Ćwiczenie 3

Wpływ trucizn na działanie łańcucha oddechowego - inhibicja dehydrogenazy bursztynianowej i oksydazy cytochromowej

Wprowadzenie

Aby substancje odżywcze, będące składnikami diety człowieka zostały w pełni wykorzystane, muszą zostać poddane procesom katabolicznym, które można podzielić na trzy etapy (Rys. 1). Pierwszy etap obejmuje procesy trawienia związków wielkocząsteczkowych dostarczanych z pożywieniem: wielocukrów (również dwucukrów), tłuszczów i białek. Powstałe związki drobnocząsteczkowe: monocukry, glicerol, kwasy tłuszczowe i aminokwasy są wchłaniane z przewodu pokarmowego do krwioobiegu, skąd pobierane są przez komórki różnych tkanek, gdzie następuje ich dalszy katabolizm. Glukoza i kwasy tłuszczowe są głównymi związkami dostarczającymi energii. Drugi etap katabolizmu obejmuje procesy, w wyniku których glukoza i kwasy tłuszczowe oraz aminokwasy ulegają w komórce rozpadowi do acetyloCoA, który jest wspólnym metabolitem rozkładu wszystkich tych związków. Do tego etapu katabolizmu należą procesy β-oksydacji kwasów tłuszczowych, glikolizy i dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu. Etap trzeci katabolizmu to procesy związane z wytwarzaniem w komórce ATP, CO₂ i H₂O, w cyklu Krebsa i w łańcuchu oddechowym.

Łańcuch oddechowy jest układem białek enzymatycznych zlokalizowanym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej i uszeregowanym zgodnie ze wzrastającymi potencjałami utleniająco-redukującymi jego składników. Protony i elektrony z NADH+H⁺ i FADH₂ przejmowane są przez ogniwa łańcucha oddechowego i za ich pośrednictwem przekazywane na tlen cząsteczkowy z utworzeniem wody. Część energii uwalnianej podczas reakcji utleniająco-redukujących zachodzących w łańcuchu oddechowym jest wykorzystana do syntezy ATP. W ten sposób uwalnia się około 90% energii pochodzącej z przemian katabolicznych węglowodanów, tłuszczów i białek. Łańcuch oddechowy zużywa do syntezy wody około 90% wdychanego przez organizm tlenu. Proces syntezy ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego zachodzący podczas przepływu elektronów przez łańcuch oddechowy w obecności tlenu nazywany jest fosforylacją oksydacyjną. Jest to główna droga tworzenia ATP w komórce.

Oprócz fosforylacji oksydacyjnej istotne znaczenie ma fosforylacja substratowa. Jest to synteza ATP (lub GTP) zachodząca w wyniku wykorzystania energii rozpadu wiązania makroergicznego w substracie, nie wymagająca tlenu. Część energii uwalnianej podczas procesu glikolizy i cyklu Krebsa jest wykorzystana w ten sposób. Tworzenie ATP na drodze fosforylacji substratowej jest szczególnie istotne wtedy, kiedy z różnych przyczyn synteza ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej jest niemożliwa, np. w krwince czerwonej, intensywnie pracujących mięśniach szkieletowych, czy w niedotlenionym mięśniu sercowym.

W procesach katabolicznych zachodzących w organizmie zasadniczą rolę odgrywają dehydrogenazy, enzymy które przejmują atomy wodoru od utlenianych substratów. Dehydrogenazy cytoplazmatyczne pośrednio, a dehydrogenazy mitochondrialne bezpośrednio, związane są z łańcuchem oddechowym. Za jego pośrednictwem zredukowane w reakcjach utlenienia koenzymy dehydrogenaz NADH+H⁺ i FADH₂ ulegają utlenieniu, co jest warunkiem dalszego działania współdziałających z nimi enzymów, a więc i procesów, w których te enzymy uczestniczą.

