1. Opisz czynniki wewnętrzne, zewnętrzne i analityczne wpływająca na
   jakość mięsnych produktów fermentowanych.

Na jakość mięsnych produktów fermentowanych wpływają czynniki:

• Wewnętrzne

• Rodzaj drobnoustrojów wchodzących w skład kultury starterowej

• Jakość surowców, dodatków

• Receptura

• Zawartość soli

• Zawartość sacharydów

• Stan rozdrobnienia

• I cos jeszcze ale nie mam

• Zewnętrzne

• Temperatura

• Wilgotność względna powietrza

• Szybkość przepływu powietrza

• Dym i dostępność tlenu

• Analityczne

• Stopień zakwaszenia i pH

• Aktywność wody

• Potencjał redox

• Zwięzłość

• Ubytek masy

I to raczej cała odpowiedź na to pytanie. Można dopisać, że:

Mikroorganizmy stosowane do produkcji fermentowanych wyrobów mięsnych to:

• bakterie kwaszące

• bakterie redukująco-aromatyzujące

• mikroflora powierzchniowa - pleśnie, drożdże, mikroflora mieszana

Bakterie kwaszące produkują kwasy z cukru zawartego w mięsie. Wytworzony kwas powoduje obniżenie pH co sprzyja żelowaniu, rozpadowi białek mięsa i nadaje kiełbasom stabilną konsystencję (Lactobacillius curratus). Niskie pH powoduje wzrost drobnoustrojów patogennych i gnilnych (E.coli, Salmonelli, Clostridium botulinum), np. w kiełbasie salami (pH <5,3), kiełbasie typu metka (pH >5,3).

Lactobacillus rozwijając się w farszu mięsnym, zużywa składniki pokarmowe, ich produkty przemiany materii uniemożliwiają rozwój innych mikroorganizmów. Z upływem czasu fermentacji, na skutek ich zbyt dużej liczby, nie rozwijają się i giną.

2. W których procesach technologii fermentacyjnych mają zastosowanie
fermentacje alkoholowe?

Fermentacja alkoholowa przeprowadzana jest przez drożdże i jest wykorzystywana do produkcji napojów alkoholowych oraz przy wypieku ciasta.

Istota fermentacji alkoholowej polega na przemianie cukru w alkohol i CO₂ pod wpływem drożdży.

Ogólny zapis fermentacji alkoholowej:

C₆H₁₂O₆+2ADP+2Pi->2C₂H₅OH+2ATP+2CO₂

C₆H₁₂O₆-glukoza

W przemyśle piekarskim fermentacja alkoholowa nadaje porowatą strukturę ciasta przez drożdże Saccharomyces cerevisiae. Celem jest spulchnianie ciasta przez wytworzony ditlenek węgla, który w postaci pęcherzyków nadaje ciastu strukturę gąbczastą (zwiększa objętość ciasta).

W przemyśle spirytusowym fermentacja alkoholowa występuje podczas fermentowania zacieru. Rozpoczyna się po dodaniu drożdży S. cerevisiae, trwa 2-3 doby w temperaturze 30^oC. Fermentowanie zacieru dzielimy na 3 etapy:

1. zafermentowanie (silne namnożenie drobnoustrojów)

2. fermentacja główna (wydzielanie CO₂ i rozkład maltozy)

3. dofermentowanie (hydroliza dekstryn, przekształcenie cukrów w etanol)

W przemyśle winiarski występuje fermentacja moszczu. Fermentacja ta jest trójfazowa i przebiega w temperaturze 10 - 25^oC.

Etapy fermentacji:

1. zafermentowanie

2. fermentacja burzliwa

3. dofermentowanie

Dla wina białego trwa 2-3 dni dla wina czerwonego 3-10 dni.

W przemyśle piwowarskim fermentacja alkoholowa występuje podczas fermentacji brzeczki. Zawarte w brzeczce cukry zmieniają się dzięki enzymom drożdży (Saccharomyces) w alkohol etylowy i CO₂. Fermentacja trwa 10 - 12 dni w temperaturze 5 - 8^oC w przypadku użycia drożdzy fermentacji dolnej i 15 - 20^oC w przypadku drożdży fermentacji górnej.

3. Gdzie maja zastosowanie bakterie mlekowe w przemyśle spożywczym?

1. W przemyśle mleczarskim są wykorzystywane do produkcji szczepionek (tzw. zakwasów) do produkcji serów (twarogowych i dojrzewających) masła, mlecznych napojów fermentowanych.

2. Do produkcji kiszonek spożywczych (ogórki, kapusta, oliwki, sałatki, soki warzywne, orientalne produkty)

3. Do produkcji wędlin fermentowanych

4. Do produkcji kiszonych pasz

5. W przemyśle farmaceutycznym do produkcji dekstranu, preparatów probiotycznych, szczepionek

6. do przemysłowej produkcji kwasu mlekowego

4. Co może być celem procesów biotechnologicznych?

Podstawowym celem współczesnej biotechnologii jest zmodyfikowanie mikroorganizmów i komórek roślinnych i zwierzęcych tak, aby procesy życiowe nowych organizmów były szybsze, wydajniejsze, tańsze i dostarczały nowych metabolitów

Cele:

1. Rolnictwo i produkcja żywności:

• Zwiększenie odporności na szkodniki i choroby, szczególnie wirusowe, co umożliwi ograniczenie ilości stosowanych chemikaliów w produkcji rolnej i podczas magazynowania

• Przystosowanie roślin do ekstremalnych warunków, np.. zasolenia gleby, suszy, mrozów, krańcowych pH gleby,

• Stosowanie określonych preparatów chemicznych, które będą niszczyć chwasty, ale nie rośliny uprawne

• Poprawienie parametrów technologicznych upraw i hodowli (m.in. ich trwałości, zawartości tłuszczów i wody w produktach)

• Wzrost wydajności produkcji rolnej (zmniejszenie kosztów i energochłonności)

• Podnoszenie wartości odżywczej (np. zwiększenie zawartości aminokwasów niezbędnych w zbożach oraz roślinach strączkowych)

• Poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych

2. Ochrona zdrowia:

• Nowe metody diagnostyczne (analiza DNA)

• Produkcja hormonów i białek z zastosowaniem technik inżynierii genetycznej zamiast tradycyjnych metod

• Profilaktyka i leczenie nieuleczalnych dotąd chorób

3. Ochrona środowiska:

• Usuwanie zanieczyszczeń z wykorzystaniem mikroorganizmów (np. zanieczyszczeń ropą lub metalami ciężkimi)

• Monitorowanie skażeń

• Uruchamianie mikrobiologicznych oczyszczalni odpadów

4. Przemysł chemiczny:

• Produkcja rzadkich i cennych odczynników z zastosowaniem biosyntezy

• Wykorzystanie w różnych technologiach mikroorganizmów zamiast metod chemicznych (np. wybielanie papieru w papierniach)

5. Przedstaw mechanizmy regulacji biosyntezy metabolitów wtórnych przez mikroorganizmy na przykładzie biosyntezy antybiotyków.

Mechanizmy regulacji metabolicznej decydują o:

-inicjacji procesu biosyntezy

-kontroli jego szybkości, wydajności i czystości chemicznej produktu

-zakończeniu procesu biosyntezy

Na produkcję metabolitów wtórnych uwalnianych do środowiska, w tym antybiotyków, mają wpływ:

-wyczerpywanie się składników podłoża

-nagromadzenie produktów toksycznych

-nieodwracalna inaktywacja lub degradacja enzymów

-zahamowanie syntezy (resyntezy) enzymów

W inicjacji biosyntezy idiolidów w idiofazie poprzez derepresję specyf. enzymów szlaku biosyntezy podstawową rolę odgrywa wyczerpanie się w podłożu łatwo przyswajalnych składników pożywki, tj.

-glukoza lub inne łatwo przyswajalne źródła C i energii

-jon amonowy

-jon fosforanowy

Mechanizmy represji (derepresji) katabolicznej w biosyntezie antybiotyków:

-efekt glukozowy

-represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu amonowego w podłożu

- represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu fosforowego w podłożu

(stężenie nie powinno przekraczać 10 mmol/dm3, a czasami powinno wynosić nawet < 1 mmol/dm3)

Mechanizmy sprzyjające syntezie antybiotyków (autoregulatory):

-czynnik A (lakton kwasu 2-izokapronoilo-3-hydroksymetylo-4-hydroksybutanowego wytw. przez szczepy Streptomyces griseus prod. streptomycynę)

Proces biosyntezy antybiotyków:

-prowadzenie hodowli drobnoustrojów w bioreaktorze z mieszaniem i napowietrzaniem, w podłożu zapewniającym pełne wykorzystanie metaboliczne potencjału szczepu produkcyjnego

-podstawowym składnikiem podłoża jest źródło węgla i enzymów, wykorzysta. do namnażania kom. i syntezy produktu monosacharydy i disacharydy (sacharoza i laktoza)

-źródło azotu: sole amonowe, woda amoniakalna, najczęściej mąka sojowa lub kukurydziana oraz namok kukurydz.

