Tadeusz Trzmiel

Instytut Biochemii Technicznej

I. Biotransformacja

Transformacja - przekształcenie, przeobrażenie.

Biotransformacja to jednoetapowe (rzadziej dwuetapowe) przekształcenie chemiczne egzogennych związków organicznych w strukturalnie im podobne produkty dokonywane przez żywą komórkę.

1. Idea biotransformacji jako bioprocesu

Produkty biotransformacji bardzo często nie mają żadnego znaczenia dla komórki, a niekiedy wręcz mogą okazać się dla niej toksyczne (np. produkty biotransformacji steroidów). Biotransformacja nie jest celem działania komórki; zachodzi ona często jako proces niezależny od jej funkcji życiowych.

Biotechnolog wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podstawia jej pewne związki organiczne i oczekuje, że zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami.

Ważne jest skojarzenie:

Drobnoustrój ⇒ enzym ⇒ możliwa biotransformacja

Można uznać, że w wielu przypadkach „komórka nawet nie zdaje sobie sprawy z tego, że zostaje oszukana i wykorzystana do przekształcenia podsuniętego jej związku organicznego”.

Przykładem może być reakcja kondensacji. Podstawia się komórce egzogenny związek a komórka nieświadomie kondensuje go z naturalnym metabolitem występującym w komórce np. acetylo~SCoA. Tym egzogennym substratem może być np. anilina:

Biotransformację mogą prowadzić:

1. Komórki wegetatywne (w fazie wzrostu)

2. Komórki wegetatywne (w fazie spoczynku)

3. Komórki drobnoustrojów immobilizowanych

4. Komórki drobnoustrojów wysuszonych

5. Formy przetrwane drobnoustrojów

Biotransformacja jest procesem (reakcją) wysoce specyficzną pod względem: kierunku, swoistości substratowej oraz stereospecyficzności.

Stereospecyficzność. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.

Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.

Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi. Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP-1-glukozę w UDP-1-galaktozę.

Regioselektywność

Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego specyficzności kierunkowej.

Na rys. 1. przedstawiono przykłady reakcji regioselektywnej hydrolizy estrów karboksylowych katalizowanych przez subtilizynę. Estry dibenzylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego są hydrolizowane przy pierwszym atomie węgla. Natomiast estry etylowe kwasu cytrynowego i 1,2,3-trikarboksylopropanu są hydrolizowane przy środkowym atomie węgla. Okazało się, że inne możliwe regioizomeryczne estry nie były wykrywane wśród produktów hydrolizy.

Regioselektywna hydroliza estrów katalizowana przez subtilizynę

Monooksygenazy wielu mikroorganizmów mogą regioselektywnie i stereospecyficznie hydroksylować steroidy. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji  lub  oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy od użytego szczepu oraz w pewnym stopniu od budowy cząsteczki substratu. Bakterie B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji  i  (rys. 11.) Monooksygenazy szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15  i , 6  oraz 11.

2. Reakcje wykorzystywane w biotransformacji

Dehydrogenazy sprzężone z NAD utleniające grupę -OH (EC.1.1.1.).

Utlenienie grupy hydroksylowej do ketonowej przez 17--dehydrogenazę estradiolową (EC.1.1.1.62) sprzężoną z NAD.

Oksydazy (EC.1.1.3.) utleniające grupę -OH.

Odwodornienie

Duże znaczenie praktyczne w produkcji związków steroidowych ma reakcja odwodornienia w pozycji ^ pierścienia A. Do przekształcenia kortyzonu w prednizon (a także innych analogów kortykosteroidowych) można zastosować bakterie B.lentus lub B.sphaericus (rys.6.10.). Dzięki działaniu ^-dehydrogenazy 3-oxosteroidowej (EC.1.3.99.4.) w sposób wybiórczy ulega odwodornieniu wyłącznie pierścień A, a ilość reakcji ubocznych jest niewielka w porównaniu do pojawiających się podczas stosowania do tego celu innych drobnoustrojów.

Rys. 6.10. ^ odwodornienie kortyzonu przez B.lentus lub B.sphaericus

Redukcja

(Nie mylić z dehydrogenazą bursztynianową sprzężoną z FAD).

Transferazy

Acylacja, deacylacja

Metylacja, demetylacja

aminacja

glikozylacja

transketolizacja, transaldolizacja

Hydrolazy

Wybierane wybiórczo dla konkretnego procesu (m.in. esterazy, proteinazy, itp.)

Liazy

EC 4.1. - rozerwanie wiązania C-C (np. dekarboksylazy)

EC 4.3. - rozerwanie wiązania C-N (np. amoniakoliaza asparaginianowa - aspartaza).

