Ćwiczenia 3 i 4

Zakres realizowanej tematyki;

Chromatografia gazowa: analiza jakościowa i ilościowa triacylogliceroli w próbach tłuszczu mlecznego. Wpływ temperatury na rozdział chromatograficzny w GC. Dozowanie próby w GC. Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis do badania właściwości przeciwutleniających surowców i produktów żywnościowych

Prowadzący Ćwiczenia: Dr hab. Jarosława Rutkowska,

I. Chromatografia gazowa:

1. Dozowanie próby w chromatografii gazowej

Chromatografia gazowa służy do rozdzielania substancji, które w warunkach analizy mają postać par lub gazów. Są to zatem te substancje, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza około 300-400°C (w zależności od możliwości konkretnego modelu chromatografu). Dozowanie próbki musi przebiegać możliwie powtarzalnie i powinno wprowadzać na kolumnę możliwie małe ilości próbki. Dozowniki pozwalają na wprowadzenie do strumienia gazu nośnego analizowanych substancji. Często dozownik jest ogrzewany do takiej temperatury, by już w jego obrębie wprowadzone substancje przeszły w stan gazu. W przypadku kolumn kapilarnych stosuje się zwykle dwa typy dozowników:

• dozowniki z dzieleniem strumienia (ze spliterem, split injection) - w tym przypadku do gorącego dozownika wprowadza się próbkę za pomocą strzykawki przez membranę; większość odparowanej próbki jest usuwana na zewnątrz przyrządu ze strumieniem gazu nośnego, tylko niewielka jej część trafia wraz z gazem do kolumny; pozwala to na dozowanie próbki w ilości optymalnej dla kolumn kapilarnych o małej średnicy, natomiast problemem jest zapewnienie stałego stopnia podziału strumienia gazu tak, by dozowano zawsze taką samą część próbki; obecne rozwiązania pozwalają na zmianę stopnia podziału strumienia aż do takiego stanu, że dozowana jest cała próbka (dozownik split - splitless).

• dozowniki typu on-column - w tym przypadku ciekła próbka jest dozowana poprzez nieogrzewany dozownik bezpośrednio na kolumnę o temperaturze 20-60°C, po czym kolumna jest ogrzewana, odparowuje rozpuszczalnik, a następnie składniki próbki; metoda ta zmniejsza prawdopodobieństwo termicznego rozkładu związków o małej stabilności w wyższych temperaturach, jednak powoduje powstanie ryzyka zanieczyszczenia początkowego odcinka kolumny substancjami nielotnymi lub słabo lotnymi, wprowadzanymi razem z próbką W rutynowych analizach często stosuje się obecnie dozowniki automatyczne, które w zaprogramowany sposób dozują poszczególne próbki. Cały proces obejmuje programowanie kolejności i ilości nastrzyków każdej próbki, płukania strzykawki i innych czynności.

2. Wpływ temperatury na jakość rozdziału chromatograficznego:

Temperatura analizy jest, obok rodzaju kolumny i fazy stacjonarnej, czynnikiem decydującym o jakości uzyskanych wyników. Wybór odpowiedniej temperatury kolumny zależy od temperatury wrzenia analizowanych związków oraz od zastosowanej fazy stacjonarnej. Należy pamiętać, aby sprawdzić limit temperatury dla kolumny, której użycie planujemy. Generalnie stosuje się temperatury nieco niższe niż maksymalne dopuszczalne. Polarne fazy stacjonarne mają zwykle niższe limity temperatury niż fazy niepolarne. Dostępne są kolumny do wysokotemperaturowej chromatografii gazowej (HT-GC), których limity przekraczają nawet 400°C. Kolumny takie, oznaczane literami HT (np. DB-1HT, RTX-1HT), posiadają zazwyczaj niepolarne fazy stacjonarne.