-zestaw soli mineral.

-CaCO3 jako czynnik neutralizujący powstanie kwasów org.

-podłoża produkcyjne mogą zawierać specjalne składniki tj. czynniki wzrostu (wybrane aa-y i wit.); prekursory produktu końcowego.

Proces biosyntezy przebiega głównie w 2 etapach:

-w fazie wzrostu (trofofaza)- wykorzysta. źródeł węgla i energii, intensywne procesy metaboliczne

-faza przejściowa- zaczynają być syntetyzowane enzymy odpowiedzialne za syntezę penicyliny

-głównie w fazie produkcyjnej (idiofazie) prod. jest głównie penicylina

6. Na czym polega produkcja szczepionek przemysłowych?

Produkcja szczepionek przemysłowych polega na:

-namnożeniu szczepów składowych w optymalnych środowiskach hodowlanych;

-uzyskaniu dużej liczby kom. w stanie pełnej aktywności bichem.;

-standaryzacji składu gatunkowego, tj. zestawienia właściwych proporcji gatunków czy szczepów stanowiących o przydatności szczepionki w warunkach produkcyjnych (podczas konstrukcji szczepionek wieloskładnikowych);

-zabezpieczaniu żywotności kom. i ich właściwości biochem. poprzez odp. utrwalanie szczepionki.

7. Znaczenie biotechnologii dla współczesnego społeczeństwa

Biotechnologia jest najstarszym kierunkiem gospodarczej działalności człowieka, pomimo, że sam termin został wprowadzony w naszych czasach. Już 7 tyś. Lat temu najstarszymi technikami biotechnologii były: wypiek chleba, wyrób produktów mlecznych, produktów fermentacji - wino, piwo. Wyróżniamy 3 okresy:

- okres przedpasteurowski do XIX w. Człowiek wykorzystywał mikroorganizmy i mechanizmy do produkcji, nie mając świadomości o ich istnieniu.

- okres przejściowy II poł. XIX w. do lat 40 XX w. Była to era mikrobiologicznych początków współczesnej biotechnologii, wykorzystującej czyste kultury drobnoustrojów w warunkach aseptycznych. L. Pasteur udowodnił, że drożdże fermentują cukier.

- era nowoczesnej biotech. od lat 40 XX w. wiązała się z uruchamianiem wielkoprzemysłowej produkcji antybiotyków, witamin, nukleotydów, hormonów roślinnych takich jak gibereliny, leków steroidowych. Do produkcji wyosobniono z naturalnego środowiska wydajne szczepy mikroorg. i ulepszono je przez stosowanie mutagenizacji. Nowoczesne metody genetyczne rozwinięto w latach 70.

Biotechnologia ma szerokie zastosowanie. Wykorzystywana jest w wielu dziedzinach:

- W przemyśle stosowana jest biała biotechnologia. Wykorzystuje ona żywe kom. np. pleśni, drożdży czy bakterii oraz enzymy do wytwarzania nowych produktów i inicjowania procesów przetwórczych. Mikroorganizmy wykorzystywane w białej biotechnologii są zwykle zmodyfikowane przy zastosowaniu inżynierii genet. Ulepszane w ten sposób kom. mikroorg. pracują jako komórkowe fabryki w bioreaktorach produkując np. liczne enzymy. W przemyśle spożywczym biotechnologia wykorzystywana jest do ulepszania żywności, produkcji witamin, kultur podstawowych i zakwasów. W przemyśle chemicznym wykorzystywana jest w katalizie enzymatycznej, bioenergetyce, biotransformacjach, bioplastiku.

- W medycynie jest stosowana czerwona biotach. Wykorzystuje się ją przy tworzeniu nowych leków w diagnostyce, profilaktyce i leczeniu dotychczas nieuleczalnych chorób. Ulepszone mikroorg. wytwarzają antybiotyki, witaminy, szczepionki i białka na użytek medycyny. Preparaty biotechnologiczne stanowią obecnie ok. 20% sprzedawanych leków i ok. 50% nowych, badanych leków

- W rolnictwie stosowana jest biotech. zielona. Wykorzystywana jest do: ulepszania gatunków roślin uprawnych o dużym znaczeniu gospodarczym, wytworzenia nowych, korzystnych cech roślin umożliwiających im przetrwanie, podnoszenia wartości odżywczej lub przetwórczej. Stosując modyfikacje genetyczne roślin można nadać im różne cechy np.: odporność na herbicydy, odporność na szkodniki i choroby. Można także uzyskać wiele korzyści: polepszenie składu aminokwasów białek, polepszenie barwy owoców, wprowadzenie białek odżywczych lub funkcjonalnych, usunięcie alkaloidów, wzbogacenie w Wit. C. Biotechnologia wykorzystywana jest także do klonowania zwierząt oraz nadawania im różnych cech.

- W ochronie środowiska biotech. wykorzystywana jest w oczyszczalniach ścieków i utylizacji odpadów.

8. Modyfikacje genetyczne surowców roślinnych wpływające na jakość żywności i ułatwiających procesy przetwórcze.

Zadaniem biotechnologii jest m.in. zwiększenie i polepszenie tradycyjnej produkcji roślinnej. Dąży się do zwiększenia wydajności plonowania, przez:

-zwiększenie odporności roślin uprawnych na: chemiczne środki ochrony, niesprzyjające warunki, szkodniki, choroby i herbicydy;

-zwiększenie zawartości aminokwasów niezbędnych w podstawowych frakcjach białek zbóż oraz roślin strączkowych (modyfikacji genów strukturalnych w kierunku wprowadzenia dodatkowych kodonów biorących udział w biosyntezie metioniny lub lizyny);

-wprowadzenie do genomu rośliny genów kodujących biosyntezę białek o korzystniejszej wartości biologicznej i lepszych właściwościach funkcjonalnych, a nawet leczniczych;

-zmniejszenie kosztów i energochłonności produkcji rolnej przez zwiększenie wydajności fotosyntezy (genetycznego doskonalenia enzymów, które powodują asymilacje CO2 oraz

białek chloroplastowych, w celu zwiększenia ich poziomu w komórce i aktywności biologicznej);

-zwiększenie biologicznego wiązania azotu i jednoczesne ograniczenie strat azotu w procesach nitryfikacji i denitryfikacji (pszenica, kukurydza) ;

Doskonalenie składu chemicznego i właściwości użytkowych roślin jest przedmiotem badań genetyków od dawna. Przykładem efektów tych prac są wyhodowane w Polsce, z udziałem technik genetyki mendlowskiej, odmiany rzepaku "dwuzerowego". Nasiona tych odmian nie zawierają związków wolotwórczych, a w składzie frakcji olejowej nie występuje kwas erukowy. Innym przykładem jest wyhodowanie pszenżyta, zboża o dobrej plenności w polskich warunkach klimatycznych oraz dużej przydatności technologicznej. Postęp w biologii molekularnej oraz opanowanie technik inżynierii genetycznej zwiększyło możliwości polepszenia składu chemicznego oraz właściwości roślin stosowanych w technologii żywności.

Istnieje sporo przykładów wyhodowania roślin transgenicznych, których nowe właściwości wychodzą naprzeciw zainteresowaniom technologów żywności.

Przykładem sa ziemniaki transgeniczne:

1uzyskano zwiększenie zawartości skrobi w bulwach; 2odmiany transgeniczne, u których występuje wyłącznie amylopektyna są surowcem bardziej przydatnym w technologii krochmalu; 3 mała zawartość sacharydów redukujących oraz zwiększony poziom cyklodekstryn; 4 wyhodowano odmiany u których zmniejszono aktywność oksydazy polifenolowej odpowiedzialnej za ciemnienie miąższu; 5 zmniejszeni zawartości alkaloidów pogarszających smak bulw; 6 odporne na stonkę (gen z bakterii Bacillus thuringensis).

Innym przykładem dokonań inżynierii genetycznej, o dużym znaczeniu praktycznym, są odmiany pomidorów transgenicznych:

1 uzyskano odmiany pomidorów odpornych na choroby grzybicze, bakteryjne, wirusowe; 2 pomidory charakteryzujące się tolerancją na herbicydy, np. glufosiat (Basta) i glifosat (Roundup); 3 owoce charakteryzujące się brakiem aktywności poligalakturonazy -owoce pomidorów modyfikowanych w ten sposób, nie miękną podczas dojrzewania, są odporne na marszczenie i pękanie podczas tzw. przejrzewania, maja także lepsze właściwości przetwórcze, otrzymuje się z nich więcej koncentratu; 4 częściowo zahamowano aktywność esteraz pektynowych -owoce tych pomidorów mają większą zawartość suchej substancji.

