Immunologia - prelekcja 15.10.2007

Odporność nieswoista humoralna

Odpowiedź nieswoista cechuje się tym że:

• Jest szybka, natychmiastowa

• Receptory rozpoznające drobnoustroje są niezmienne w ciągu życia osobnika, kolejnych pokoleń (dziedziczne)

• Jest selektywna (celem ataku nie są własne struktury)

• Nie pozostawia po sobie trwałej pamięci immunologicznej

• Rozwija się niezależnie od odpowiedzi swoistej

Nieswoiste mechanizmy obronne to przede wszystkim:

• Skóra (rogowacjejący nabłonek, pot, łój)

• Drogi oddechowe (kaszel, kichanie, wydzieliny śluzowo-surowicze)

• Przewód pokarmowy (kwas solny, perystaltyka, złuszczanie się nabłonka, fizjologiczna flora bakteryjna produkująca kolicyny - substancje o charakterze bakteriobójczym zabijające bakterie zwłaszcza szczepów pokrewnych E. coli)

• Krew, wydzieliny (laktoferyna, transferyna, interferony, lizozym)

• Układ dopełniacza, białka ostrej fazy, lizozym, komórki żerne i NK

PAMP (ang. pathogen-associated molecular patterns, molekularne wzorce budowy patogenów) to najbardziej charakterystyczne struktury drobnoustrojów, selektywnie rozpoznawane w odpowiedzi nieswoistej. Zaliczamy do nich między innymi lipopolisacharydy, peptydoglikan, polisacharydy bakterii (składniki ściany), zymosan, mannany, dwuniciowy RNA. Receptory dla PAMP dzielą się na wolne (opsoniny) i związane z powierzchnią komórek - te ostatnie mogą uczestniczyć w procesie fagocytozy oraz aktywacji komórek, np. nabłonkowych.

Cząsteczki uczestniczące w mechanizmach odporności wrodzonej to:

• Białka ostrej fazy

• Kolektyny

• Peptydy antybakteryjne

• Lizozym

• Cytokiny i interferony -> patrz kolejne prelekcje

Białka ostrej fazy (APP, ang. acute phase proteins) stanowią stały fizjologiczny składnik surowicy, w razie konieczności uczestniczący w odpowiedzi immunologicznej. Syntetyzowanie są głównie w wątrobie, zwykle na skutek stymulacji bakteryjnej. W warunkach fizjologicznych ich stężenie w surowicy jest małe lub śladowe, a pod wpływem stymulacji gwałtownie wzrasta w ciągu paru godzin (choć może też maleć w wypadku negatywnych białek ostrej fazy, np. transferyny). Mogą być również wytwarzane w odpowiedzi na cytokiny IL-1, IL-5, TNF, IFN-gamma produkowane przez aktywowane makrofagi i komórki NK. Główne funkcje APP to:

• Wzmaganie aktywacji dopełniacza

• Funkcja opsonin - głównie CRP, kolektyny, białko wiążące mannozę MBP oraz składniki dopełniacza.

• Wzmaganie zabijania drobnoustrojów

• Hamowanie wzrostu bakterii przez białka wiążące jony metali (odbieranie bakteriom potrzebnych mikroelementów) - transferyna, laktoferyna, ceruloplazmina, haptoglobina.

• Ograniczanie uszkodzenia tkanek spowodowanego przez bakterie, urazy, nowotwory, reumatoidalne zapalenie stawów - fibrynogen wspomaga krzepnięcie krwi, inhibitory proteaz neutralizują enzymy lizosomalne uwalniane w czasie fagocytozy

Fibronektyna wiąże się z włóknikiem, zdenaturowanym, „pociętym” kolagenem, a także bezpośrednio z niektórymi bakteriami (np. gronkowcem złocistym), indukując przez swe receptory na komórkach żernych fagocytozę. Za pośrednictwem tego receptora makrofagi mogą fagocytować fragmenty uszkodzonych tkanek i ciała obce, na których odłożył się włóknik.

Białko CRP wiąże się z fosfocholiną bakterii, aktywuje dopełniacz (łączy się z C1q) oraz pełni funkcję opsoniny. Jego nazwa pochodzi od zdolności do wiązania się z wielocukrem C pneumokoków. Ilościowe oznaczanie tego białka u pacjentów z chorobami zapalnymi wykorzystywane jest do monitorowania bieżącej aktywności zapalnej w przebiegu choroby. Wysoki poziom CRP oznacza ostry przebieg choroby.

Surowiczy amyloid A (SAA) aktywuje dopełniacz (łączy się z C1q) oraz pełni rolę opsoniny.