Izomerazy

Izomeryzacja (np. cis, trans)

Epimeryzacja

Racemizacja

Ligazy

Syntetazy (np. amidacja -CONH₂ - syntetaza asparaginianowa)

3. Przykłady biotransformacji

Najstarszym znanym przykładem biotransformacji jest utlenienie etanolu do kwasu octowego (produkcja octu winnego). U bakterii Acetobacter występuje bardzo silnie rozwinięta zdolność do katalizowania tej reakcji (z uwagi na dehydrogenazę alkoholową). Wydajność procesu sięga 90%.

3.1. Hydroliza estrów.

Wykorzystanie biotransformacji w procesach przemysłowych wymagających stosowania wysoko selektywnych reakcji hydrolitycznych (do których należy zaliczyć znaczną część reakcji hydrolitycznego rozkładu estrów pochodzenia nie naturalnego) ograniczone jest niewielką ilością odpowiednich enzymów drobnoustrojowych. W przeciwieństwie do lipaz, esterazy właściwe- a więc o takiej specyficzności, jaką wykazują esterazy izolowane z wątroby świni (PLE) lub konia (HLE) - są słabo rozpowszechnione u drobnoustrojów. Szczęśliwie, u niektórych mikroorganizmów (m.in. u B.subtilis i B.coagulans) znaleziono nowy typ esteraz (tzw. karboksyloesterazy - NP), wykazujące wysoką specyficzność dla pewnego rodzaju substratów. Ponieważ enzymy te są częściowo lub całkowicie wewnątrzkomórkowe konieczne okazało się, używanie całych komórek bakterii (ewentualnie immobilizowanych) lub ich fragmentów w procesach biotransformacji, w których znalazły zastosowanie. Znacznie rzadziej wykorzystuje się izolowane z nich enzymy.

Wykazano, że reakcja hydrolitycznego rozkładu estrów prowadzona z udziałem bakterii z rodzaju Bacillus może być wysoce stereospecyficzna i regioselektywna, co ma niewątpliwie istotne znaczenie z praktycznego punktu widzenia, (np. przy rozdziale enancjomerów lub hydrolizie estrów związków z kilkoma chiralnymi atomami węgla). Poniżej podano kilka takich przykładów.

Przykład dotyczy hydrolizy racemicznych estrów kwasów i alkoholi z kilkoma chiralnymi atomami węgla (rys. 2). Komórki B.subtilis var. niger IFO 3108 zastosowano do hydrolizy racemicznej mieszaniny octanu trans/cis-2,trans-4-dimetylocykloheksanolu. W wyniku tej reakcji rozdzielono obydwa enancjomery, otrzymując alkohol trans-2,trans-4-dimetylocykloheksanolowy z wydajnością 94%.

Rys. 2. Hydroliza racemicznych estrów z chiralnymi atomami węgla przez B.subtilis

Przykładem może być rozdział mieszaniny podstawionych eneancjomerów -arylo- i -aryloksy pochodnych kwasu propionowego (rys. 1.). Pochodne te znane są dobrze jako leki przeciwzapalne (np. Naproxen) i agrochemikalia (np. Diclofop). Jednakże główną biologiczną aktywność wykazuje z reguły jedynie jeden z enancjomerów (np. S w przypadku Naproxenu). Cytowany przykład pokazuje możliwość zastąpienia konwencjonalnej metody rozdziału tych enancjomerów przez biotransformację z wykorzystaniem fragmentów komórek Bacillus sp. lub esterazy z nich izolowanej.

3.1. Produkcja aminokwasów

Naturalnie występujące w świecie ożywionym L-aminokwasy, których roczne zapotrzebowanie przekracza 1000 ton (np. kwas L-glutaminowy i L-lizyna) produkuje się na drodze biosyntezy. Inne aminokwasy, zwłaszcza szeregu D-, które są niezwykle wartościowe dla przemysłu farmaceutycznego i agrochemicznego, otrzymuje się skojarzonymi metodami enzymatyczno-chemicznymi. Przykładem takiej metody może być produkcja D-aminokwasów poprzez stereospecyficzną (S-specyficzną) hydrolizę odpowiednich pochodnych hydantoiny. Pochodne te, stanowiące mieszaninę D- i L-enancjomerów, otrzymuje się znanymi metodami chemicznymi (np. metodą Bücherera-Berga). Z racematu tego można wydzielić D-aminokwas w procesie biotransformacji, wykorzystując komórki B.brevis lub w procesie enzymatycznej transformacji używając hydantoinazę (L-5-karboksylometylohydantoinaza - EC.3.5.2.4.) produkowaną przez te same bakterie. (rys. 6.6.).