Obok regulacji syntezy substancji zapasowych celem modyfikacji genetycznych jest ulepszanie cech organoleptycznych i wartości żywieniowej roślin, np. modyfikowanie składu aminokwasowego białek roślinnych, ilości i jakości kwasów tłuszczowych w oleju rzepakowym lub biosyntezy karotenoidów. Większość właściwości roślin można szybko zmienić stosownie do wymagań technologii ich przetwarzania. W przyszłości można oczekiwać bardziej kompleksowych zmian właściwości w kierunku łączenia cech technologicznych, żywieniowych i leczniczych.

9. Przedstaw argumenty przeciwników i zwolenników GMO oraz przedstaw swoją opinię i uzasadnij.

GMO, czyli organizmy zmodyfikowane genetycznie to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje, których geny zostały celowo zmienione przez człowieka. Rekombinacja DNA i inne pokrewne techniki pozwalają tworzyć organizmy o odmiennych właściwościach niż macierzy gatunek.

CO ZA?

Modyfikowane genetycznie organizmy to poprawa cech jakościowych: opóźnienie dojrzewania i większa trwałość owoców, lepsze mięso i mleko. Mają one też większe wartości odżywcze. Są bogate w dodatkowe witaminy, mikroelementy, białko, większa zawartość glutenu w pszenicy poprawia jakość mąki. Następuje poprawa cech organoleptycznych roślin: intensywny zapach, wybarwienie i nowe kolory kwiatów, lepszy smak i aromat kawy. Modyfikacje mają również na celu wytworzenie białek wykorzystywanych jako leki - bioreaktory. Uodparniają na choroby wirusowe, bakteryjne, owady, herbicydy.

Konkretne korzyści wynikające dla konsumentów to: pomidor o niższej zawartości wody, ziemniak odporny na stonkę ziemniaczaną, słodka kukurydza, sałata odporna na mróz, rzepak i buraki o korzystnym składzie kwasów tłuszczowych.

Głównym założeniem twórców roślin transgenicznych było zmniejszenie kosztów uprawy oraz ograniczenie często stosowanych przez rolników pestycydów. Uprawy transgeniczne miały także zmniejszyć liczbę głodujących. Narastające kontrowersje wokół GMO zmieniły jednak entuzjastyczne prognozy.

CO PRZECIW?

Przeciwnicy GMO też mają swoje poważne argumenty. Stosowanie wbrew zakazom genów oporności na antybiotyki jako genów pomocniczych; może spowodować uodpornienie się na antybiotyki flory bakteryjnej przewodu pokarmowego konsumentów. Wprowadzenie upraw transgenicznych, czyli monokulturowych, staje się zagrożeniem dla istniejącej w środowisku bioróżnorodności, stanowiącej zabezpieczenie żywnościowe, która pozwala na adaptację do zmian środowiskowych. Produkowane przez rośliny transgeniczne toksyczne białko jest silnie alergizujące; wbrew zakazom jego obecność stwierdzono w produktach dla dzieci (Gerber), chipsach, kukurydzy StarLink Pyłki roślin modyfikowanych (zawierające alergeny) mogą krzyżować się z normalnymi roślinami, umożliwiając przeniesienie niektórych niepożądanych genów, wywołując nieoczekiwane efekty, np. powstanie superchwastów, dzięki genom oporności na pestycydy. Człowiek jako potencjalny konsument organizmów transgenicznych jest w dużej mierze narażony na procesy niepożądane w jego organizmie (może spowodować zakłócenie w funkcjonowaniu istotnych dla życia organizmu genów).

Jednak 300 mln osób na świecie spożywa żywność transgeniczną mimo sprzeciwu organizacji ekologicznych, w tym Greenpeace. Jako zagrożenie dla życia ludzi podaje ona: toksyczność, wzrost ryzyka zachorowania na nowotwory i alergie. Są także przeciwni uwalnianiu do środowiska żywych organizmów transgenicznych, takich jak materiał siewny czy sadzeniaki. Rozprzestrzeniając się, w konsekwencji mogą wyprzeć uprawy ekologiczne, prowadząc do nieodwracalnych skutków. Bez długotrwałych i dokładnych testów nie można jednoznacznie stwierdzić, czy zmodyfikowane pożywienie jest w pełni bezpieczne.

Jeśli chodzi o opinię to wykażcie się swoją inwencją twórczą i napiszcie na podstawie ww. argumentów co myślicie na temat GMO, żeby nie było, że tacy jednomyślni wszyscy jesteśmy

10. Budowa cząsteczki DNA.

Cząsteczka DNA zbudowana jest z trzech podstawowych składników:

-cukru - pentozy,

-reszty kwasu fosforowego,

-aromatycznej zasady azotowej

Połączenie pentozy, którą w przypadku DNA jest deoksyryboza, z zasadą azotową nazywane jest nukleozydem. Zasady wchodzące w jego skład to dwupierścieniowe puryny: adenina (A) i guanina (G) lub jednopierścieniowe pirymidyny: cytozyna (C) i tymina (T). Gdy do nukleozydu zostanie dołączona reszta fosforanowa powstaje jeden z czterech nukleotydów (podstawowa jednostka monomeryczna): deoksyadenozynomonofosforan (dAMP), deoksyguanozylomonofosforan (dGMP), deoksycytydynomonofosforan (dCMP) lub deoksyurydynomonofosforan (dUMP).

Między nukleotydami tworzą się wiązania 3'-5'-fosfodiestrowe, dzięki którym powstaje polinukleotyd DNA. Łańcuch polinukleotydowy ma dwa końce 5'- zakończony wolnym 5'fosforanem i koniec 3'- z wolną grupą hydroksylową, dzięki temu jest polarny.

Informacja genetyczna jest zawsze odczytywana od końca 5' w kierunku 3'.

W 1953 roku Watson i Crick odkryli i opisali strukturę DNA jako podwójną, prawoskrętną helisę. Jest ona złożona z dwóch, komplementarnych, biegnących
w przeciwnych kierunkach i wzajemnie oplatających się polinukleotydów. Każdy łańcuch DNA niesie taką samą informację genetyczną. Na zewnątrz helisy jest szkielet zbudowany
z części cukrowo-fosforanowej mającej charakter polarny, natomiast płaskie cząsteczki zasad azotowych są umiejscowione wewnątrz i są hydrofobowe (rysunrk 1). Pomiędzy dwoma łańcuchami polinukleotydów jest ciągłe oddziaływanie. Sposób, w jaki zasady łączą się
w pary nazywany jest komplementarnym parowaniem zasad. Dwupierścieniowe puryny tworzą wiązania wodorowe z jednopierścieniowymi pirymidynami, przy czym tymina tworzy z adeniną podwójne wiązanie wodorowe, natomiast cytozyna z guaniną potrójne wiązanie. Wynika z tego, że jedna nić DNA jest komplementarna do drugiej, co umożliwia wykorzystanie jednej nici do replikacji drugiej. Stanowi to mechanizm niezbędny do zachowania i przekazywania informacji genetycznej.

Struktura DNA jest bardzo regularna. Badania nad II rzędową strukturą wykazały, że średnica podwójnego heliksu ma 2 nm, na każdy obrót przypada 10 par zasad a jej skok wynosi 3,4 nm. W budowie helisy można dostrzec małe i duże bruzdy (rowki), które odgrywają ważną rolę w interakcji z białkami, replikacji DNA oraz ekspresji informacji genetycznej. Wyróżniamy jeszcze III rzędową strukturę DNA jest to tzw. superheliks. Powstaje on poprzez skręcenie podwójnej helisy, czyli II rzędowej struktury DNA.

W komórkach, DNA jest upakowane w postaci chromosomów. Jest to forma, dzięki której nić DNA ulega 10 000-krotnemu skróceniu. Jest to niezmiernie ważne, ze względu na konieczność umieszczenia dużej ilości materiału genetycznego w małej komórce. Całkowita długość DNA w nie dzielącej się komórce wynosi ok. 1metra, dlatego potrzebny jest system, który nie tylko skondensuje materiał genetyczny do mniejszej formy, ale także zrobi to w sposób uporządkowany, by nie doprowadzić do splątania nici. Pierwszy poziom upakowania DNA w chromosomie polega na tworzeniu nukleosomów połączonych ze sobą odcinkami DNA łącznikowego. Każdy nukleotyd składa się z rdzenia zbudowanego z dwóch dysków zawierających 4 białka histonowe: H2A, H2B, H3 i H4. Na taki oktamer nawiniety jest odcinek DNA o długości 146 par zasad. Histon H1, leżący na zewnątrz nukleosomu, działa jak klamra, spinając cały kompleks. Odcinki łącznikowe DNA zbudowane są średnio
z 55 par zasad. Wyższy poziom upakowania zależy w dużej mierze od histonów H1. Może on spowodować zawinięcie się pojedynczego łańcucha nukleosomów w strukturę zwaną solenoidem. Ma on budowę helisy, o średnicy około 30 nm, gdzie na jeden obrót przypada 6 nukleosomów.