Temperatury analizy w chromatografii podziałowej są zwykle nieco niższe od temperatury wrzenia analizowanych substancji. Dobór sposobu analizy zależy w dużym stopniu od spodziewanych różnic w temperaturach wrzenia analizowanych związków. Możliwe są dwie podstawowe metody analizy:

• analiza w stałej temperaturze (w izotermie) - gdy temperatury wrzenia poszczególnych składników nie różnią się o więcej niż kilkadziesiąt stopni Celsjusza,

• analiza w programowanej temperaturze, polegająca na podwyższaniu temperatury kolumny o stałą wartość, zwykle od 1 do 10°C na minutę; często na początku i końcu takiej analizy stosuje się izotermy (w temperaturze startowej oraz końcowej).

W obu przypadkach, znalezienie optymalnych warunków analizy polega na znalezieniu "złotego środka" pomiędzy czasem analizy a jakością uzyskanego chromatogramu. Analiza w izotermie wymaga dobrego dopasowania temperatury procesu, aby zarówno czas analizy, jak i jakość uzyskanych wyników były zadowalające. Należy pamiętać, że wyższa temperatura pozwala skrócić czas analizy, ale pogarsza rozdzielczość. Niska temperatura z kolei pozwala na lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale wydłuża czas analizy i powoduje poszerzenie i asymetryczność pików. W skrajnych przypadkach zbyt niska temperatura może nie pozwolić na elucję wszystkich składników, natomiast zbyt wysoka - uniemożliwić rozdzielenie substancji, które będą eluowały prawie w tym samym czasie. W praktyce, dla mieszanin związków różniących się temperaturą wrzenia o około 100°C i więcej, znalezienie optymalnej temperatury analizy w izotermie często okazuje się niemożliwe. W takim przypadku, należy zastosować analizę w programowanej temperaturze.

Liniowy wzrost temperatury podczas analizy przynosi wiele korzyści. Po pierwsze możliwe jest rozpoczęcie chromatografowania od tak niskiej temperatury, że wszystkie związki zatrzymają się na początku kolumny i będą przez nią migrować wraz ze wzrostem temperatury. Dzięki temu unikamy stosowania zbyt wysokiej temperatury początkowej, powodującej słabe rozdzielenie składników mieszaniny o najniższych temperaturach wrzenia. Po drugie - możemy tak dobrać szybkość wzrostu temperatury, że wszystkie składniki zostaną rozdzielone w zbliżony sposób i w rozsądnym czasie. Należy pamiętać, że im szybszy wzrost temperatury, tym gorszy efekt rozdzielania i krótszy czas analizy. Do analizy dużej grupy związków o skrajnie różnych temperaturach wrzenia (a taki charakter mają często próbki naturalne), analiza w programowanej temperaturze jest jedynym możliwym wyborem, pozwalającym na zadowalające rozdzielenie wszystkich składników w rozsądnym czasie. Analiza w programowanej temperaturze wymaga stosowania faz stacjonarnych o dużej stabilności termicznej w szerokim zakresie temperatur. Mniej stabilne fazy mogą być stopniowo wynoszone z kolumny wraz ze wzrostem temperatury, przez co wyniki analiz ulegają pogorszeniu, a czas życia kolumny bardzo się skraca. Widocznym efektem tego zjawiska jest dryf (podnoszenie się) linii podstawowej chromatogramu.

Rys. 1. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: możliwie dobrze dobranej izotermie (a, zwróć uwagę na poszerzenie ostatnich pików), w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze (b) oraz w programie temperaturowym (c) .