Prawidłowe funkcjonowanie enzymów może zostać zmienione poprzez działanie związków toksycznych. Mechanizm działania toksyn jest bardzo zróżnicowany. Toksyny, które hamują reakcje enzymatyczne, z powodu podobieństwa do substratu określamy jako inhibitory kompetycyjne. Mechanizm działania inhibitorów kompetycyjnych polega na współzawodnictwie między substratem a inhibitorem o centrum aktywne enzymu i jest odwracalne. Inhibitor kompetycyjny, podobny strukturalnie do właściwego substratu, łączy się z enzymem tworząc nieaktywny kompleks enzym-inhibitor. Stopień zahamowania reakcji zależy od stosunku stężeń inhibitora i substratu. Zwiększenie stężenia substratu może cofnąć tworzenie kompleksu enzym-inhibitor i znieść działanie inhibitora. Część toksyn wiąże się z enzymami w sposób trwały, uszkadzając nieodwracalnie strukturę białkową enzymu lub blokując jony metali związane bezpośrednio z działaniem enzymu.

Dehydrogenaza bursztynianiowa jest flawoproteiną katalizującą reakcję utlenienia bursztynianu do fumaranu (Rys. 2). Jest jedynym enzymem cyklu Krebsa związanym z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Wchodzi w skład II kompleksu białkowego łańcucha oddechowego (reduktazy bursztynian-ubichinon), dzięki któremu FADH₂ dehydrogenazy bursztynianowej ulega utlenieniu, a protony i elektrony są przekazywane na łańcuch oddechowy. Malonian jest najbardziej znanym inhibitorem kompetycyjnym tego enzymu, o budowie podobnej do bursztynianu. Mniej znaną toksyną hamująca dehydrogenazę bursztynianowa w podobny sposób jest pirofosforan. W przemyśle spożywczym używane są zarówno pochodne malonianu jak i pirofosforanu. Pirofosforany wykorzystywane są do zwiększenia trwałości mięsa oraz poprawy jego jakości mikrobiologicznej. Pirofosforany stosuje się także do polepszenia soczystości i kruchości mięsa. W piekarnictwie, pirofosforan służy jako środek regulujący proces pieczenia. Związki malonianu, a przede wszystkim malonian dietylu stosowany jest jako dodatek do żywności (środek aromatyzujący). Ze względu na potencjalne działanie inhibujące, użycie wymienionych środków spożywczych podlegać musi ścisłej kontroli.

Oksydaza cytochromowa stanowi IV kompleks białkowy łańcucha oddechowego. Jest hemoproteiną zbudowaną z 10 łańcuchów polipeptydowych, zawiera w swojej budowie cytochromy a i a₃ oraz dwa jony miedzi, które razem z jonami żelaza cytochromów biorą udział w transporcie elektronów. Oksydaza cytochromowa jest ostatnim ogniwem łańcucha oddechowego, utlenia cytochrom c i reaguje bezpośrednio z tlenem cząsteczkowym. Tlen dzięki działaniu oksydazy cytochromowej redukuje się kosztem utlenienia dwóch jonów Fe²⁺ i dwóch jonów Cu⁺, a następnie przyłącza cztery jony H⁺ tworząc wodę.

Reakcja katalizowana przez oksydazę cytochromową:

4 cyt. c (Fe²⁺) + O₂ + 4H⁺ → 4 cyt. c (Fe³⁺) + 2H₂O

Prawidłowe działanie oksydazy cytochromowej może zostać zablokowane przez szereg silnie toksycznych związków takich jak cyjanek, siarkowodór, azydek i tlenek węgla. Ich trujące działanie polega na blokowaniu procesu oddychania na poziomie komórkowym poprzez nieodwracalną inhibicję oksydazy cytochromowej. W efekcie, mimo iż transport tlenu z płuc do tkanek jest zachowany, dochodzi do hipoksji tkankowej. Najbardziej znana trucizna, cyjanek potasu, łatwo wchłania się do organizmu przez błony śluzowe, drogi oddechowe, skórę i z przewodu pokarmowego. Toksyczność cyjanku wynika z właściwości kompleksotwórczych. Wiąże się on do oksydazy cytochromu c , a dokładniej do jonów żelaza i miedzi obecnych w cząsteczce enzymu powodując jego inaktywację. Może prowadzić to do śmierci komórki, a w dalszych etapach tkanki, a nawet całego organizmu.