Rysunek 1-Schemat budowy DNA

11. Wyjaśnij pojęcie kod genetyczny

Kod genetyczny to zasada, reguła, według której informacja genetyczna, zawarta w sekwencji nukleotydów kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), w komórkach wszystkich organizmów może ulegać "tłumaczeniu" na kolejność (sekwencję) aminokwasów w ich białkach (w procesie biosyntezy białek czyli translacji). Kod ten ma następujące właściwości:

1. Jednemu aminokwasowi w białku odpowiada jedna trójka nukleotydów (triplet, inaczej kodon) w DNA lub RNA. Kod genetyczny jest więc kodem trójkowym.

2. Prawie wszystkie aminokwasy mogą być zakodowane na kilka sposobów, tj. przez kilka różnych kodonów, różniących się na ogół tylko trzecim nukleotydem. Dzięki temu część zmian informacji genetycznej w wyniku mutacji nie znajduje swojego odbicia w sekwencji aminokwasów. Kod genetyczny jest więc zdegenerowany.

3. Każdy nukleotyd w obrębie sekwencji kodujących wchodzi w skład jakiegoś kodonu i tylko jednego kodonu - kod genetyczny jest bezprzecinkowy. toteż wypadnięcie lub włączenie jednego dodatkowego nukleotydu zmienia kod w całym łańcuchu DNA (mutacje).

4. Ponadto kodony nie zachodzą na siebie, tzn. trójki odczytywane są kolejno i jedna nie zachodzi na drugą.

5. Powyższe zasady są przestrzegane dość dokładnie przez układy biosyntezy białek u wszystkich organizmów - kod genetyczny jest uniwersalny, jakkolwiek zdarzają się niewielkie odstępstwa od tej prawidłowości wśród wirusów, bakterii, pierwotniaków, grzybów i w mitochondriach.

6. kod nie jest dwuznaczny, ponieważ pojedynczy kodon nigdy nie wyznacza więcej niż jednego aminokwasu.

Odczytywanie kodu genetycznego przy syntezie białek nie odbywa się bezpośrednio na DNA; sekwencje nukleotydowe DNA są kopiowane na cząsteczki RNA (transkrypcja), a następnie na podstawie ich sekwencji jest syntetyzowane białko (translacja).

Zachodzące w procesie translacji dopasowanie kodonu w mRNA z odpowiadającym mu antykodonem w tRNA (cząsteczce dostarczającej aminokwas) nie zawsze musi być idealne. Zgodnie z zasadą tolerancji (hipotezą tolerancji) zawsze musi być zachowana jedynie zgodność (komplementarność) pomiędzy dwoma pierwszymi nukleotydami kodonu i antykodonu. Na ostatniej pozycji kodonu dopuszczalne jest czasami wiązanie tRNA przez nukleotyd niekomplementarny.

Złamanie kodu genetycznego jest jednym z największych osiągnięć biologii. Wczesne próby poznania jego natury polegały na rozważaniach teoretycznych i eksperymentach genetycznych. W 1964 roku poznano cały kod genetyczny. Spośród 64 tripletów nukleotydowych 61 wyznacza aminokwasy; każdy z kodonów odpowiada tylko jednemu aminokwasowi. Jeden z tych tripletów (ATG w DNA i - odpowiednio - AUG w RNA) ma podwójne zadanie. Koduje aminokwas metioninę oraz wyznacza początek sekwencji kodującej białko - jest to tak zwany kodon start. Trzy triplety: TAG (UAG), TAA (UAA) i TGA (UGA) nie wyznaczają żadnego aminokwasu, natomiast każdy z nich sygnalizuje zakończenie sekwencji kodującej białko - są to kodony stop.

12. Wyjaśnij mechanizm dziedziczenia cechy na przykładzie jednej pary genów z dwoma allelami przy dominacji jednego z nich.

AA-allel dominujący warunkujący czerwoną barwę kwiatów

aa-allel recesywny białej warunkujący białą barwe kwiatów

F-pokolenia potomne

G- wytworzenie gamety

P-pokolenie rodzicielskie

P1: AA x aa

↓

G: A x a

↓

F₁: Aa

↓

P2: Aa x Aa

↓

G: Aa x Aa

↓

F₂: AA, Aa ,Aa ,aa

Fenotypowo - 3:1

Genotypowo - 1:2:1

Z pary alleli AA, które posiadał osobnik rodzicielski o czerwonej barwie kwiatów do gamety wchodzi tylko jeden z nich, z kolei od osobnika o białych kwiatach z pary alleli aa do gamety wchodzi tylko jeden z nich . W ten sposób po zapłodnieniu w zygocie znajdą się dwa allele, genotyp Aa osobnika z pokolenia F₁ oznacza że jest on heterozygotą . Ponieważ allel A dominuje zupełnie nad a, całe pierwsze pokolenie mieszańców F₁, będzie miało czerwone kwiaty . W krzyżówce pokolenia F₁ dwóch mieszańców , których hteterozygoty różnią się, ponieważ do połowy z nich wchodzą allele barwy białej(a) i czerwonej(A). Ponieważ przenoszenie ziaren pyłku ma charakter losowy, należy stwierdzić, że to, jaka gameta żeńska zostanie zapłodniona przez gametę męską jest kwestia przypadku . Wyniki krzyżowania F₁xF₁ można przedstawić następująco:

G /G	A p=0,5	a p=0,5
A p=0,5	AA	Aa
a p=0.5	Aa	aa

Jeśli przyjąć że w heterozygocie Aa prawdopodobieństwo (p) wejścia do gamety alleluA=0,5(50%) szans, allelu a także=0,5(50%) szans to można przewidzieć jakie uzyskamy wyniki w pokoleniu F₂ (tabela).

13. Techniki klonowania DNA i przenoszenia do innych organizmów.

Techniki klonowania DNA

Klonowanie DNA jest procesem dostarczającym homogennej populacji fragmentów DNA uzyskanych z mieszaniny bardzo różnych cząsteczek DNA, lub też z całego DNA. By to osiągnąć potrzebne są odpowiednie metody pozwalające na identyfikację z odpowiedniego regionu genomu, na oddzielenie go od innego DNA, a także na jego selektywne powielanie - sklonowanie. Wybrane sekwencje DNA mogą być powielane dwoma podstawowymi sposobami: 1) w komórkach-klonowanie w systemie komórkowym; 2)w systemie bezkomórkowym-łańcuchowa reakcja polimeryzacji,PCR.

Klonowanie w systemie komórkowym:wymaga wykonania 4początkowych etapów.

1.otrzymanie zbioru różnych fragmentów DNA przez przecięcie pożądanego DNA przy użyciu enzymu restrykcyjnego. 2.otrzymane fragmenty DNA łączone są z fragmentami DNA zawierającymi miejsce startu replikacji(OR), który umożliwia ich replikację. W tym Momocie, możliwe jest połączenie fragmentu DNA z markerem selektywnym, np. odporności na antybiotyk. 3. rekombinowane cząsteczki DNA wprowadzane są do komórek gospodarza(np.kom.bakteryjnej lub drożdżowej). W kom. gospodarza cząsteczki DNA mogą replikować się niezależnie od genomu gospodarza. 4.komórki gospodarza transformowane rekombinowanym DNA poddawane są hodowli i namnażaniu(propagacja).5.selektywny wzrost jednego z klonów komórkowych pozwala na jego wyizolowanie i poddanie dalszej analizie. 6.zbiór różnych fragmentów sklonowanego DNA nazywany jest biblioteką klonów.

W klonowaniu systemem komórkowym cząsteczki DNA zawierające replikon nazywa się cząsteczkami wektora.

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji(PCR)jest bezkomórkową, szybką i czułą metodą klonowania fragmentów DNA. Polega na powielaniu in vitro określonych sekwencji wyjściowego DNA, co możliwe jest nawet w przypadku dysponowania bardzo niewielkimi ilościami materiału, lub dysponowania materiału pochodzącego z odległej przeszłości. Selektywne powielanie wymaga wcześniejszego posiadania informacji na temat sekwencji DNA ograniczjacego powielaną sekwencję. Na podstawie tej informacji produkuje się 2oligonukleotydowe startery, które są komplementarne do sekwencji graniczących z końcami 3' powielanego fragmentu, z którym wiążą się ściśle w odpowiednich warunkach.