Białko wiążące mannozę MPB łączy się z mannozą na powierzchni bakterii, a następnie z receptorami dla MPB (opsonizacja) oraz aktywuje dopełniacz.

Białko wiążące LPS łączy się ze ścianą komórek bakteryjnych.

Kolektyny to grupa rozpuszczalnych białek zdolnych do wiązania oligosacharydów na powierzchni niektórych drobnoustrojów. Strukturalnie przypominają one składnik C1q dopełniacza. Receptory dla kolektyn na makrofagach ułatwiają usunięcie i zniszczenie bakterii do których przyłączyły się kolektyny. Do kolektyn należą białko wiążące mannozę, konglutyniny, białka A i D surfaktantu płucnego.

Peptydy antybakteryjne wytwarzane są przez wiele różnych komórek, w tym komórki nabłonkowe i żerne. Odgrywają one ważną rolę w usuwaniu infekcji bakteryjnych w reakcjach odporności wrodzonej. Działanie antybakteryjne wykazują one na drodze różnych mechanizmów. Należą do nich m. in. cekropiny, magaininy i defensyny. Dwie pierwsze grupy powodują lizę, inne zaś interferują z transportem jonów. Peptydy przeciwbakteryjne wykazują aktywność zarówno przeciw bakteriom Gram-ujemnym jak i Gram-dodatnim. Jest to jeden z najstarszych ewolucyjnie mechanizmów obronnych. Ostatnimi czasy peptydy przeciwbakteryjne wzbudzają zainteresowanie medycyny jako leki - podjęte próby kliniczne z zastosowaniem peptydów kationitowych dały zadowalające wyniki m. in. w leczeniu owrzodzeń w przebiegu cukrzycy, profilaktyce zapalenia śluzówki jamy ustnej po chemioterapii, infekcji u dzieci z mukowiscydozą i wielu innych schorzeń.

Lizozym (muraminidaza) należy do białek kationowych. Odkryty został na początku lat 20. XX w. przez Fleminga. Obecny jest w ziarnistościach komórek żernych, a także w osoczu krwi, łzach, ślinie oraz wydzielinach śluzowo-surowiczych dróg oddechowych. Jego biochemiczne działanie polega na hydrolizie wiązania beta-1,4-glikozydowego między kwasem N-acetylomuraminowym i N-acetyloglukozaminą, które stabilizuje ścianę komórek bakteryjnych. Działa na wszystkie bakterie Gram-dodatnie z wyjątkiem Staphylococcus aureus.

Lizozym oznaczamy za pomocą następującej próby mikrobiologicznej: do żelu agarozowego dodajemy bakterii Micrococcus lisodeicticus, po czym nakrapiamy badaną wydzielinę z lizozymem. Rozbijanie ścian bakteryjnych daje przejaśnienia, których średnicę oceniamy, by ilościowo oznaczyć poziom lizozymu w badanej wydzielinie. Jest to bardzo trudna metoda ze względu na niewielką widoczność przejaśnień.

Wykonanie praktyczne:

Do 50 ml 2% r-ru agarozy wprowadzić zawiesinę bakterii Micrococcus lisodeicticus. Agarozę z zawiesiną szczepu rozlać (po 25 ml) do jałowych płytek Petriego. Po zastygnięciu agarozy wyciąć 4mm dołki, dodać po 50 ul badanych surowic i r-rów wzorcowych o znanym stężeniu lizozymu (kolejne rozcieńczenia lizozymu kurzego). Inkubować 24h w temp. 37 st. C w cieplarce w komorze wilgotnej. Po inkubacji widoczne strefy przejaśnienia wokół dołków.

Układ dopełniacza

System dopełniacza (C, complement) zbliżony do obecnie występującego u ssaków, zidentyfikowano także u ryb, płazów, gadów oraz ptaków. Drogi aktywacji alternatywnej drogi dopełniacza ukształtowały się prawdopodobnie ok. 600 mln lat temu - stąd wniosek że układ ten jest bardzo stary ewolucyjnie. Terminu „dopełniacz” użył po raz pierwszy Ehrlich w opisie aktywności surowicy, która może „dopełnić” zdolność swoistego przeciwciała do wywołania lizy bakterii.

