu. Z największych rozcieńczeń wysiewa się po 0,1 ml na powierzchnię podłoży stałych (posiew powierzchniowy - A), lub przenosi po 1 ml do płytek Petriego i zalewa upłynnionym podłożem agarowym o temperaturze (47°C± 2°C) (posiew wgłębny - B).

Schemat ilościowego oznaczania drobnoustrojów metodą płytkową na pożywkach stałych:

Posiew powierzchniowy (A), posiew wgłębny (B)

Obliczanie liczby komórek według normy ISO 721:1998.

Do obliczeń powinny być brane pod uwagę tylko płytki z mniejszą niż 300 liczbą kolonii. Aby wynik badania uznać jako ważny należy liczyć kolonie przynajmniej na jednej płytce, zawierającej co najmniej 15 kolonii.

Liczbę N drobnoustrojów występujących w badanej próbce należy obliczyć uwzględniając dwa kolejne rozcieńczenia, według równania :

gdzie:

ΣC jest sumą kolonii na wszystkich płytkach z dwóch kolejnych rozcieńczeń, z których conajmniej jedna zawiera 15 kolonii

n₁ jest liczbą płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia n₂ jest liczbą płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia d jest współczynnikiem rozcieńczenia odpowiadającym pierwszemu liczonemu

rozcieńczeniu

V jest objętością posiewu nanoszonego na każdą płytkę, w mililitrach

Obliczony wynik należy zaokrąglić do dwóch znaczących cyfr. Jeżeli ostatnia cyfra jest mniejsza niż 5, to nie zmieniać cyfry ją poprzedzającą. Jeżeli ostatnia cyfra jest równa lub większa od 5 , to cyfrę poprzedzającą zwiększyć o 1.

Wynik jest liczbą drobnoustrojów w lml lub w lg zawartą między 1,0 a 9,9 pomnożoną przez 10 w odpowiedniej potędze.

Oszacowanie wyników obliczania:

1. Jeżeli dwie płytki zawierają mniej niż 15 kolonii, należy obliczyć średnią arytmetyczną (y) z kolonii policzonych na obu płytkach, a wynik podać w sposób następujący:

N_E = y/d gdzie d jest współczynnikiem rozcieńczenia próbki

2. Jeżeli dwie płytki nie zawierają żadnych kolonii, to wynik podać w sposób następujący:

• mniej niż l/d drobnoustrojów w gramie (ml) gdzie d jest współczynnikiem rozcieńczenia próbki

Granice ufności

Przedział ufności określa statystyczny rozkład drobnoustrojów w próbce i jego wyznaczenie jest konieczne w celu oszacowania ważności wyniku oraz uniknięcia zbyt rygorystycznej interpretacji. (Należy pamiętać, że przyczyną innych zmnienności, w szczególności tych związanych z błędami rozcieńczenia, jest stosowana metoda badania sama w sobie ingerencyjna, a ich zasięg zmienia się w zależności od analityka i laboratorium).

Przedział ufności δ, charakteryzujący rozrzut wyników mikrobiologicznych w próbce dla prawdopodobieństwa 95% oblicza się według równania:

w którym:

B = V(n₁ + 0,1n₂), i gdzie

ΣC - suma kolonii na wszystkich liczonych płytkach

n₁ - liczba płytek w pierwszym liczonym rozcieńczeniu

n₂ - liczba płytek w drugim liczonym rozcieńczeniu

V - objętość posiewu nanoszonego na każdą płytkę w ml

d - współczynnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu liczonemu rozcieńczeniu

Metoda oznaczania NPL polega na sporządzeniu szeregu kolejnych rozcieńczeń badanej próbki i wykonaniu posiewu z tego samego rozcieńczenia do kilku (np. trzech - najczęściej, pięciu lub dziesięciu) probówek zawierających płynne podłoże wzrostowe. Wstawiając probówki do cieplarki otrzymamy wzrost tam, gdzie znalazła się przynajmniej jedna bakteria. Najczęściej stosowane systemy posiewu, nazywane systemami „symetrycznymi" charakteryzują się taką samą liczbą probówek w każdym rozcieńczeniu, oraz stosowaniem rozcieńczeń dziesięciokrotnych. W systemach „asymetrycznych" stosuje się różną liczbę probówek dla różnych rozcieńczeń. Tablice NPL dla symetrycznych systemów 3 - probówkowych według normy PN-ISO 7218:1998 przedstawia Załącznik B. Wskaźnik NPL odczytuje się z tablicy B.l na podstawie sekwencji liczb wyników dodatnich. W tablicy B.l należy sprawdzić, czy wybrane sekwencje wyników dodatnich są do przyjęcia ze statystycznego punktu widzenia, co zależy zarówno od liczby badanych próbek, jak i od decyzji przyjęcia lub odrzucenia wyników z kategorii 2 lub 3 (patrz tablica B.2).