PCR jest reakcją łańcuchową, ponieważ nowo zsyntetyzowana nić DNA służy jako matryca do dalszej syntezy DNA w ciągu kolejnych 25-35cykli. Teoretycznie każdy z cyki podwaja ilość powielanego DNA. Każdy cykl obejmuje 3etapy:1.denaturację dwuniciowego DNA w temp.93-95^oC w przypadku ludzkiego DNA;2.przyłączenie startera w temp.50-70^oC, zależnej od oczekiwanej temp.topnienia dupleksu DNA;3.syntezę DNA przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA.

Wektory plazmidowe(pBR322) wykorzystywane do klonowania.są zwykle używane do klonowania małych fragmentów.

Przenoszenie DNA do innych organizmów

Przenoszenie DNA zachodzi nie tylko przez fuzję gamet w procesie reprodukcji, ale także pomiędzy innymi kom.org.prokariotycznych i eukariotycznych(koniugacja bakterii, transdukcja bakterii przez plazmidy, transfekcja hodowli kom.eukariotycznych).Kom.zmienione genetycznie nazywa się transformatami, termin ten odnosi się do rezultatu a nie mechanizmu.

1.transdukcja przy użyciu wirusów jest to nowy rodzaj rekombinacji pomiędzy dwoma szczepami bakterii. Mały fragment DNA chromosomu bakteryjnego zostaje przeniesiony przez faga do innej kom.bakt.(transdukcja).

2.transformacja przy użyciu plazmidów, które są małymi, niezależnie replikującymi, kolistymi cząsteczkami DNA niepołączonymi z chromosomem kom.bakt. Plazmidy często zawierają geny oporności antybiotykowej, ich wbudowanie do kom. wrażliwej przekształca ją w oporną na antybiotyk(transformacja).

3.powielanie fragmentu DNA przy użyciu transformowanych bakterii. Plazmidy są dobrze przystosowane do przenoszenia DNA jako wektora. Dzięki temu przy użyciu selektywnych podłóż możliwe jest wyodrębnienie szczepów bakterii, które mają wbudowany zrekombinowany plazmid zawierający fragment DNA będący przedmiotem badań.

4.transformacja przy użyciu DNA jest to przeniesienie DNA pomiędzy kom. eukariotycznymi w hodowli, może być stosowana do badania mechanizmu przekazywania różnych cech genetycznych(analiza transfekcji).

14. Zastosowanie klonowania DNA.

1. Identyfikacja genów związanych z procesami chorobotwórczymi (np. hemofilia, dystrofia mięśni, nowotwory)

2. Mapowanie genomu

3. Zrekombinowane białka (np. produkcja insuliny, czynnika VII odp. za hemofilię)

4. GMO

4.1 bardzo ważną dziedziną opartą na genetyce jest klonowanie. Jest to metoda pozwalająca na namnożenie DNA a właściwie jego odcinków, w celu wykorzystywania ich później do badań. Wyizolowane z komórki organizmu dawcy, za pomocą enzymów restrykcyjnych, DNA jest następnie poddawane działaniu technik elektroforetycznych, pozwalających rozdzielić uzyskane fragmenty, a następnie wyizolować dany fragment. Wprowadzenie takiego odcinka do organizmu odbywa się za pomocą tzw. wektorów, czyli stosunkowo niewielkich cząsteczek DNA mogących replikować się autonomicznie w danych komórkach lub integrować z chromosomem biorcy. Biorcami obcego DNA są zazwyczaj komórki bakteryjne, wektorami zaś plazmogeny (geny zlokalizowane poza obrębem jądra komórkowego, tj.: w cytoplazmie, mitochondriach i plastydach) lub odpowiednio zmodyfikowane bakteriofagi. Po wprowadzeniu sklonowanego genu do komórek bakteryjnych następuje jego ekspresja.

4.2 W ostatnich latach duży postęp zrobiono w kwestii klonowania zwierząt. Możliwe jest wykorzystanie tego faktu przy przeszczepach narządów. Zmodyfikowanie białek enzymatycznych, przez które transplantowane organy zwierzęce zostają odrzucone przez reakcję ludzkiego układu odpornościowego, zmniejszyłoby ryzyko takiego właśnie odrzucenia. Wszystkie takie badania są jednak niestety bardzo kosztowne i napotykane są różne problemy techniczne.

15. Metody tworzenia roślin transgenicznych.

Modyfikowane genetycznie są głównie rośliny mające duże znaczenie gospodarcze, zmiana genomu ma na celu nadanie im pożądanych przez człowieka cech, tj. większa trwałość, odporność na szkodniki, wirusy i grzyby, herbicydy (środki ochrony roślin), podniesienie ich cech jakościowych, np. lepszego smaku. Modyfikuje się także rośliny ozdobne, które dzięki temu są trwalsze, mają intensywniejszy kolor. Zmodyfikowane genetycznie zostało większość roślin mających znaczenia dla człowieka.

Aby otrzymany organizm był transgeniczny, należy:

• wprowadzić do niego kawałek DNA, który pochodzi od obcego organizmu nim jakiś organizm zostanie genetycznie zmieniony, transformowany,

• należy posiadać fragment materiału genetycznego, który pochodzi z innego organizmu. Może on zostać wycięty z większego fragmentu DNA, dzięki enzymom restrykcyjnym. Są to cząsteczki białek, które potrafią przecinać nić DNA, częstokroć czynią to w specyficznym miejscu, dzięki czemu możliwe jest wycięcie takiego fragmentu jaki jest potrzebny.

• tak przygotowany materiał jest wprowadzany do roślin.

Ten fragment najczęściej zwiera informację (koduje) cząsteczki białka, które będą wykorzystane przez organizm. Samo wprowadzenie materiału genetycznego nie jest łatwe. Metody, którymi biotechnologowie się posługują by tego dokonać bywają odmienne w odniesieniu do roślin i zwierząt.

Przedstawione poniżej metody dotyczą modyfikacji roślin.

1. Metoda z wykorzystaniem wektora.
W tej metodzie, jak sama nazwa wskazuje, wykorzystuje się wektory do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych. Są nimi bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. Te mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Naukowcy potrafią usunąć geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, a na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego gatunku. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens.
Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem.

2. Metody bez wykorzystania wektora.
Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych. Pozwalają one na transformowanie dowolnych roślin. Nim fragment będzie mógł być wprowadzony do komórki gospodarza, ta musi być pozbawiona ściany komórkowej (oprócz mikrowstrzelowania). By to osiągnąć można poddać ją działaniu enzymów degradujących.
Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.

- Elektroporacja, fizyczna - polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.

- Mikrowstrzeliwanie, fizyczna - wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 - 5 mikrometra (0,0000005-0,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.

- Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenie do jej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.

- Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA.

- Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna

Rośliny transgeniczne (modyfikowane genetycznie) - przykłady

Kukurydza
- odporność na owady - wszczepiony został gen odpowiedzialny za wytwarzanie białka, które zjadane przez owada niszczy jego przewód pokarmowy co doprowadza do śmierci. Białko to "działa" tylko w organizmach niektórych, ściśle określonych gatunków owadów-szkodników, nie jest aktywne np. u człowieka.
- wytwarzanie substancji używanych do wyrobu leków lub szczepionek,

Ziemniaki
- wzrost zawartości skrobi, ponadto odmiany składające się wyłącznie z amylopektyny - u odmian tradycyjnych 20% skrobi to amyloza, którą usuwa się z ziemniaków przemysłowych co podnosi koszty,
- odporność na herbicydy, stonkę ziemniaczaną, wirusy,
- "słodkie ziemniaki" - wprowadzenie genu odpowiedzialnego za wytwarzanie słodkiego białka - taumatyny,
- odporność na ciemnienie pouderzeniowe - większa trwałość,
- mała zawartość glikoalkaloidów - substancji szkodliwych na człowieka, występujących w surowych ziemniakach.
Pomidory
- spowolnienie dojrzewania, większa trwałość
- większa zawartość suchej masy,
- poprawa smaku (?),
- intensywniejsza barwa, cieńsza skórka.
Truskawki
- wyższa słodkość owoców,
- spowolnienie dojrzewania,
- odporność na mróz.
Soja
- odporność na środki ochrony roślin - hrebicydy,
- odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki,
- obniżona zawartość kwasu palmitynowego.
Rzepak
- odporność na herbicydy,
- zmniejszona zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych,
- większa zawartość kwasu lauronowego.
Buraki cukrowe
- odporność na herbicydy i szkodniki,
- dłuższy okres przechowywania bez strat w zawartości cukru.
Ryż
- zwiększona produkcja beta-karotenu, prekursora witaminy A - wszczepione został geny pochodzące z żonkila, modyfikacja w zamierzeniu miała rozwiązać problem braku witaminy A u dzieci w Azji Wschodniej.
Sałata
- produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B - można się szczepić jedząc sałatę - została ona opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego.
Bawełna
- odporność na herbicydy i szkodniki.
Pszenica
- zwiększenie zawartości glutenu - lepsza mąka.