Podstawowe funkcje dopełniacza to:

• Obrona przeciwzakaźna (opsonizacja, liza)

• Aktywacja fagocytów

• Degranulacja kom. tucznych i bazofilów prowadząca do lokalnego wydzielania stymulatorów odczynu zapalnego

• Współpraca odpowiedzi nieswoistej ze swoistą

• Usuwanie zbędnych produktów - kompleksów immunologicznych, komórek apoptotycznych

Opsonizacja to zjawisko ułatwiania fagocytozy (zwłaszcza drobnoustrojów) w obecności surowicy, szczególnie odpornościowej. Czynnikami ułatwiającymi opsonizację - opsoninami - są składniki surowicy: przeciwciała IgG i IgM, kolektyny, białko CRP oraz fragmenty dopełniacza.

Na układ dopełniacza składają się białka, enzymy, układy pozytywnej i negatywnej regulacji oraz receptory. Należy do niego ok. 40 białek występujących w surowicy i płynach ustrojowych w postaci nieaktywnej, podlegających kaskadowej aktywacji, oraz białka regulatorowe. Miejscem ich syntezy są głównie hepatocyty, a także monocyty/markofagi i fibroblasty. Najwyższe stężenie w surowicy osiąga składowa C3 (1200 ul/ml).

Kaskada aktywacji dopełniacza

Aktywacja dopełniacza polega na serii zarówno enzymatycznych jak i nieeznymatycznych reakcji o charakterze kaskadowym. Każda z trzech dróg aktywacji prowadzi do utworzenia dwóch enzymów o charakterze proteaz: konwertzy C3 i konwertazy C5. Mają one zdolność wzmacniania kaskady aktywacji. Końcowe etapy wszystkich dróg aktywacji są dla nich wspólne, a ich celem jest utworzenie kompleksu atakującego błonę MAC (ang. membrane attacking complex).

Kolejność cyfr oznaczających kolejne białka dopełniacza (C - complement) nie jest związana z kolejnością ich udziału w kaskadzie aktywacji dopełniacza, chociaż w znacznym stopniu się z nią pokrywa. Dotyczy to jedynie odkrytej jako pierwsza, klasycznej drogi aktywacji dopełniacza. Białka biorące udział w pozostałych drogach nie są oznaczane cyframi. W drodze alternatywnej biorą udział czynniki B, D, H, I oraz P (properdyna), natomiast w drodze lektynowej - białko wiążące mannozę MBP i inne kolektyny, a także proteazy MASP-1 i MASP-2, u człowieka także fikoliny L i H.

C3

Jest głównym białkiem kaskady aktywacji dopełniacza, na nie bowiem działają konwertazy utworzone w wyniku działania wszystkich trzech dróg dopełniacza. Zbudowane jest z dwóch łańcuchów polipeptydowych, fizjologiczne stężenie C3 w surowicy wynosi 1200 ug/ml. Sytnetyzowane jest w wątrobie, monocytach, makrofagach, a także płucach, skórze, astrocytach oraz tkance tłuszczowej. Nieaktywowane przez konwertazę białko C3 bierze udział w opsonizacji, natomiast jego składowe:

• C3a wraz z C5a i C4a bierze udział w chemotaksji i aktywacji leukocytów

• C3b bierze udział we wzmaganiu odpowiedzi humoralnej oraz rozwoju pamięci immunologicznej - wraz z C4b, związanym kompleksem Ag:Ab odpowieddnio przez receptory CR2 na limf. B oraz CR2 i CR3 na komórkach dendrytycznych grudek

• Fragmenty C3 wraz z C1q i fragmentami C4 biorą udział w usuwaniu kompleksów immunologicznych oraz komórek apoptotycznych.

Drogi aktywacji dopełniacza

Klasyczna Kompleksy immunologiczne (IgM, IgG) Elementy strukturalne na powierzchni drobnoustrojów

Lektynowa Elementy strukturalne na powierzchni drobnoustrojów zawierające mannozę

Alternatywna Elementy strukturalne na powierzchni drobnoustrojów

AKTYWACJA

Odczyn zapalny

Opsonizacja

Liza

Droga klasyczna

Charakteryzuje ją zależność od przeciwciał związanych z antygenem w kompleksy immunologiczne. Dlatego właśnie układ zyskał nazwę dopełniacza - dopełnia bowiem funkcję przeciwciał, które same w sobie nie są zdolne do zniszczenia komórki drobnoustroju lub pasożyta. Zdolność do aktywacji tej drogi dopełniacza mają immunoglobuliny IgG (z wyjątkiem G4) oraz IgM.

Składnik C1 fizjologicznie składa się z dwóch odwracalnie połączonych ze sobą podjednostek C1q oraz tetrameru C1r2s2.