Poznanie mechanizmu hamowania kompetycyjnego nie tylko umożliwiło wyjaśnienie sposobu działania wielu toksyn, wykorzystane zostało także do opracowania skutecznych leków, których działanie oparte jest na inhibicji kompetycyjnej. Spektakularnym przykładem są tu statyny, grupa leków stosowanych w celu obniżenia poziomu cholesterolu we krwi. Leki te działają przez hamowanie kompetycyjne kluczowego enzymu dla endogennej syntezy cholesterolu tj.reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylokoenzymu A (HMG-CoA). W leczeniu hipercholesterolemii stosowanych jest kilka leków z grupy statyn m. in. lowastatyna (Rys. 3), simwastatyna, prawastatyna oraz atorwastyna, fluwastatyna, rosuwastatyna, pitawastatyna. Hamują konwersję HMG-CoA do prekursora steroli, mewalonianu, i w efekcie zmniejszają syntezę cholesterolu w hepatocytach. Powoduje to większą ekspresję genu receptorów dla LDL i, co za tym idzie, większy wychwyt cząstek LDL. W efekcie prowadzi to do obniżenia stężenie cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL we krwi.

Rys. 3. Struktura lowastatyny- inhibitora kompetycyjnego reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-koenzymu A.

Część doświadczalna

1. Wpływ inhibitorów kompetycyjnych na działanie dehydrogenazy bursztynianowej

Zasada metody

W doświadczeniu zastosowano dwa inhibitory kompetycyjne dehydrogenazy bursztynianowej - malonian i pirofosforan. Do wykrywania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej zastosowano sztuczny akceptor elektronów dichlorofenoloindofenol (DCPI), który jest barwny w formie utlenionej, a bezbarwny w formie zredukowanej. Standardowy potencjał redoks dla DCPI wynosi +0,22 V. Potencjał utleniająco-redukujący tego związku jest wyższy od potencjału oksydoredukcyjnego dla FAD/FADH₂, który wynosi -0,06 V i dlatego protony z FADH₂ są odbierane przez DCPI. Związane z redukcją odbarwienie DCPI ( Rys. 4) świadczy o przebiegu reakcji enzymatycznej, katalizowanej przez dehydrogenazę bursztynianową. Brak odbarwienia wskazuje na działanie czynników inhibujących na enzym.

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 1 mol/dm³ roztwór bursztynianu sodu.

3. 0,008% roztwór DCPI.

4. 0,5 mol/dm³ roztwór malonianu sodu.

5. 5% roztwór pirofosforanu sodu.

6. 0,1 mol/dm³ roztwór KCN.

7. 1% homogenat wątroby.

8. zagotowany 1% homogenat wątroby.

Wykonanie doświadczenia

Do 7 probówek dodać odczynniki według tabeli .

	1	2	3	4	5	6	7
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
1 mol/dm^3 bursztynian	0,2	-	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
0,008% DCPI	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
5% pirofosforan	-	-	0,5	-	-	-	-
0,5 mol/dm^3 malonian	-	-	-	0,5	-	-	-
0,1 mol/dm^3 KCN	-	-	-	-	0,2	-	-
H2O	0,5	0,7	-	-	0,3	0,5	0,7
1% homogenat wątroby	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2^+	-

+ homogenat zagotowany

Zawartość probówek wymieszać.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zanotować zmianę zabarwienia po 30 minutach i po 60 minutach.