16. Metody tworzenia zwierząt transgenicznych

Dotychczasowy postęp w zakresie uzyskiwania zwierząt transgenicznych pozwala z umiarkowanym optymizmem patrzeć na rozwiązanie takich problemów, jak uzyskanie zwierząt o doskonałych cechach produkcyjnych. Znanymi kierunkami transgenezy są: doskonalenie biokonwersji składników pasz, ulepszanie zestawu enzymów trawiennych, polepszenie naturalnej odporności na choroby.

Zwierzęta transgeniczne to takie, którym za pomocą jednej z technik wprowadzono do genomu obcy gen. Obecne zwierzęta transgeniczne: myszy, owce, bydło, świnie, króliki. Metody otrzymywania organizmów transgenicznych można podzielić na dwie grupy. Do pierwszej grupy należą techniki, w których materiał genetyczny jest przekazywany do organizmu za pomocą wektorów. Natomiast druga grupa uzyskiwania organizmów transgenicznych obejmuje techniki bez wykorzystania wektorów np. elektroporacja, mikrowstrzeliwanie, użycie glikolu polietylowego (PEG), fuzja liposomów lub mikroiniekcja.

4 sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych:

• mikroinjekcja DNA do zygoty

• transfer DNA przy pomocy wirusów

• modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (ang. Embryonic Stem Cells)

• transplantacja jąder komórkowyc

Mikroinjekcja DNA do zygoty

Polega na mikroinjekcji DNA (liniowego lub w postaci sztucznych chromosomów) do jednego z przedjądrzy tzn. jednokomórkowego zarod­ka (zygoty) przy pomocy mikrochirurgicznej szkla­nej pipety. Przedjądrza posiadają materiał genetyczny pochodzący od ojca i matki tuż przed połączeniem się w jedno jądro komórkowe. Roztwór DNA wstrzy­kiwany jest do dowolnie wybranego przedjądrza, a następnie nastrzyknięte zygoty hodowane są in vitro do stadium dwukomórkowego. Brak jest możliwości dokładnego kontrolowania objętości wstrzykiwanego roztworu DNA. Mikroinjekcję DNA przeżywa około 50% zarodków, które następnie przeszczepiane są do jajowodu samic. Rodzi się około 30% przetransferowanych zarodków, wśród których około 15% posiada w swoim genomie zintegrowany transgen. W metodzie mikroinjekcji integracja wstrzykniętego transgenu do genomu jest losowa i nie ma możliwości wyboru miejsca wbudowania. Ponadto nie można kontrolować liczby kopii transgenu wbudo­wanych w genom, które często układają się tandemowo. Otrzymany osobnik transgeniczny może posiadać transgen we wszystkich komórkach swojego ciała lub może być chimerą (organizm, którego komórki ciała nie są identyczne pod względem genetycznym). Oznacza to, że niektóre komórki posiadają transgen, na­tomiast inne nie. Gdy transgen nie znajduje się w komórkach płciowych założycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie będzie on przekazywany następnym pokoleniom.

Główną zaletą metody mikroinjekcji DNA jest brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA. Dokonuje się injekcji DNA pochodzącego z plazmi­dów (ok. 10 kpz), kosmidów (ok. 45 kpz) a także DNA sztucznych chromosomów BAC, YAC (długość frag­mentu DNA sięgająca milionów par zasad).

Transfer DNA przy pomocy wirusów

Metoda polega na infekcji przy pomocy retrowirusów i lentiwirusów. Główną przewagą tej me­tody jest jej wyjątkowo duża wydajność, sięgająca nawet 80% transgenicznego potomstwa. Ponadto retrowirusy i lentiwirusy posiadają zdol­ność integracji do genomu po wniknięciu do komórki. W przypadku retrowirusów głównym ograniczeniem stało się wyciszanie ekspresji genów podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej pozbawione są lentiwirusy, stanowiące jedną z klas retrowirusów. Lentiwirusy są zdolne do infekcji dzie­lących się oraz nie dzielących się komórek. Z tego powodu znalazły szerokie zastosowanie jako wektory w terapiach genowych. Do otrzymania zwierząt transge­nicznych z zastosowaniem lentiwirusów wykorzystano dwie metody: infekcje jednokomórkowych zarodków oraz infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES.

Modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES

Metoda ta pozwala na precyzyj­ną modyfikację badanego genu lub miejsca w geno­mie. Komórki ES izolowane są z blastocysty (wczesny etap rozwoju zarodka), dzięki czemu otrzy­muje się komórki niezróżnicowane, które posiadają zdolność wbudowywania się do tkanek rozwijającego się zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocy­sty. W metodzie tej komórki ES modyfikowane są in vi­tro w bardzo precyzyjny sposób. Podstawową techniką wprowadzania genów do komórek ES jest elektropora­cja, ale także wykorzystuje się lipofekcję oraz metodę wapniową. Aby uzyskać pożądane miejsce integracji wprowadzany fragment DNA zawiera sekwencję genu selekcyjnego otoczoną przez sekwencje homologiczne do modyfikowanego genu. W jądrze komórki następuje rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana geno­mowej sekwencji na sekwencję wprowadzaną. Wprowadzenie „obcego DNA” wyłącza pra­widłowe funkcjonowanie tego genu w komórce, dzięki czemu uzyskuje się komórkę z wyłączonym genem tzw. knock-out. Ekspresja genu selekcyjnego (znajdująca się na wprowadzonym DNA) pozwala wybrać tylko te ko­mórki-klony, w których nastąpiła właściwa wymiana (homologiczna rekombinacja). Komórkę, w której nastąpiła wymiana i wyłączenie interesującego nas genu namnaża się w odpowiednich warunkach selekcyjnych. Komórki potomne następnie transferuje się do blastocysty, w której zmodyfikowane komórki ES łączą się z nie zmodyfikowanymi komórka­mi zarodka tworząc jeden organizm. Otrzymana chime­ra posiada część komórek ze zmienionym genotypem, czyli z wyłączonym genem knock-out. Jeżeli komórki ES knock-out zasiedlą tzw. sznury płciowe, czyli komór­ki rozrodcze, to taki osobnik będzie mógł przekazać nową cechę knock-out genu następnemu pokoleniu. Potomstwo osobników chimerowych jest heterozygo­tyczne i dopiero po skrzyżowaniu dwóch heterozygot można otrzymać osobnika homozygotycznego z całko­wicie wyłączonym genem (knock-out) na obu chromo­somach homologicznych. Opisana metoda możliwa jest do zastoso­wania jedynie u myszy.

Transplantacja jąder komórkowych

Istnieje inna droga otrzymywania osobników z wyłączonym genem typu knock-out. Wykorzystuje ona technikę transplantacji jąder komórkowych. Technika taka określana jako klonowanie somatyczne została wykorzystana do otrzymania owcy Dolly. W metodzie tej można wykorzystać wie­le rodzajów komórek somatycznych, które w hodowli mogą być modyfikowane w podobny sposób jak mysie komórki ES. Po otrzymaniu komórek zmodyfikowa­nych np. typu knock-out, jedną z nich umieszcza się w pobliżu oocytu, z którego wcześniej mikrochirurgicznie usunięto jądro komórkowe. Następnie łączy się obie komórki w procesie elektrofuzji, poddając je dzia­łaniu pola elektrycznego. W ten sposób otrzymujemy jednokomórkowy zarodek, którego rozwój kierowany jest na początku przez składniki zawarte w cytopla­zmie oocytu, a następnie funkcję rozwoju przejmuje jądro komórki somatycznej. Jeżeli komórka ta została wcześniej zmodyfikowana np. poprzez knock-out genu, zmiana ta obecna będzie w każdej komórce powstałego organizmu.