3. Detektor

Detektor jest elementem chromatografu odpowiedzialnym za wykrywanie substancji rozdzielonych w kolumnie chromatograficznej. Istota działania detektorów stosowanych w chromatografii gazowej (GC) polega na tym, ze reagują one na różnice we właściwościach gazu nośnego i gazu zawierającego substancje eluowane z kolumny. Rejestrowane zmiany mogą być proporcjonalne albo do stężenia molowego, albo do masowego natężenia przepływu wykrywanej substancji w gazie nośnym. Detektor powinien charakteryzować się dużą czułością, niską granicą wykrywalności, stabilnością, dobrą odtwarzalnością oraz szerokim zakresem liniowości wskazań. Rozróżnia się detektory uniwersalne i detektory selektywne do wykrywania tylko niektórych grup związków (np. halogenopochodnych lub zawierających siarkę). Najbardziej rozpowszechnione są: detektor płomieniowo - jonizacyjny (ang. Flame Ionisation Detector - FID) i detektor cieplno - przewodnościowy (ang. Thermal Conductivity Detector - TCD).

Detektor płomieniowo - jonizacyjny (FID):

Jest detektorem masowym, uniwersalnym, przydatnym do wykrywania prawie każdego związku organicznego. Ma szczególne znaczenie przy analizie węglowodorów i ich pochodnych. Jego duża czułość, stabilność oraz uniwersalność powoduje, że jest on najbardziej rozpowszechnionym w użyciu detektorem w GC. Do jego działania oprócz gazu nośnego potrzebne są linie z gazami: wodorem i powietrzem. Czułość detektora FID zależy od stosunku natężenia przepływów doprowadzanych do niego gazów i jest maksymalna dla stosunku gaz nośny : wodór : powietrze 1 : 1 : 10. W detektorze spalany jest wodór, przy czym płomień znajduje się między dwoma elektrodami. Jeżeli do płomienia z kolumny dochodzi tylko gaz nośny, to wytwarzane są termojony tego gazu, które powodują pojawienie się w układzie stałego prądu jonowego o bardzo małym natężeniu odpowiadającego linii podstawowej chromatogramu. Gdy do płomienia wodorowego wraz z gazem nośnym wprowadza się substancję wymywana z kolumny, wówczas jest ona spalana i w detektorze pojawia się większa liczba termojonów. W układzie płynie prąd o natężeniu proporcjonalnym do masy wprowadzanej do płomienia substancji, a na chromatogramie pojawia się pik.

II Metody spektrofotometryczne w badaniu właściwości przeciwutleniających żywności

1. Ogólne zasady przygotowania prób

W analizie związków fenolowych w żywności, bardzo istotnym etapem jest odpowiednie przygotowanie prób do analiz. Przeciwutleniacze w świeżym surowcu utleniane są przez endogenne enzymy i wrażliwe na szereg różnych czynników jak np. temperatura, światło, tlen. Szczególne znaczenie ma właściwe przeprowadzenie procesu przygotowania prób z zachowaniem optymalnych warunków chroniących wyjątkowo labilne związki fenolowe przed degradacją i umożliwienie w jak największym stopniu przejście ich z fazy stałej do ciekłej. W przypadku ciekłych produktów, jak soki i wina, często wystarczające jest tylko odpowiednie rozcieńczenie próby. W materiale roślinnym związki fenolowe są zawarte w wakuolach i ścianach komórkowych, często są związane z innymi składnikami, jak białka i polisacharydy. Przed oznaczeniem należy uwolnić je z tkanek poprzez rozdrobnienie i rozpuszczenie w fazie ciekłej. Związki takie jak np. antocyjany i flawonole są rozmieszczone głównie w skórce. W celu ich wydobycia należy silnie rozdrobnić surowiec roślinny, najczęściej poprzez homogenizację z dodatkiem odpowiedniego rozpuszczalnika o dużych zdolnościach do rozpuszczenia danych związków. W tym procesie należy także uwzględnić ochronę związków fenolowych przed ich utlenianiem przez enzymy surowca i tlen atmosferyczny poprzez dodanie odpowiednich przeciwutleniaczy i stosowanie atmosfery gazów obojętnych. Dobrą metodą pozwalającą na uniknięcie utlenienia próbek w czasie ich przygotowywania jest mrożenie i rozdrabnianie w ciekłym azocie. Ponadto związki fenolowe należy chronić przed izomeryzacją spowodowaną przez promienie świetlne oraz hydrolizą enzymatyczna i chemiczną.