2. Wpływ cyjanku potasu na działanie oksydazy cytochromowej

Zasada metody

W doświadczeniu zastosowano p-fenylenodiaminę jako sztuczny donor elektronów. Potencjał redox p-fenylenodiaminy jest nieco niższy od potencjału cytochromu c, dlatego w obecności tlenu p-fenylenodiamina będzie się utleniać, pod warunkiem, że oksydaza cytochromowa będzie aktywna, a ilość cytochromu c mającego kontakt z enzymem i z p-fenylenodiaminą będzie dostateczna. Pojawiające się zabarwienie świadczy o utlenieniu p-fenylenodiaminy, a tym samym o przebiegu reakcji enzymatycznej (Rys. 5). Na powietrzu związek ten praktycznie nie utlenia się bez udziału oksydazy cytochromowej.

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,01% roztwór cytochromu c.

3. 0,1 mol/dm³ roztwór KCN.

4. 1% roztwór p-fenylenodiaminy.

5. 5% homogenat serca.

6. zagotowany 5% homogenat serca.

Wykonanie doświadczenia

Do 6 probówek dodać odczynniki według tabeli .

	1	2	3	4	5	6
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,01% cytochrom c	-	0,1	0,1	0,1	0,1	-
0,1 mol/dm^3 KCN	-	-	-	-	3 kr.	-
H2O	1,0	0,9	0,6	0,6	0,5	0,7
1% p-fenylenodiamina	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
5% homogenat serca	-	-	0,3^+	0,3	0,3	0,3

+ homogenat zagotowany

1. Po dodaniu odczynników zawartość probówek wymieszać.

2. Obserwować zmiany zabarwienia w czasie.

3. Zinterpretować otrzymane wyniki.

Dla większości drobnocząsteczkowych metabolitów wewnętrzna błona mitochondrialna ma bardzo ograniczoną przepuszczalność. Natomiast błona zewnętrzna działa jak sito molekularne, przepuszcza związki o masie cząsteczkowej nie przekraczającej 10 000 daltonów. Egzogenny cytochrom c, którego masa cząsteczkowa wynosi 12 600 daltonów, nie przechodzi przez nienaruszoną błonę zewnętrzną. Jeżeli część mitochondriów uległa uszkodzeniu np. na skutek zbyt silnej homogenizacji, to egzogenny cytochrom c wchodzi w kontakt z oksydazą cytochromową, która zlokalizowana jest w błonie wewnętrznej, tuż przy jej zewnętrznej powierzchni. Wówczas w wyniku wzrostu stężenia cytochromu c nastąpi wzrost aktywności oksydazy cytochromowej. Jeżeli bardzo mała ilość mitochondriów serca została uszkodzona podczas homogenizacji to roztwory w probówkach 4 i 6 będą miały podobne zabarwienie.

3. Oznaczanie cholesterolu - zadanie indywidualne

Zasada metody

W obecności stężonego kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego z cholesterolu tworzy się kwas monosulfonowy bicholestadienu o barwie niebieskozielonej. Intensywność powstającego zabarwienia jest proporcjonalna do ilości cholesterolu w badanej próbie.

Odczynniki

Wzorcowy roztwór cholesterolu o stężeniu 250 mg/100 cm³

Odczynnik Liebermanna-Burcharda ( stężony kwas octowy, stężony kwas siarkowy oraz bezwodnik kwasu octowego w stosunku 1:5:1 ( Uwaga odczynnik żrący!)

Wykonanie doświadczenia

Przygotować trzy suche probówki i dodać do nich:

0,2 cm³ wzorcowego roztworu cholesterolu

0,2 cm³ zadania indywidualnego

0,2 cm³ wody (próba ślepa)

Do wszystkich probówek dodać 4,5 cm³ odczynnika Liebermanna-Burcharda, dobrze wymieszać i odstawić na 10 minut. Następnie zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm. Całkowite stężenie cholesterolu w zadaniu indywidualnym wyliczyć ze wzoru:

Stężenie cholesterolu = A₆₈₀ zadania ind./ A₆₈₀ wzorca X stężenie wzorca

(mg/100 cm³)

4

---