Przebieg drogi klasycznej aktywacji dopełniacza jest następujący:

1. Przeciwciała przyłączają się do epitopów, co powoduje ich zmiany konformacyjne, a następnie do powstałych kompleksów immunologicznych przyłącza się cząsteczka C1q, kształtem podobna do wiązki sześciu tulipanów. Wiązanie C1q z jednym kompleksem immunologicznym jest słabe, ale związanie dwóch lub więcej sąsiadujących ze sobą kompleksów przez odpowiednią liczbę „główek tulipanów” znacznie zwiększa siłę wiązania, dzięki czemu może zajść dalsza aktywacja dopełniacza.

2. W C1q zachodzi zmiana konformacyjna, która powoduje zmianę konformacyjną w obrębie C1r, eksponując miejsce enzymatyczne o właściwościach proteazy serynowej. Następnie poprzez ograniczoną proteolizę zachodzi trwała już aktywacja kolejnej proteazy serynowej C1s.

3. Aktywowana C1s rozkłada białka C4 i C2. Najpierw rozkładany jest C4, z którego powstają fragmenty C4a i C4b. Pierwszy z nich, uwolniony do środowiska, pełni funkcję anafilatoksyny - patrz niżej.

4. C4b łączy się z błoną komórkową poprzez zawarte w niej białka i cukry. Po przyłączeniu C4b do błony następuje

5. przyłączenie C2 do C4b, po czym C2 zostaje rozłożony do C2a i C2b przez C1s. Powstały kompleks C4bC2a jest to konwertaza C3 drogi klasycznej, najistotniejsza dla prawidłowego działania układu dopełniacza

6. Konwertaza C3 rozkłada C3 do C3a (kolejna anafilatoksyna) i C3b, a ten z kolei może przyłączyć się do błony komórkowej patogenu (6.1), lub do konwertazy C3, tworząc kompleks C4b2a3b, czyli konwertazę C5 drogi klasycznej.

7. Konwertaza C4 rozkłada białko C5 do anafilatoksyny C5a i fragmentu C5b, który bierze udział we wspólnej końcowej drodze aktywacji dopełniacza - tworzeniu kompleksu MAC.

Opisane wyżej konwertazy znacznie wzmacniają efekt aktywacji - jedna konwertaza C3 produkuje setki tysięcy cząsteczek C3b, z których każda może utworzyć konwertazę C5. Każda z tych konwertaz C5 może wyprodukować sporo cząsteczek C5b, każda z nich zaś może utworzyć jeden kompleks MAC. W warunkach fizjologicznych jednak znaczna część cząsteczek C3b nie bierze udziału ani w reakcjach aktywacji dopełniacza, ani w opsonizacji patogenów, ponieważ ze względu na swoją wysoką reaktywność łączą się one z białkami w płynie tkankowym lub z wodą. Wytworzenie nadmiaru C3b jest więc niezbędne do aktywacji układu dopełniacza w ogóle, niemniej amplifikacyjna funkcja konwertaz jest bardzo istotna. Podobną rolę, jako „producent” C4b odgrywa składnik C1s.

Droga alternatywna (poperdynowa)

Droga ta rozpoczyna się spontanicznie i atakuje każdą dostępną błonę biologicznym, jest jednak unieszkodliwiana na komórkach własnego organizmu.

1. W osoczu krwi występuje białko C3(H₂O) podobne do składnika C3b drogi klasycznej. Wiąże ono czynnik B, który w obecności jonów Mg+ i czynnika D zostaje rozbity na fragmenty Ba i Bb.

2. Fragment Ba wydostaje się do środowiska reakcji, natomiast fragment Bb wiąże się z C3(H₂O). Powstały kompleks ma aktywność enzymatyczną, jest to (rozpuszczalna) konwertaza C3 drogi alternatywnej.

3. Konwertaza ta rozkłada C3 tworząc fragmenty C3a i C3b - analogicznie do drogi klasycznej. Pierwszy fragment jest anafilatoksyną, drugi zaś łączy się z błoną komórkową.

4. Związany z błoną C3b przyłącza czynnik B, który - analogicznie do powyższej reakcji - rozbijany jest do Ba i Bb. Po raz kolejny utworzona zostaje konwertaza C3 drogi alternatywnej, tym razem związana z błoną komórkową i dodatkowo stabilizowana czynnikiem P, czyli properdyną (stad druga nazwa drogi - properdynowa).

5. Konwertaza C3 rozkłada C3 do C3a i C3b. Ten ostatni - podobnie jak powyżej - przyłącza się do błony komórkowej i łączy się z czynnikiem B, dając początek kolejnej konwertazie C3 (dodatnie sprzężenie zwrotne), lub przyłącza się do już istniejącej konwertazy C3, tworząc kompleks C3bBb3b czyli konwertazę C5 drogi alternatywnej.