Kolejnym etapem przygotowania próby do analizy jest ekstrakcja. Warunki ekstrakcji powinny być możliwie najłagodniejsze, aby uniknąć degradacji termicznej oraz chemicznych i biochemicznych zmian labilnych związków fenolowych.

2. Metody analityczne oznaczania właściwości przeciwutleniających

Przeciwutleniacze charakteryzuje zdolność do dezaktywacji rodników, zgodnie z dwoma podstawowymi mechanizmami reakcji:

1. mechanizm przeniesienia atomu wodoru, tzw. HAT (ang. hydrogen atom transfer)

2. mechanizm przeniesienia pojedynczego elektronu, tzw. SET (ang. single elektron transfer).

Oba te mechanizmy mogą występować równolegle, natomiast mechanizm dominujący w systemie jest zależny od: właściwości przeciwutleniacza, rozpuszczalności, współczynnika podziału oraz układu stosowanych rozpuszczalników. Jednak głównymi czynnikami determinującymi mechanizm reakcji oraz efektywność działania przeciwutleniaczy są energia dysocjacji wiązania oraz potencjał jonizacji.

Metody oznaczania zdolności przeciwutleniajacych można podzielić na:

• addycyjne

• postaddycyjne.

W metodach addycyjnych aktywność jest oznaczana jako opóźnienie procesu rozpoczęcia działania dodanego oksydanta na antyoksydant wskaźnikowy, w wyniku łatwiejszego utleniania w tym procesie antyoksydantów z badanej próby. W metodach postaddycyjnych aktywność jest oznaczana poprzez pomiar zmiany stężenia testowanego reagenta lub produktu (np. ABTS^+•, DPPH^•, Cu²⁺, Fe²⁺) w wyniku bezpośredniej reakcji chemicznej lub rodnikowej odczynnika i antyoksydantów obecnych w próbie.

2.1. Metoda z zastosowaniem odczynnika ABTS

Metoda ta po raz pierwszy została opisana w 1993 r. Rodniki ABTS generowane podczas reakcji z ferrylomioglobiną mają barwę niebieskozieloną i wykazują maksimum absorbancji przy kilku długościach fal 417, 645, 734, 815 nm. Obecność przeciwutleniaczy w roztworze powoduje redukcję kationorodnika i zanik barwy roztworu, a spadek jej intensywności jest proporcjonalny do zawartości przeciwutleniaczy. Schematy omówionych reakcji przedstawiono poniżej:

Mb-Fe (III) + H₂O₂ Mb-[Fe(IV)=O] + H₂O

ABTS + Mb-[Fe(IV)=O] ABTS^+• + Mb-Fe(III)

gdzie: Mb-Fe (III) - metmioglobina; Mb-[Fe(IV)=O] - ferrylomioglobina; ABTS^+• -
2,2' - azynobis (3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian).

Użycie odczynnika ABTS umożliwia pomiar całkowitej aktywności przeciwutleniającej zarówno próbek czystych substancji jak i całkowitej zdolności przeciwutleniającej prób żywności. Zawartość przeciwutleniaczy wyrażana jest jako ilość równoważników Troloksu na jednostkę objętości lub masę próby (TEAC).

2.2. Metoda z zastosowaniem odczynnika DPPH

Właściwości przeciwrodnikowe badanych naparów należy oznaczyć testem z zastosowaniem rodnika DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylhydrazyl). Metoda ta pozwala na określenie stopnia wygaszania rodnika DPPH w określonym czasie, zainicjowanego w obecności przeciwutleniacza. Rodnik 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazylowy jest stabilny, wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali λ = 515 nm. W obecności przeciwutleniacza ulega on redukcji, którą charakteryzuje zmiana barwy alkoholowego roztworu DPPH· z fioletowej na żółtą. Im silniejsze są właściwości przeciwutleniające danej próbki, tym zmniejszenie absorbancji odzwierciedlające redukcję rodnika DPPH jest większe. Próbki o mniejszej zdolności dezaktywacji wolnego rodnika wykazują niewielki spadek absorbancji.

