Analiza kumulacji metali ciężkich w organizmach II
Uszkodzenia aparatu fotosyntetycznego roślin w warunkach stresu wywołanego nadmiarem metali ciężkich I.
Ćwiczenie nr 1.
Wpływ pierwiastków na intensywność wzrostu koleoptyli pszenicy.
Do doświadczenia wybieramy pęsetą 6 porcji po 10 ziarniaków pszenicy równo skiełkowanych. Porcje skiełkowanych ziarniaków umieszczamy na potrójnej warstwie bibuły w szalkach Petriego wysyconej wodą destylowaną (kontrola) lub 1mM roztworami Cd, Cu, Pb, Ca, K w Cd(NO3)2, Cu(NO3)2, Pb(NO3)2 Ca(NO3)2, KNO3. Na każdej z prób skiełkowanych ziarniaków dokonujemy pomiarów długości koleoptyli. Wynik pomiaru notujemy w rubryce próba wyjściowa. Po trzech i siedmiu dniach dokonujemy ponownego pomiaru długości koleoptyla w każdej z prób.
CZAS |
Długość koleptyla |
|||||
|
kontrola |
Cd(NO3)2 |
Cu(NO3)2 |
Pb(NO3)2 |
Ca(NO3)2 |
KNO3 |
Próba wyjściowa |
|
|
|
|
|
|
3 DNI
|
|
|
|
|
|
|
7 DNI
|
|
|
|
|
|
|
Ćwiczenie nr 2.
Wpływ metali ciężkich na uszkodzenia fotosystemu PSII.
W ćwiczeniu wykorzystujemy gatunki roślin Phaseolus vulgaris, Zea mays które były narażone na nadmiar ołowiu, oraz rośliny które były przetrzymywane w warunkach kontrolnych.
Pomiarów parametrów fluorescencji dokonujemy przy użyciu fluorymetru FMS 1. Pomiar fluorescencji chlorofilu jest prostym, nie destrukcyjnym i bardzo szybkim narzędziem pomiarowym, daje odpowiedź na temat stanu fizjologicznego, w jakim znajduje się roślina. Pomiary i analiza parametrów fluorescencji chlorofilu a w ostatnich latach przeżywa rozkwit. FMS 1 służy do wykonywania szybkich i dokładnych pomiarów fluorescencji chlorofilu. Parametry mierzalne w trakcie pomiaru (F0, Fv, Fm, Fv/Fm) są pomocne w ocenie stanu i funkcjonowania fotosystemu II w fazie jasnej fotosyntezy. Czynniki stresowe wpływają na funkcjonowanie PS II. Aparat ten jest szczególnie użyteczny w określaniu wpływu czynnika stresowego na aparat fotosyntetyczny w warunkach naturalnych lub laboratoryjnych.
Źródłem wzbudzającym fluorescencję w tym urządzeniu jest światło aktyniczne w zakresie 330-660 nm z maksimum przy długości fali 500 nm. Podczas pomiarów będziemy stosować następujące ustawienia: aklimacja do ciemności za pomocą firmowych klipsów przez 20 minut, intensywność światła wzbudzającego 1000 µmol . m-2 . s-1, czas pomiaru 1 s.
Będą analizowane następujące parametry fluorescencji.
Fv/Fm - potencjalna wydajność kwantowa fotosystemu II (PS II). Wartość tego parametru jest często stosowanym wskaźnikiem uszkodzeń wywołanych różnymi czynnikami stresowymi,
F0 - minimalna wydajność fluorescencji, która określa stałą fluorescencję charakterystyczną dla otwartych centrów reakcji. Wartość F0 nie jest stała i może rosnąć lub obniżać się kiedy uszkodzone są centra PS II, albo jeśli przekazywanie energii z anten do centrów rekcji jest hamowane,
Fm - maksymalna wydajność fluorescencji, obserwowana gdy wszystkie centra reakcji PS II są zamknięte,
Fv= (Fm-F0) maksymalna zmiana wartości między F0 a Fm, Fv jest parametrem proporcjonalnym do wydajności kwantowej PS II. Wartości zbliżone do zera mogą świadczyć o uszkodzeniu PS II i rozpraszaniu energii w postaci ciepła.
Rośliny traktowano 3mM Pb w Pb(NO3)2 doglebowo poprzez podlewanie odpowiednim roztworem. Ponad to rośliny fasoli i kukurydzy traktowano dolistnie tym samym roztworem .
|
F0 |
Fm |
Fv/Fm |
Fv |
|
Phaseolus vulgaris |
Kontrola
|
|
|
|
|
|
traktowane doglebowo 3mM Pb w Pb(NO3)2
|
|
|
|
|
|
traktowane dolistnie 3mM Pb w Pb(NO3)2
|
|
|
|
|
Zea mays |
Kontrola
|
|
|
|
|
|
traktowane doglebowo 3mM Pb w Pb(NO3)2
|
|
|
|
|
|
traktowane dolistnie 3mM Pb w Pb(NO3)2
|
|
|
|
|
Ćwiczenie nr 3.
Wpływ zawartości metali ciężkich w środowisku na zmiany zawartości chlorofilu.
W ćwiczeniu zostanie porównana zawartość chlorofilu u roślin C3 (Phaseolus vulgaris) i C4, (Zea mays) (kontrola) oraz u takich, które były narażone na działanie nadmiaru metali ciężkich 3mM Pb w Pb(NO3)2
metoda Barnesa i wsp. (1992)
Zawartość chlorofilu oznaczona zostanie według metody Barnesa i wsp. (1992). Określona ilość materiału została przeniesiona do pojemników z 3 ml sulfotlenku dimetylu. Tak przygotowane pojemniki umieszczamy w cieplarce na 4 godziny w temperaturze 65o C w celu ekstrakcji barwników. Ekstrakt następnie zostanie przelany do kuwety pomiarowej, a oznaczenie ilości chlorofilu a i b zostanie wykonane przy użyciu spektrofotometru firmy CECIL 9500. Absorbancję oznaczymy przy długości fali: λ = 665 i 648 nm. Ilość chlorofilu zostanie przeliczona na stężenie w świeżej masie według wzorów.
METODA z DMSO (1992)
Chlorofil a = (14,85·A665 - 5,14·A648)·V
1000 · W
Chlorofil b = (25,48·A648 - 7,36·A665)·V
1000 · W
Suma a + b = (7,49·A665 + 20,34·A648)·V
1000 · W
gdzie:
A - absorbancja przy danej długości fali,
V - całkowita objętość ekstraktu (cm3),
W - masa próbki (g).
METODA Z DMSO |
CHLOROFIL |
|
|||
|
a |
b |
a+b |
a/b |
|
KONTROLA |
Phaseolus vulgaris |
|
|
|
|
|
Zea mays |
|
|
|
|
3mM Pb w Pb(NO3)2
|
Phaseolus vulgaris |
|
|
|
|
|
Zea mays |
|
|
|
|
Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
|
Uniwersytet Pedagogiczny im. Komisji Edukacji Narodowej
30-084 KRAKÓW |