6. Analogicznie do drogi klasycznej konwertaza C5 rozkłada C5 do anafilatoksyny C5a i fragmentu C5b, który tworzy MAC.

Powiązanie dróg klasycznej i alternatywnej zachodzi dzięki czynnikowi C3b, bowiem wytworzony w drodze klasycznej C3b może po związaniu się z błoną tworzyć konwertazę C3 drogi alternatywnej.

Droga lektynowa

Jest podobna do drogi klasycznej, różnią się one jedynie pierwszymi etapami. W drodze lektynowej antygen nie musi być rozpoznany przez przeciwciała (niezależna od niedoborów humoralnych) - są one zastąpione przez białka nieswoiście wiążące cukry, czyli kolektyny. Białka te posiadają domeny lektynowe oraz długie ogonki o strukturze podobnej do kolagenu.

Kolektyna zapoczątkowująca drogę lektynową to białko wiążące mannozę MBL, występujące w osoczu. Budową przypomina ono czynnik C1q, posiada bowiem sześć główek umieszczonych na kolagenopodobnym trzonie:

Ogonek ten może wiązać proteazy serynowe MASP-1 oraz MASP-2. Gdy MBL zwiąże się z powierzchnią antygenu, w ogonku zachodzi zmiana konformacyjna, co powoduje aktywację MASP-1. Ta z kolei dokonuje proteolitycznego cięcia, a zarazem aktywacji MASP-2. Eznym ten ma zdolność rozkładania C2 i C4. Dalsze etapy reakcji są identyczne jak w drodze klasycznej. Kompleks kolektyna-MASP-1-MASP-2 zastępuje więc przeciwciało, jak i C1q, C1r i C1s drogi klasycznej.

Ze względu na swoje właściwości i wczesne pojawienie się w filogenezie MBL określana jest „paraprzeciwciałem”.

Droga alternatywna oraz lektynowa umożliwiają organizmowi natychmiastową reakcję obronną zaraz po wniknięciu do niego patogenu, droga klasyczna wymaga bowiem utworzenia swoistych przeciwciał, co następuje dopiero po pewnym czasie od infekcji.

Kompleks atakujący błonę

Powstaje on w wyniku reakcji nieenzymatycznych, Po wytworzeniu fragmentu C5b - na dowolnej drodze - dochodzi do jego połączenia się z C6. Następnie do powstałego kompleksu dołączane są C7 i C8. Powstaje kompleks C5b-8, który ma zdolność włączania się w błonę komórkową (co powoduje reorientację lipidów błony i jej deformację) i przyłączania cząstek C9. Przyłączenie 2-14 takich cząstek tworzy w błonie komórkowej nie regulowany kanał jonowy, którego średnica zależy od liczby przyłączonych C9. Przez kanał ten z komórki wypływają jony K+, ATP, makromolekuły, wpływa natomiast woda, jony Na+ i inne, a także lizozym oraz antybiotyki. Do zabicia jednej komórki E. coli potrzebne jest od kilkudziesięciu do kilkuset kompleksów MAC.

Wrażliwe na działanie MAC są bakterie Gram-ujemne, niektóre wirusy, pierwotniaki i mykoplazmy. Bakterie Gram-dodatnie bronią się przed dopełniaczem grubą warstwą peptydoglikanu.Dopełniacz może także niszczyć erytrocyty i komórki jądrzaste, np. zakażone wirusem.

Działanie MAC nie jest prawdopodobnie najistotniejszym efektorem działania układu dopełniacza. O wiele skuteczniejszym sposobem eliminacji komórek patogenów oraz zmienionych patologicznie komórek organizmu jest immunofagocytoza, w której udział biorą m. in. związane z błoną komórkową jako opsoniny składniki dopełniacza. Mimo to osoby z defektem genetycznym dotyczącym któregoś ze składników dopełniacza cechują się znacznie niższą odpornością na zakażenia niektórymi bakteriami, np. Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrheae.

Końcowe składniki aktywacji dopełniacza, odkładające się w błonie komórkowej w ilościach podprogowych i nie powodując zabicia komórki, mogą stymulować proliferację komórek.

