Sprawozdanie z ćwiczeń 1 - 3

Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych.

Ćwiczenie 1:	Selekcja mikroorganizmów zdolnych do rozkładu katecholu oraz fenolu.
Ćwiczenie 2:	Identyfikacja szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu katecholu i fenolu.
Ćwiczenie 3:	Kolorymetryczne oznaczanie stężenia katecholu oraz fenolu w założonych hodowlach.

Przygotowali:

Agata Chodak

Justyna Cyba

Aleksandra Dawczyńska

Robert Gajowski

Grupa: chemia 1

Wstęp teoretyczny:

Stopniowa degradacja środowiska przez człowieka spowodowała, że w ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się problemom związanym z biologicznym oczyszczaniem akumulujących się w środowisku trudno rozkładalnych związków ksenobiotycznych. Do jednych z najbardziej trwałych i cechujących się dużą toksycznością związków należą związki aromatyczne, w tym wielopierścieniowe węglowodory, jak również pochodne fenolowe. Do takich substancji należą między innymi takie związki jak fenol czy katechol.

Według definicji ksenobiotyk jest to związek chemiczny występujący w organizmie, lecz niebędący naturalnym składnikiem organizmu żywego. Organizm, w którym stwierdzono obecność ksenobiotyków, nie wytwarza ich, ani też w normalnych warunkach nie przyjmuje z pożywieniem. Mianem ksenobiotyku określa się większość trucizn, leków, pestycydy, zanieczyszczenia środowiska oraz niektóre substancje dodawane do żywności. Wiele z nich to związki otrzymane przez człowieka, o niewystępującej w przyrodzie strukturze, do której organizmy nie przystosowały się na drodze wcześniejszej ewolucji.

Substancje ksenobiotyczne w organizmie ulegają biotransformacji oraz bioakumulacji. Reaktywne postaci ksenobiotyków mogą prowadzić do uszkodzenia komórek, a po złączeniu się z niektórymi białkami działają stymulująco w produkcji przeciwciał, co może powodować immunologiczne uszkodzenia komórki. Ksenobiotyki nie posiadające właściwości mutagennych mogą po ich aktywacji w komórce stać się substancjami rakotwórczymi.

Metodyka badań:

Próba środowiskowa pochodziła Kłodnicy. Jest to rzeka w wysokim stopniu zanieczyszczona, więc jest dobrym źródłem bakterii opornych na związki ksenobiotyczne. W celu wyselekcjonowania tego typu szczepów wykorzystano podłoże Kojma. Podłoże to nie zawiera źródła węgla, dzięki czemu możliwy był wzrost jedynie tych bakterii, które potrafiły rozłożyć dany związek ksenobiotyczny (fenol, katechol). Z tak uzyskanych hodowli wybrano pojedyncze kolonie i oczyszczono je metodą posiewu redukcyjnego na płytkach Petriego z zestalonym bulionem agarowym. Kolonie przesiano również na skosy agarowe. W obu przypadkach czas inkubacji wynosił 48 godzin.

W celu zaklasyfikowania bakterii do odpowiedniej grupy bakterii gramdodatnich lub gramujemnych wykonano barwienie metodą Grama. Aby dokonać ich dokładniejszej identyfikacji wykonano test API 20 NE.

Po okresie inkubacji kolonie wyrosłe na skosach agarowych w sterylnych warunkach spłukano do kolb zawierających pożywkę Kojima. Następnie dodano odpowiednią ilość roztworu fenolu lub katecholu, aby stężenie substratu wyniosło 5mM. Hodowle te były prowadzona przez okres 1 tygodnia. Po tym czasie oznaczono stężenie fenolu wykorzystując metodę polegającą na barwnej reakcji jednowodorotlenowych fenoli z dwuazowaną p-nitroaniliną w środowisku alkaicznym. W tym celu przygotowano odpowiednią mieszaninę i oznaczono jej absorbancję przy długości fali 550 nm, Stężenie fenolu odczytano na podstawie wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej.

Oznaczono także stężenie katecholu posługując się metodą polegającą na reakcji molibdenianu sodu z kwasem solnym, azotynem sodu i wodorotlenkiem sodu. Przygotowano odpowiednią mieszaninę i oznaczono na spektrofotometrze przy długości fali 480 nm. Stężenie katecholu odczytano na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.