Rys. Struktura DPPH.

2.3. Metoda oznaczania zdolności redukowania jonów żelaza - FRAP

Zasada tej metody polega na redukcji związku TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-S-triazyny) pod wpływem działania przeciwutleniacza do intensywnie niebieskiego produktu z maksimum absorpcji przy długości fali 595 nm. Ilościowo zdolność przeciwutleniającą próby oblicza się na podstawie porównania wartości zmiany absorpcji ΔA analizowanej próby z wartością ΔA wyznaczoną dla roztworu wzorcowego Fe (II). Wyznaczona wartość ΔA próby jest wprost proporcjonalna do stężenia przeciwutleniacza.

2.4. Metoda z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteau

Metoda Folina-Ciocalteau (F-C) stosowana do oznaczania całkowitej zawartości związków fenolowych w naturalnych produktach. Biorąc pod uwagę możliwości reagowania odczynnika F-C z wieloma innymi niż polifenole związkami o zdolnościach redukujących, metoda ta jest również zalecana do określania całkowitej zdolności przeciwutleniającej próby.

Odczynnik F-C jest przygotowywany z mieszaniny wolframianu sodu (Na₂WO₄), molibdenianu sodu (Na₂MoO₄), siarczanu litu (Li₂So₄), wody bromowej oraz stężonych kwasów solnego i fosforowego. Związki fenolowe reagują z odczynnikiem F-C tylko w środowisku alkalicznym po dodaniu węglanu sodu (pH ok. 10). W tych warunkach po dysocjacji fenolowego protonu powstaje anion fenolowy, który zdolny jest do redukcji odczynnika F-C. Mechanizm reakcji polega na przenoszeniu elektronu. Tworzenie niebieskiego barwnika w reakcji związków fenolowych z odczynnikiem F-C jest niezależne od struktury fenoli. W oznaczeniu tym stosowany jest kwasu galusowy jako standardowy związek do przeliczania wyników.

Zagadnienia do przygotowania:

W oparciu o w/w materiały

1. Zasady dozowania próby do chromatografu gazowego.

2. Typy dozowników do chromatografii gazowej.

3. Czynniki determinujące wybór odpowiedniej temperatury kolumny.

4. Dwie podstawowe metody analizy w GC w zależności od temperatury (charakterystyka, zalety, wady).

5. Charakterystyka detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID).

6. Ogólne zasady przygotowania prób fenolowych do badania właściwości przeciwutleniających.

7. Dwa typy mechanizmów reakcji dezaktywacji rodników, od czego zależą.

8. Różnice pomiędzy metodami addycyjnymi i postaddycyjnymi badania zdolności przeciwutleniających.

9. Charakterystyka poszczególnych metod badania właściwości przeciwutleniających: ABTS, DPPH, FRAP, Folina-Ciocalteau.

Korzystając z notatek na ćwiczeniach:

1. Na czym polegają analizy: jakościowa i ilościowa w GC.

2. Jak przeprowadza się identyfikację związków analizowanych w GC.

3. Podstawowe kwasy tłuszczowe (KT) w tłuszczu mlecznym (wzór uproszczony i nazwa):

1. nasycone krótko- i długołańcuchowe

2. jednonienasycone

3. wielonienasycone

4. posiadające łańcuchy nieparzyste i rozgałęzione (tylko wzory uproszczone bez nazw)

4. Prozdrowotna rola KT tłuszczu mlecznego oraz kwasów omega 3 (w tłuszczu rybim)

5. Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis w badaniach żywności (sprzężone dieny i trieny, własciwosci przeciwutleniające).

6. Znajomość doboru składu acyli w TAG w zależności od CN.

6

---