Mechanizmy chroniące bakterie przed litycznym działaniem dopełniacza stanowią:

• Ochronna rola komórkowych struktur powierzchniowych (lipopolisacharydów, białek powierzchniowych, otoczek)

• Proteolityczna degradacja białek dopełniacza

• Proteolityczna degradacja immunoglobulin

Funkcje składowych układu dopełniacza:

• Obrona przeciwzakaźna

• Opsonizacja (C3b i C4b)

• Zabijanie komórek bakteryjnych oraz zakażonych komórek gospodarza (C5b-9)

• Składniki C3a i C5a wykazują właściwości chemotaktyczne wobec monocytów i neutrofili (rekrutacja komórek zapalnych do strefy zapalenia i ich aktywacja)

Silne induktory stanu zapalnego to:

• Składniki dopełniacza C3a, C4a, C5a zwane anafilatoksynami

• Powodują dgranulację kom. tucznych i bazofilów i uwalnianie mediatorów anafilaksji

• Stymulują syntezę metabolitów kw. arachidonowego

• Powodują zwiększenie przepływu krwi, przepuszczalności naczyń włosowatych co ułatwia przechodzenie przez śródbłonek naczyń krwionośnych mediatorów istotnych z punktu widzenia trwającej reakcji zapalnej

Usuwanie kompleksów immunologicznych z krążenia umożliwia wygasanie odczynu zapalnego po usunięciu patogenu ze środowiska wewnętrznego ustroju. Kompleksy opsonizowane przez C3b mogą być usuwane z krążenia poprzez wiązanie do receptorów C1 krwinek czerwonych, które następnie transportowane z krwią do wątroby zostają usunięte przez fagocyty. U większości chorych z pierwotnymi niedoborami C1 i C4, rzadziej C2 występują choroby kompleksów immunologicznych

Układ dopełniacza umożliwia współpracę odp. swoistej z odp. nieswoistą:

• Wzmaganie odpowiedzi humoralnej - C3b i C4b połączone z kompleksem Ag-Ab są wiązane przez receptory CR2 na limfocytach B

• Rozwój pamięci immunologicznej - C3b i C4b połączone z kompleksem Ag:Ab są wiązane przez receptor CR3 na komórkach dendrytycznych.

Fragmenty białek układu dopełniacza wytworzone w czasie aktywacji wiążą się ze swoistymi receptorami na powierzchni komórek ukł. odpornościowego. Najlepiej poznano receptory dla białek opsoninowych CR3: CR1-CR4

CR1 - receptor dla C3b jest receptorem opsoninowym na granulocytach, monocytach makrofagach, uczestniczy w fagocytozie. Obecny na erytrocytach lub płytkach krwi może służyć do wiązania opsonizowanych kompleksów immunologicznych lub bakterii i transportowania ich do komórek jednojądrzastych lokalnego układu wątroby.

Układ dopełniacza może stanowić potencjalne zagrożenie dla organizmu gospodarza, gdyż w przypadku jego niekontrolowanej aktywacji może dojść do uszkodzenia tkanek. Ma to miejsce m. in. w chorobie Alzheimera, astmie oskrzelowej, kłębuszkowym zapaleniu nerek, myasthenia gravis, łuszczycy, reumatoidalnym zapaleniu stawów, udarze mózgu, a także we wstrząsie.

Aktywacja dopełniacza przez endotoksyny bakteryjne

Ednotoksyny (lipopolisacharydy) bakterii Gram (-) wyeksponowane na powierzchni mają zdolność aktywacji kaskady dopełniacza. Lipid A i oligosacharyd rdzeniowy aktywują dopełniacz na drodze klasycznej ale niezależnej od przeciwciał. Część polisacharydowa aktywuje dopełniacz na drodze alternatywnej.

W stanie wstrząsu septycznego masywna wewnątrzkomórkowa aktywacja dopełniacza przez endotoksynę bakteryjną i powstanie dużych ilości anafilatoksyn C3a i C5a odgrywa bardzo istotną rolę. Aktywacja i degranulacja granulocytów, bazofilów i mastocytów prowadzi do aktywacji kaskady układu krzepnięcia - powstawanie mikrozakrzepów w naczyniach prowadzi do uszkodzenia tkanki płucnej przez enzymy proteolityczne i wolne rodniki tlenowe.

Białka regulacyjne układu dopełniacza

• Czynniki regulujące obecne na błonach komórkowych - CR1, DAF, MCP, HRF

• Czynniki osoczowe - inhibitor C1, czynnik I, białko wiążace C4, czynnik H, inaktywatory anafilatoksyn, witronektyna, klasteryna, properdyna

• CR1, MCP, białko wiążące C4 i czynnik H są kofaktorami czynnika I rozkładającego C3b i C4b - tym samym inaktywują konwertazy C3 i C5

• Inhibitor C1 wiąże aktywny C1r i C1s blokując dalszą aktywację

• Czynnik I jest proteazą osocza rozkładającą C3b i C4b zarówno wolne jak i związane w konwertazach

• Czynnik H wiąże C3b i wspomaga czynnik I w hamowaniu konwertazy C3 drogi alternatywnej.