Wyniki badań:

1. Wyniki barwienia Grama:

Bakterie zaklasyfikowano do grupy bakterii gramujemnych.

Jest to hodowla czysta.

2. Wynik testu API 20 NE:

3. Krzywe wzorcowe dla fenolu oraz katecholu:

4) Oznaczenie gęstości optycznej hodowli z fenolem oraz katecholem przy długości fali λ=600 nm

Ćwiczenie	Hodowla z fenolem jako substratem pokarmowym	Hodowla z katecholem jako substratem pokarmowym
2	0,212	0,143
3	0,080	Nie oznaczano

5) Stężenie fenolu i katecholu w hodowlach degradacyjnych (metoda kolometryczna)

Ćwiczenie	Hodowla z fenolem jako substratem pokarmowym	Hodowla z katecholem jako substratem pokarmowym
2	5 mM	5 mM
3 (absorbancja przy odpowiedniej długości fali )	0.048	0.730

1. Fenol:

y = 0,6858x

x = 0.0699

uwzględniając rozcieńczenie x100 x = 6,99 mM

2. Katechol:

y = 6,823x

x = 0,1070

uwzględniając rozcieńczenie x10 x = 1,07 mM Bakterie przyswoiły średnio: 5-1.07 = 3,93 mM katecholu.

Wnioski:

Otrzymane wyniki świadczą o tym, że bakterie zdegradowały katechol w znacznym stopniu (78,6%). Z przeprowadzonego doświadczenia nie można określić ilości zdegradowanego fenolu, czego powodem jest błędne oznaczenie jego stężenia w badanej próbce po okresie hodowli. Błąd pomiaru był najprawdopodobniej spowodowany tym, iż badaniu poddano zawiesiny komórek i podczas pomiarów promień światła natrafił na komórki bakteryjne zawyżając wynik.

Nie przeprowadzono pomiaru gęstości optycznej hodowli prowadzonej z katecholem z powodu jego utlenienia do chinonu, co uniemożliwiłoby prawidłowe odczytanie wyniku. Gęstość optyczna hodowli z fenolem wbrew oczekiwaniom znacznie zmalała. Mogło być to spowodowane błędem w sposobie przeprowadzaniu pomiaru, co sugerują podobne wyniki innych sekcji w danej grupie laboratoryjnej. Prawdopodobnie hodowle nie zostały wymieszane przed przeprowadzeniem pomiaru, wskutek czego większość bakterii pozostała w warstwie przydennej kolby.

Poza tym istnieje możliwość zastosowania zbyt dużego stężenia fenolu ze względu na jego toksyczność. Nie można tego stwierdzić doświadczalnie z powodu braku wyników (błędne oznaczenie stężenia i gęstości optycznej). Możliwości biodegradacyjne szczepu możemy zwiększyć poprzez mechanizm adaptacji genetycznej (mutagenizacja), poddając bakterie działaniu np. promieniowania UV. Mutacja genetyczna powoduje zmiany w genomie organizmu pozwalające na wprowadzenie do populacji nowych cech.

Z wykorzystanych związków katechol jest teoretycznie łatwiejszy do biodegradacji, ponieważ fenol w trakcie metabolicznego rozkładu jest w pierwszym etapie utleniany do katecholu (przez monooksygenazę).

Podczas laboratoriów w celu identyfikacji mikroorganizmów wykonano test biochemiczny (test enzymatyczny API 20 NE), dzięki któremu określono bakterie jako Aeromonas sp. Wynik można by potwierdzić wykorzystując metodę Southern blotting. Jest to metoda biologii molekularnej oparta na hybrydyzacji. Metody biologii molekularnej są najbardziej wiarygodne ponieważ są oparte o wykrywanie sekwencji kwasów nukleinowych unikalnych dla danego organizmu. Oprócz ww. metod wyróżnia się również metody biofizyczne i immunochemiczne.

Literatura:

• Chmiel „Biotechnologia”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998

• Różalski „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej”, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź 2003

• Źródła internetowe

Schemat barwienia metodą Grama 1

---