II. Określanie całkowitej liczby drobnoustrojów (łącznie żywych i martwych):

• Metodą mikroskopowa w komorach hemocytometru lub ich odmianach specjalnie przystosowanych do potrzeb bakteriologii, przez liczenie komórek w rozmazach o znanej powierzchni i wykonanych znaną ilością płynu specjalnymi mikropipetami lub ezami miarowymi. Pod mikroskopem można też zliczać znajdujące się.po filtracji na powierzchni filtru bakterie zabarwione barwnikiem (np.fuksyną zasadową).

• Metodą turbidymetryczna lub nefelomertyczna. w których określa się stopień rozproszenia lub pochłaniania przez bakterie promieni świetlnych przepuszczanych przez badany płyn, a przez porównanie z odpowiednimi standardami oznacza ich liczbę.

• Metoda pomiaru impedancji (oporu przepływu prądu zmiennego). W trakcie wzrostu bakterii, na skutek ich przemian metabolicznych następują zmiany impedancji, które wykrywa się elektronicznie. Pozwala to wykalibrować krzywą wzrostu, z której można odczytać jakiej liczbie żywych komórek drobnoustrojów odpowiada mierzona zmiana impedancji (np. zmiana impedancji wynosząca 0,8 występuje przy liczbie 105cfu bakterii w 1 ml moczu).

Inne metody np. wykorzystujące fakt, że w danym gatunku bakterii mniej więcej stała jest zawartość azotu i fosforu. Oznaczenie ilości azotu organicznego lub fosforu w zawiesinie bakterii, a także białek i kwasów nukleinowych pozwala oszacować ich ilość.

ZAKAŻENIA UKŁADU MOCZOWEGO - ZUM Przykład analizy ilościowej w mikrobiologii lekarskiej

Kliniczne postacie ZUM:

1 .bakteriuria bezobjawowa

2. zapalenie cewki moczowej

3. zapalenie pęcherza moczowego

4. zapalenie gruczołu krokowego

5. ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek

6. przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek

Drobnoustroje etiologiczne:

Pałeczki Gram-ujemne (głównie z rodziny Enterobacteriaceae ):

• Escherichia coli (50% - 90%) - serotypy uropatogenne

• Proteus mirabilis

• Klebsiella pneumoniae

• Enterobacter sp.

• Proteus vulgaris • Pseudomonas aeruginosa Ziarenkowce Gram (+):

• Enterococcus faecalis - enterokoki

• Streptococcus betahemolizujący z grupy B - paciorkowce:

Gronkowce:

• Staphylococcus epidermidis

• Staphylococcus saprophyticus

Grzyby:

• Candida albicans

Pierwotniaki

Diagnostyka mikrobiologiczna zum opiera się na:

• analizie ilościowej i jakościowej odpowiednio pobranej próbki moczu

• określeniu obecności lub braku czynnika hamującego wzrost bakterii Gram(+) i Gram(-)

• identyfikacji patogenu

• określeniu wrażliwości na leki stosowane w terapii zum

Pobieranie próbek moczu do badanie bakteriologicznego:

• ze środkowego strumienia

• za pomocą cewnika

• przez nakłucie nadłonowe

• Mocz należy pobierać rano.

• od kobiety:

• umyć ręce wodą z mydłem, osuszyć jednorazowym ręcznikiem

• umyć dokładnie krocze bieżącą wodą z mydłem, a jeśli to konieczne okolice ujścia cewki moczowej przetrzeć tamponem nasączonym 3% wodą utlenioną

• oddać około połowy zawartości moczu do ustępu, a następnie nie przerywając strumienia pobrać około 5 ml moczu bezpośrednio do jałowego naczynia.

• nie wolno dotykać brzegów oraz wewnętrznej powierzchni naczynia i nakrętki.

• próbę należy możliwie najszybciej przesłać do laboratorium, a jeśli nie jest to możliwe wstawić do lodówki na dolną półkę (temp.+ 4°C) maksymalnie na 3 h.

• od mężczyzny:

• umyć ręce wodą z mydłem, osuszyć jednorazowym ręcznikiem

• całkowicie ściągnąć napletek i umyć żołądź prącia bieżącą wodą z mydłem

• oddać około połowy zawartości moczu do ustępu, a następnie nie przerywając strumienia, pobrać około 5ml moczu bezpośrednio do jałowego naczynia

• nie wolno dotykać brzegów oraz wewnętrznej powierzchni naczynia i nakrętki.

• próbę należy możliwie najszybciej przesłać do laboratorium, a jeśli nie jest to możliwe wstawić do lodówki na dolną półkę (tem.+ 4°C) maksymalnie na 3 h.

• od niemowląt i małych dzieci:

• osoba pobierająca myje dokładnie ręce wodą z mydłem i osusza je jednorazowym ręcznikiem

• należy rozchylić nóżki dziecka, dokładni umyć okolice ujścia cewki moczowej wodą z mydłem, osuszyć wyprasowaną pieluchą tetrową lub ręcznikiem.

• okolice ujścia cewki moczowej przetrzeć tamponem nasączonym 3% wodą utlenioną.