17. Kierunki prac biotechnologii w produkcji roślinnej.

• Rośliny jako bioreaktory

• Cel biologów - zwiększenie produktywności roślin przez zwiększenie stopnia wykorzystania energii słonecznej do biosyntezy składników biomasy roślin

• Rośliny to niezwykłe bioreaktory - przy współudziale energii promieniowania słonecznego z CO₂ i wody jest przeprowadzana biosynteza heksoz, z których w wyniku biokonwersji powstają polisacharydy, białka, lipidy, sterydy i witaminy

• Rośliny typu C-4: trzcina cukrowa, kukurydza, proso, sorgo - asymilują ok. 60 mg CO₂/(dm².h), wykazując małe fotooddychanie

• Rośliny typu C-3: większość roślin uprawnych - asymilacja nie przekracza 30 mg CO₂/(dm².h), występuje duże fotooddychanie

• Najbardziej wartościowy składnik biomasy roślin - białka

• Rośliny transgeniczne

• Genetyka mendlowska

• Genetyka komórek somatycznych - pokonanie bariery niekrzyżowalności

• Transplantacja organelli komórkowych - z komórek rośliny dawcy do komórek rośliny biorcy

• Transformacja komórek roślinnych - przy użyciu materiału genetycznego obcego pochodzenia, przez bezpośrednią mikroiniekcję DNA do jader kom., lub za pośrednictwem wektorów plazmidowych (plazmidy T1,R1 z Agrobacterium tumefaciens lub rhizogenes) lub wirusowych (DNA wirusa mozaiki kalafiora)

• Skuteczność transformacji jest pochodną:

• Częstości integracji transgenu do genomu biorcy

• Rozdzielczości metody selekcji

• Możliwości zastosowania u dowolnego gatunku lub odmiany

• Konstruowanie roślin transgenicznych z udziałem wektorów Agrobacterium tumefaciens przebiega w 4 etapach:

• Wprowadzenie obcych genów do szczepu bakterii

• Kokultywacja bakterii z komórkami lub tkankami roślinnymi

• Eliminacja bakterii, selekcja tkanek nietransformowanych, regeneracja struktur stransformowanych

• Analiza i weryfikacja ekspresji genów w roślinach stransformowanych

• Modyfikacja technologicznych cech roślin

• Nie wiem co tu napisać bo w tych wykładach pod tym tematem jest o roślinach transgenicznych

• Doskonalenie kultury uprawy i produkcji biomasy roślin

• Intensyfikacja fotosyntezy -prace dotyczą:

• Genetycznego doskonalenia enzymów, asymilujących CO2 i białka chloroplastowe

• Ograniczenia strat energii w procesach fotooddychania oraz przyswajania CO2

• Lepszego poznania mechanizmów regulujących wzrost i starzenie

• Optymalizacji rozprowadzania produktów asymilacji

• Wprowadzenia roślin uprawnych, których budowa i właściwości fizjologiczne sprzyjałyby wykorzystaniu energii słonecznej

• Biologiczne wiązanie azotu atmosferycznego - badania zmierzają do:

• Opanowania procesu symbiozy organizmów asymilujących azot z atmosfery we współżyciu z roślinami, nie tylko motylkowymi

• Zwiększenia intensywności asymilacji azotu przez oddziaływanie na genetyczne mechanizmy regulacyjne

• Utworzenia nowych systemów asymilacji azotu przez konstrukcje somatycznych mieszańców komórek pochodzących z fuzji komórek wybranej odmiany uprawnej i komórek roślin przyswajających azot lub też przez przeniesienie zespołu genów "nif" do nowych symbiotycznych albo tez wolno żyjących mikroorganizmów. Bardziej realne jest tworzenie nowych odmian mikroorganizmów żyjących w symbiozie z roślinami uprawnymi, przede wszystkim zbożami.

• Hodowle tkankowe i komórkowe

• Regeneracja roślin in vitro odbywa się zazwyczaj metodą somatycznej embriogenezy lub organogenezy. Somatyczna embriogeneza jest procesem, w wyniku którego komórki diploidalne i haploidalne mogą podlegać różnicowaniu oraz tworzyć zarodki z pominięciem zapłodnienia i wytwarzania zygoty. W kulturach in vitro somatyczne zarodki, zwane tez zarodkami dodatkowymi (ang. accessory embryos), przybyszowymi (ang. adventive embryos) lub embrioidami (ang. embryoids), mogą powstawać z komórek kalusa, zawiesiny czy tkanek eksplantatu.

• Somatyczna embriogeneza, oprócz możliwości szybkiego rozmnażania roślin, umożliwia także otrzymywanie roślin jednolitych genetycznie, a w konsekwencji morfologicznie, a ponadto jest tania w porównaniu z metodami tradycyjnymi.

• Technikę prowadzenia kultur tkankowych wykorzystuje sie w pracach nad pozyskiwaniem nowych odmian zbóż, np. kukurydzy, której białko będzie bogatsze w lizynę.

• Hodowla komórek roślinnych w bioreaktorze

• Komórki roślinne wyróżniają się bardzo dużym współczynnikiem konwersji źródła węgła i energii w masę komórkową, mieszczącym się w granicach 0,65-0,85. Rozwój komórek roślinnych w hodowli wgłębnej w bioreaktorze przypomina dynamikę procesów mikrobiologicznych. Przyrost liczby komórek i biomasy ma charakter wykładniczy lub liniowy.

• hodowla immobilizowanych komórek roślinnych - w bioreaktorze z komórkami immobilizowanymi jest możliwe uzyskanie znacznie większego ich zagęszczenia, aniżeli w zawiesinie, co zwiększa ich produktywność w porównaniu z komórkami "wolnymi". Perspektywy hodowli roślin w bioreaktorach są związane z produkcja szikoniny, glikozydów nasercowych digitalis, alkaloidów opium, alkaloidów (atharanthus), olejków zapachowych oraz roślinnych prekursorów leków steroidowych.

18. Kierunki prac inżynierii genetycznej w produkcji zwierzęcej.

Postęp w biotechnologii rozrodu zwierząt:

• Zwiększenie produkcji mleka

• zwiększeniem wydajności rozrodczej samic, głównie bydła

• wywoływanie mnogiej owulacji i przenoszenie zarodków

• reprodukcję metodami pozapłodowymi połączone z regulacją płci oraz klonowanie zarodków zwiększają możliwości replikacji zwierząt transgenicznych.

Cele doskonalenia metod biotechnologii w dziedzinie produkcji zwierzęcej:

• Duże nadzieje biotechnologów wiążą się z uzyskiwaniem zwierząt transgenicznych, a wiec takich, których genotyp będzie uformowany nie metodami selekcji, lecz przez wprowadzenie do niego z zewnątrz struktury genetycznej, która zadecyduje o ekspresji określonej cechy użytkowej. Zastosowanie transgenezy u ssaków umożliwia np.:

• doskonalenie składu mleka i polepszona jakość mleka.

• zwiększona wydajność mleczna

• króliki i bydło transgeniczne mogą być specyficznymi bioreaktorami do produkcji mleka o składzie modyfikowanym na potrzeby żywienia diabetyków.

• osiągnięcie korzystniejszego tempa wzrostu zwierząt

• większa produkcja mięsa

• redukcja tłuszczu

• doskonalenie biokonwersji składników pasz

• ulepszanie zestawu enzymów trawiennych

• polepszenie naturalnej odporności na choroby

• Oddziaływanie współczesnej biotechnologii w produkcji zwierzęcej polega również na biosyntezie szczepionek przeciwko powszechnie występującym chorobom zwierząt, np. kokcydiozie drobiu.

• Dzięki dokonaniom biotechnologii można uodporniać zwierzęta na takie choroby jak pryszczyca lub grypa jeszcze przed urodzeniem, tj. w fazie rozwoju embrionalnego.

• Do ważnych gospodarczo kierunków oddziaływania biotechnologii w produkcji zwierzęcej należy zaliczyć stosowanie hormonów wzrostu oraz doskonalenie produkcji pasz i ich zastosowanie przez modyfikacje składu mikroflory przewodu pokarmowego.

• W produkcji żywca rzeźnego, głównie trzody chlewnej, zwraca się uwagę na

konstruowanie nowych linii genetycznych.

• Zwierzęta doskonalone genetycznie bardzo dobrze wykorzystują składniki pasz.

• Stosując perfekcyjnie zbilansowane diety można w krótkim okresie tuczu (kilka miesięcy) wyhodować tuczniki, które maja pożądaną mięsność i są mało otłuszczone.

• Celem doskonalenia zwierząt rzeźnych jest polepszenie jakości mięsa kulinarnego, przede wszystkim wolowego, wieprzowego, drobiowego, co może polepszyć jego konsumpcje w postaci nieprzetworzonej (w zakresie produkcji drobiarskiej dominuje hodowla kurcząt)

• Do ważnych sektorów produkcji zwierzęcej zalicza się jajczarstwo. Dokonania w zakresie zmian żywienia kur oraz ich doskonalenie genetyczne umożliwia uzyskanie szerokiego asortymentu jaj, o składzie wzbogaconym lub modyfikowanym, ważnym ze względów

żywieniowych.

• Do nich należą np. jaja o żółtku wzbogaconym w wielonienasycone kwasy tłuszczowe, witaminy A, D, E, K; o zmniejszonej zawartości cholesterolu itp.

• zastosowaniem metod inżynierii genetycznej w hodowli ryb.

• Perspektywy produkcji mleka i jego przetworów są związane z koncentracja i specjalizacja produkcji zwierzęcej, zmniejszeniem kosztów pozyskiwania mleka. W tym zakresie ważne jest także doskonalenie genetyczne bydła, polepszenie mleczności krów oraz jakości mleka.