• Białko wiążące C4 przyspiesza zarówno spontaniczny jak i wywołany przez czynnik I rozpad konwertazy C3 drogi klasycznej

• Immunokonglutyniny są to autoprzeciwciała przeciwko związanym składnikom dopełniacza, głównie C3. Pojawiają się w następstwie zakażeń oraz w stanach zapalnych i mają zdolność aglutynacji pokrytych dopełniaczem cząsteczek i mikroorganizmów.

Czynniki obecne na komórkach są odpowiedzialne za wyłapywanie dopełniacza, zwłaszcza fragmentów powstających na skutek działania drogi alternatywnej. Umożliwia to obronę własnego organizmu przed aktywowanym spontanicznie dopełniaczem. Działanie drogi alternatywnej wynika z faktu iż drobnoustroje nie posiadają czynników hamujących dopełniacz. Czynniki występujące na komórkach to:

• Receptor dla dopełniacza C1R inaktywuje konwertazy poprzez rozkład C3b i C4b

• MCP - błonowy kofaktor białkowy wiąże C3b i C4b, jest obecny właściwie na wszystkich komórkach jądrzastych organizmu.

• DAF - czynnik przyspieszający rozkład, ang. degradation accelerating factor przyspiesza spontaniczny rozpad konwertaz C3 i C5 drogi klasycznej i alternatywnej aktywacji dopełniacza, drastycznie skracając czas ich trwania.

• HRF - czynnik restrykcji homologicznej wiąże C8 i C9, hamując tworzenie MAC.

Niektóre wirusy wykorzystują cząsteczki regulacyjne układu dopełniacza jako swoiste receptory umożliwiające im wniknięcie do komórki gospodarza. Np. wirus odry wykorzystuje MCP, echowirusy i wirusy Coxackie - DAF, a wirus Eppstein-Barr CR2.

Niektóre organizmy rozwinęły mechanizmy obrony przed dopełniaczem:

• Wirus krowianki syntetyzuje białko homologiczne do białka wiążącego C4

• Proteazy wydzielane przez kropidlaki, pierwotniaki i bakterie rozkładają składniki dopełniacza.

• Jad kobry zawiera czynnik CVF tworzący kompleksy CVF-Bb i CVF-BBC3b, które mają właściwości konwertazy C3 drogi alternatywnej. Nie podlega ona inaktywującemu wpływowi czynnika I i H i wywołuje niehamowaną aktywację dopełniacza.

Niedobory składników dopełniacza

Pacjenci z niedoborami składników dopełniacza mają zwiększoną wrażliwość na zakażenia bakteryjne oraz zwiększone ryzyko wystąpienia chorób autoimmunizacyjnych powodowanych przez kompleksy immunologiczne. Nawracające zakażenia bakteryjne występują w większości niedoborów:

• Paciorkowcowe (niedobór C3, czynnika H i I)

• Dwoinką zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych Neisseria meningitidis (niedobór C5 do C9, czynnika D, properdyny)

• Choroby autoimmunizacyjne na tle kompleksów Ag:Ab, np. toczeń, kłębkowe zapalenie nerek (niedobór C1q, C1r, C1s, C2, C4)

Obrzęk naczynioruchowy Quinckego - polega na niedoborze inhibitora C1, który oprócz czynnika C1 hamuje także plazminę, kalikreinę i aktywny czynnik XII i XIa. Dochodzi do powstania obrzęków, w przypadku zajęcia krtani zagrażających życiu.

Metody oznaczania dopełniacza

Poszczególne składowe możemy mierzyć zarówno oddzielnie, oznaczając ich poziom, jak i oceniając ich funkcję. Prawidłowy poziom składowych dopełniacza nie przesądza o ich funkcjonalnej aktywności. Całkowity poziom poszczególnych składowych dopełniacza jest mierzony za pomocą ELISA, RIA oraz precypitacji z wykorzystaniem swoistych przeciwciał. W testach czynnościowych wykorzystuje się krwinki opłaszczone przeciwciałem i dopełniaczem z wyłączeniem tej aktywności, której pomiar jest przedmiotem badań.

• Ocena całkowitej aktywności (C1-C9)

• Ustalenie stężenia surowicy, przy którym dojdzie do 50% lizy wystandaryzowanej zawiesiny erytrocytów opłaszczonych swoistym przeciwciałem.

• Radialna hemoliza (żel zawiera kompleksy erytrocyt-przeciwciało antyerytrocytarne, a z dołków dyfunduje badana surowica.