• należy koniecznie pobrać mocz bezpośrednio do jałowego pojemnika.

• nie wolno przy pobieraniu moczu do badań mikrobiologicznych

• stosować woreczków.

• nie wolno przelewać moczu oddanego do nocnika. Próbę należy możliwie najszybciej przesłać do laboratorium, a jeśli nie jest to możliwe wstawić do lodówki na dolną półkę (tem.+ 4°C) maksymalnie na 3 h.

UWAGA: Mocz na badanie w kierunku Chlamydia trachomatis należy pobrać z pierwszego strumienia do jałowego pojemnika.

• mocz pobierany od pacjenta cewnikowanego.

• do badań należy pobrać mocz po wymianie cewnika.

• należy wyjąć stary cewnik, umyć dokładnie okolice krocza wodą z mydłem, przetrzeć tamponem nasączonym 3% wodą utlenioną.

• po założeniu nowego cewnika, pierwszą porcję moczu odrzucić, a następną pobrać do jałowego pojemnika. mocz należy jak najszybciej dostarczyć do laboratorium, a jeśli to nie jest możliwe, wstawić do lodówki w temp + 4°C (dolna półka) maksymalnie na 3h.

• mocz pobierany przez nakłucie nadłonowe.

• wykonuje lekarz w warunkach aseptycznych przy całkowicie wypełnionym pęcherzu.

• badanie wykonuje się przy podejrzeniu jako czynnika etiologicznego bakterii beztlenowych, lub jeśli w inny sposób nie można pobrać moczu do badania.

UWAGA: Taki sposób stosuje się tylko gdy jest to naprawdę konieczne.

Oznaczanie w moczu czynnika hamującego wzrost bakterii (próba Goulda):

Szczepy wzorcowe:

Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922

Wykonanie: próbkę moczu należy ogrzać w łaźni wodnej w temp. 60°C przez 1 godz. Następnie 2 krążki bibułowe nasycić próbką moczu i nałożyć oddzielnie na 2 płytki z podłożem wzrostowym (Mueller Hinton z posianymi szczepami wzorcowymi wg standardu NCCLS). Płytki inkubować 18-20 godz. w temp.35-37°C .

Interpretacja: obecność każdej strefy zahamowania wzrostu szczepów wzorcowych przyjmuje się za wynik dodatni (obecność czynnika)

Badanie ilościowe moczu:

• metoda Hoepricha - posiew nierozcieńczonej próbki moczu ezą kalibrowaną lub mikropipetą ( metoda ez kalibrowanych) (a)

• technika posiewu powierzchniowego z kolejnych rozcieńczeń próbki moczu

• metoda zanurzeniowa - posiew na podłoża transportowo-hodowlane typu Uromedium (b)

Podłoża podstawowe:

• tryptozowo-sojowe (TSA - tryptic soy agar) + 5% krwi baraniej (umożliwia wzrost wszystkich potencjalnych patogenów)

• Mac Conkey Agar - umożliwia wzrost i wstępne różnicowanie pałeczek Gram(-)

• Sabouraud - ułatwia wzrost grzybów

• Cled ( może zastąpić dwa pierwsze w/w podłoża)

Interpretacja wyników ilościowego badania moczu:

• posiew dodatni (znamienna bakteriuria)

• u dorosłych - 10⁵ cfu/ml i więcej

• u dzieci 10⁴(10³)cfu/ml

Posiew wątpliwy (podejrzenie zakażenia, wskazanie do pobrania następnej próbki):

• u dorosłych - 10⁴cfu/ml

• u dzieci 10³ (10²)cfu/ml

Posiew ujemny: poniżej 10³cfu/ml

Uwagi:

• izolacja 2 i więcej drobnoustrojów świadczy o zanieczyszczeniu próbki moczu, badanie należy powtórzyć

• każda liczba komórek drobnoustrojów wyhodowana z moczu pobranego drogą nakłucia nadłonowego świadczy o zum

a) metoda płytkowa - metoda tzw. kalibrowanych

próbka badana = objętość ezy mikropipety

Badany materiał nanosi się ezą lub mikropipetą na środek płytki, następnie wykonuje się ruch 1-pionowo w górę, ruch 2-pionowo od góry ku dołowi, ruch 3-zygzakowaty po całej powierzchni płytki. Po zakończeniu inkubacji podłoży z próbą badaną zlicza się kolonie wyrosłych drobnoustrojów i uwzględniając objętość oblicza się liczbę drobnoustrojów w 1 ml.

Obliczenie:

liczba kolonii na płytce x objętość ezy lub mikropipety = liczba drobnoustrojów w 1 ml

np.: 123 x 10³ = 1,2 x 10⁵ cfu/ml

eza kalibrowana lub mikropipetą na 1 ml = 0.001 ml = 10^-3­­­­­

Pojemnik do oznaczania liczby bakterii techniką zanurzeniową: a - zakrętka, b - łącznik, c - płytka dwustronna z podłożami, d - bibuła

---