• Interesującym kierunkiem badan nad wyhodowaniem zwierząt transgenicznych jest uzyskanie świń jako dawców serca dla ludzi

• zwierzęta transgeniczne mogą być potencjalnymi bioreaktorami, w których prowadzi się produkcje składników aktywnych biologicznie:

• w gruczole mlecznym - synteza i modyfikacja białek o aktywności biologicznej - białka ludzkie: czynnik krzepliwości IX, antytrombina

• we krwi zwierząt - świnie wytwarzające w kom. krwi 9% ludzkiej hemoglobiny zdolnej do wiązania tlenu tak samo jak ludzka

• w pęcherzu moczowym

19. Kierunki biotechnologicznego wykorzystania gruczołu mlecznego.

- zwiększenie stabilności mleka w podwyższonej temp., poprzez wprowadzenie dodatkowych genów białek mleka. Efektem ma być nadprodukcja określonych typów kazein lub białek serwatki.

- polepszenie jakości produktów mlecznych produkowanych z mleka (↑ jędrności skrzepu kazeinowego i ilości w nim białka i tłuszczu, polepszenie jakości serów), poprzez ukierunkowaną mutagenezę genów kazein. Efektem ma być zmiana I rzędowej str. kazein.

- przyspieszenie dojrzewania serów dojrzewających, ↑trwałości zawiesiny koloidowej kazein mleka, lepsza emulgacja poprzez inaktywacje lub zahamowanie ekspresji genu α- laktoalbuminy.

- eliminacja kryształków lodu i laktozy- polepszenie jakości lodowej, zmiana właściwości osmotycznych mleka poprzez wprowadzenie bakteryjnego genu β- galaktozydazy z promotorem genu białka mleka. Efektem ma być↓ zawartości laktozy w mleku.

- obniżenie ryzyka zachorowalności krów na zapalenie wymienia, ochrona potomstwa przed zakażeniami przewodu pokarmowego, ↑absorpcji Fe, poprzez wprowadzenie genów lizozymu, lizoststyny, laktoferyny, immunoglobuliny, połączonych z promotorami genów białek mleka. Efektem ma być obecność białek o działaniu obronnym lub przeciwbakteryjnym w gruczole mlecznym i w mleku.

- produkcja zdrowego mniej tłustego mleka, bogatego w WNNKT,↓ kosztów produkcji mleka poprzez inaktywację lub modyfikację genów związanych z biosyntezą kw. tłuszczowych. Efektem ma być ↓ zawartości tłuszczu w mleku, ↑ zaw. Kw. Tłuszczowych nienasyconych.

- „humanizacja mleka przeżuwaczy”, tzn zastąpienie części białek mleka krowiego białkami ludzkimi, co ma podnieść strawność mleka przez dzieci, poprzez inaktywację genu β-galaktoglobuliny. Efektem ma być produkcja mleka bez β-galaktoglobuliny.

- umożliwienie spożywania przez ludzi mleka z nietolerancją na laktozę lub uczulonych na β-galaktoglobulinę.

- polepszenie właściwości odżywczych mleka (↑ zawartości Ca i P, ↑ zawartości aminokwasów siarkowych w białkach mleka)

- wytwarzanie ludzkich białek leczniczych w mleku transgenicznych zwierząt gospodarczych- „żywych bioreaktorów”, poprzez wprowadzenie ludzkich genów połączonych z promotorami genów białek mleka. Efektem ma być synteza obcych gatunkowo białek w gruczole mlecznym zwierząt transgenicznych.

20. Zastosowanie genomiki i mapowania genomu w produkcji zwierzęcej.

Genomika - dziedzina biologii molekularnej i biologii teoretycznej (pokrewna genetyce i ściśle związana z bioinformatyką) zajmująca się analizą genomu organizmów. Głównym celem genomiki jest poznanie sekwencji materiału genetycznego oraz mapowanie genomu ale również określenie wszelkich zależności i interakcji wewnątrz genomu.

W odróżnieniu od genetyki genomika obejmuje ogół zjawisk genetycznych całościowo i przy pomocy biologii teoretycznej (głównie bioinformatyki) stara się określić i opisać wszystkie zależności tych zjawisk oraz wpisać je w ogół procesów metabolicznych żywego organizmu. Genomika wraz z proteomiką, metabolomiką i transkryptomiką stanowią główny trzon bioinformatyki. Najbardziej uniwersalny podział genomiki i dziedzin pokrewnych obejmuje:

• genomika funkcjonalna (poznanie funkcji wszystkich genów w genomie)

• genomika strukturalna (poznanie sekwencji i jej wstępny opis)

• genomika teoretyczna (ogólne prawa rządzące genomami)

• genomika porównawcza (ewolucja genomów)

• genomika indywidualnych różnic (zmienność międzyosobnicza genomów tego samego gatunku)

 Dotychczas analizując zmienność wśród zwierząt hodowcy i biolodzy zadawalali się podziałem na podstawowe komponenty. Wraz z rozwojem technik molekularnych, uzyskaliśmy możliwość badania pojedynczych genów i ich loci. Skoro jednak wiele cech zwanych ilościowymi determinowanych jest przez więcej niż jeden lokus, to zainteresowani jesteśmy również określeniem wielkości wpływu poszczególnych loci tak by wiedzieć, który jest w tym miejscu najważniejszy a które są mniej ważne. Dzięki temu moglibyśmy prowadzić selekcje pod kątem pojedynczych genów. Możliwe w pewnym stopniu byłoby przewidywanie na przykład wydajności zwierzęcia na podstawie znanego genotypu.
          Identyfikacja genów warunkujących fenotypowe przejawianie się cech ilościowych jest utrudniona. Problemy wynikają z dużej liczby genów zaangażowanych w powstanie cechy, co w efekcie daje niewielki efekt addytywny poszczególnych z nich rozpatrywanych oddzielnie. Są to te cechy, które nie da się opisać prostym stwierdzeniem, że występują lub nie. Przejawiają się one fenotypowo z ogromną różnością nasilenia przechodzącą w sposób płynny pomiędzy skrajnymi możliwościami. To na przykład wydajność mleczna, która przyjmuje różne wartości w zależności od krowy. Musimy, więc ograniczyć się do odnalezienia loci dużych genetycznie maksymalnie dużych wpływach na rozpatrywaną cechę. Geny takie genetycznego znacząco większym wpływie nazywamy wtedy genami głównymi. O genie głównym mówimy wtedy, gdy wywołuje on zmienność genetyczną mierzona jednostkami odchylenia na minimalnym poziomie jednego odchylenia standardowego. Innymi słowy, gdy różnica wartości genotypowej pomiędzy przeciwstawnymi homozygotami wynosi, co najmniej jedno odchylenie standardowe to gen ten zaklasyfikowany może być jako gen główny dla tej cechy genotypowej. Gen taki jest, więc odpowiedzialny za znakomitą większość z wartości przyjmowanej przez cechę ilościową, a co za tym idzie pozostałe geny stanowią tylko tło dla niego. Tło to jest oczywiście ważne gdyż taka jest specyfika cech ilościowych. Czasem zamiast genu głównego znajdowane są geny sprzężone z cechą w tak dużym stopniu, że stają się podstawą diagnostyki. Są to markery, którymi są najczęściej sekwencje niekodujące, czyli grupy II. Ostatnio w dziedzinie tej osiągnięto już znaczne postępy.
          Do szczególnie ważnych osiągnięć zaliczyć można zmapowanie genu callipyge (z greckiego; calli - piękne, pyle - pośladki), czyli CLPG, powodującego u owiec hipertrofię mięśni. Również u bydła zidentyfikowano gen odpowiedzialny za hipertrofie mięśni, a u świń regionu wpływającego na cechę cechy jakości tuszy i tempa wzrostu, oraz genu o dużym wpływie na jakość mięsa, jak gen receptora ryanodiny RYR1, znaleziono również gen wysokiej plenności u owiec rasy, booroola, czyli gen FecB od angielski słów fecundity gene of booroola). W poniższej tabeli zostało podane więcej przykładów zmapowanych genów związanych z ważnymi cechami użytkowymi zwierząt gospodarskich.

Gatunek	Gen kandydujący	Cecha
Świnia	HAL	Jakość mięsa, stres
		MC4R	Wzrost, otłuszczenie
		RN, PRKAG3	Jakość mięsa
		AFABP/FABP4	Śródmięśniowy tłuszcz
		HFABP/FABP3	Śródmięśniowy tłuszcz
		CAST	Miękkość, kruchość mięsa
		IGF2	Wzrost, otłuszczenie
	Bydło	Leptyna	Marmurkowatość mięsa
		MSTN	Wzrost mięśni szkieletowych
		DGAT1	Śródmięsniowy tłuszcz, marmurkowatość mięsa
		CAST	Kruchość, miękkość mięsa
	Owca	Callipyge(CLPG)	Hipertrofia mięśniowa
		GDF8	Hipertrofia mięśniowa
	Kura	EX-FABP	Otłuszczenie
		L-FABP	Otłuszczenie

---