Immunodyfuzja radialna znalazła zastosowanie w oznaczaniu składowych C3b i C4 dopełniacza.

Wykonanie praktyczne:

Zestaw zawiera płytki wypełnione żelem zawierającym p/ciała o swoistości anty C3, oraz trzy standardy o różnym stężeniu C3 (Ref. I, Ref. II, Ref. III). Do dołków w żelu wprowadzamy po 2,5 ul standardów oraz badanych surowic. Inkubujemy płytki w komorze wilgotnej.

Odczyn wiązania dopełniacza, OWD

Jest to jeden z klasycznych odczynów, wbrew nazwie nie służy jednak do oznaczania składników dopełniacza. Metoda ta służy wykrywaniu kompleksów immunologicznych w badanej surowicy (z reguły wykrywamy w ten sposób przeciwciało), a polega na konkurencji dwóch układów: wskaźnikowego oraz badanego o dopełniacz. Układ wskaźnikowy stanowią erytrocyty baranie opłaszczone swoistym przeciwciałem, tzw. amboceptorem - jest to surowica królika immunizowanego erytrocytami barana. Układ badany zaś to poszukiwane przez nas przeciwciało i swoisty wobec niego antygen (lub odwrotnie). Badanie przeprowadzamy w kilku etapach:

1. Najpierw dodając do badanej na obecność przeciwciała antygenu (lub odwrotnie).

2. Następnie dodajemy ściśle wymiareczkowaną ilość dopełniacza, odpowiednią do ilości użytego w 1 etapie antygenu bądź przeciwciała.

3. Na samym końcu dodajemy erytrocyty opłaszczone amboceptorem.

Po kilku minutach inkubacji sprawdzamy czy pojawiła się liza tych erytrocytów - jeśli nie, wynik badania jest pozytywny. Dzieje się tak ponieważ jedynie kompleks immunologiczny złożony z antygenu i swoistego przeciwciała jest w stanie aktywować dopełniacz. Jeśli w pierwszym etapie doprowadziliśmy do utworzenia takich kompleksów, „zabiorą” one cały dodany dopełniacz erytrocytom baranim z amboceptorem. Tak związany dopełniacz, zajęty kompleksem immunologicznym nie wywoła w badanej próbie hemolizy.

Bardzo ważne w odczynie wiązania dopełniacza są trzy próby kontrolne, które zawsze musimy wykonać:

1. Kontrola właściwości antykomplementarnych surowicy, składająca się z badanej surowicy, erytrocytów barana z amboceptorem oraz dopełniacza. W prawidłowych warunkach w surowicy nie występują elementy wiążące dopełniacz, a więc może on zadziałać na krwinki i w kontroli występuje hemoliza.

2. Kontrola właściwości antykomplementarnych antygenu, złożona z roztworu 0,9% NaCl, antygenu, erytrocytów barana z amboceptorem oraz dopełniacza. W prawidłowych warunkach antygen może wiązać dopełniacz jedynie w połączeniu ze swoistym przeciwciałem, przez co dopełniacz jest „wolny” i działa na krwinki, w kontroli występuje hemoliza.

3. Kontrola sprawności układu wskaźnikowego, złożona z erytrocytów barana z amboceptorem oraz dopełniacza. W prawidłowych warunkach, kiedy cały układ „działa”, po związaniu się dopełniacza z opłaszczonymi amboceptorem krwinkami w kontroli następuje hemoliza.

OWD można także wykonać jako oznaczenie ilościowe, podając miano przeciwciał w surowicy krwi. Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce ostrego cuchnącego nieżytu nosa. Badanie wykonujemy przygotowując kolejne rozcieńczenia badanej surowicy od 1:10 (1:20) do 1:80 i trzy powyższe kontrole. Brak hemolizy w roztworach między 1:10 i 1:20 wskazuje na toczący się proces chorobowy.

Wykonanie praktyczne - odczyn lizy serologicznej:

Do próbówek odmierzyć po 0,25 ml:

1. krwinek owcy, amboceptora, dopełniacza

2. krwinek owcy, amboceptora, r-ru NaCl

3. krwinek owcy r-ru NaCl, dopełniacza

Inkubować w temp. 37 st. C przez 5 minut

Odczytać wynik badania - liza powinna wystąpić tylko w próbie 1, gdzie obecne są wszystkie składniki układu (analogicznie do w/w kontroli sprawności układu wskaźnikowego).

PS. Wszyscy czytający powyższą prelekcję stawiają piwo x-dandi'emu, bez którego ta produkcja na pewno by nie powstała.

---