Rys. 6.6. Rozdział pochodnych D,L-hydantoiny z wykorzystaniem enzymów bakterii Bacillus

Hydantoinaza działa stereospecyficznie, powodując rozerwanie jedynie pierścienia D-hydantoiny, w wyniku czego powstaje rozpuszczalna pochodna N-karbamoilowa D-aminokwasu. Przy odpowiednim pH nierozpuszczalna pochodna L-hydantoiny szybko ulega racemizacji, tak że wydajność procesu sięga 100% teoretycznej. W następnym etapie produkcyjnym powstały N-karbamoilo D-aminokwas poddaje się hydrolizie konwencjonalnymi metodami, otrzymując w efekcie D-aminokwas. Ostatnio podjęto próby zastosowania amidohydrolazy wytwarzanej przez B.subtilis do tego etapu produkcyjnego i wiele wskazuje na to (m.in. końcowa wydajność 92%), że próba ta ma potencjalnie dużą szansę powodzenia.

Na drodze biotransformacji hydantoiny na dużą skalę produkuje się obecnie D-(4-hydroksylofenylo)glicynę, która jest półproduktem do wytwarzania amoxiciliny, ważnego półsyntetycznego antybiotyku (o czym będzie mowa poniżej).

Jak już wspomniano do rozdziału racemicznych mieszanin niepolarnych estrów N-acetylo- DL- aminokwasów używa się subtilizyny (korzystnie, jeśli jest ona immobilizowana), wykorzystując jej zdolność do hydrolizy wyłącznie estrów L-aminokwasów (rys. 6.7.).

Rys. 6.7. Rozdział racematu estru N-acetylo- DL- aminokwasu z wykorzystaniem subtilizyny

Wypada w tym miejscu wspomnieć, że niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus zdolne są w odpowiednich warunkach do nadprodukcji aminokwasów i stąd bezpośrednio bywają używane do ich biosyntezy. I tak np. B.subtilis w podłożach hodowlanych z dodatkiem prekursora (jakim jest 2-ketomaślan) może nagromadzać L-izoleucynę, a z kolei B.flavum w podłożach z octanami nagromadza L-glutaminian.

3.2. Produkcja półsyntetycznych antybiotyków

Głównym półproduktem do otrzymywania szeregu półsyntetycznych penicylin (m.in. ampicyliny i amoxiciliny) jest kwas 6-aminopenicylinowy (kwas 6-AP). Otrzymuje się go przez biotransformację penicyliny G (benzylopenicyliny) lub penicyliny V (fenoksymetylopenicyliny). Oba te związki, również wykazujące właściwości antybiotyków, produkuje się na drodze biosyntezy w hodowlach pleśni Penicillium. Do ich przekształcenia w kwas 6-AP wykorzystuje się immobilizowaną amidazę penicylinową pozyskiwaną z bakterii E.coli ewentualnie B.sphaericus lub B.megaterium. Enzym odszczepia boczny łańcuch w penicylinie G lub V, nie degradując wrażliwego chemicznie pierścienia -laktamowego (rys. 6.8.).

Rys. 6.8. Transformacja penicylin z wykorzystaniem acylazy penicylinowej B.sphaericus lub B.megaterium

Proces enzymatycznej transformacji został dokładnie poznany oraz rozpracowany i obecnie stosowany jest powszechnie w przemyśle farmaceutycznym. Jego wydajność sięga 93%. Na miejsce usuniętego łańcucha bocznego w kwasie 6-AP wprowadza się nowy łańcuch, np. D-(4-hydroksyfenylo)glicyny, której otrzymywanie na drodze biotransformacji z wykorzystaniem hydantoinazy omówiono wcześniej. Ponowne użycie amidazy penicylinowej przy obniżonym pH do 5, prowadzi do rewersji reakcji hydrolizy i na drodze enzymatycznej możliwe jest przyłączenie do kwasu 6-AP nowego łańcucha. Wydajność tej reakcji dla D-fenyloglicyny wynosi 50%, a dla jej estru etylowego wzrasta do 80%.

Omówioną reakcję enzymatycznej transformacji penicylin wykorzystuje się podobnie w produkcji antybiotyków cefalosporynowych. W ich przypadku sięgnięto dodatkowo po acetylotransferazę wytwarzaną przez bakterie B.subtilis. Dzięki jej działaniu (rys. 6.9.), kwas 7-aminocefalosporynowy (kwas 7-AC) ulega przekształceniu w kwas deacetylo-7-aminocefalosporynowy (kwas 7-ADC). Wydajność tej reakcji wynosi 100%, pozwalając w ciągu 3 godzin przekształcić 24g kwasu 7-AC w przeliczeniu na 1 dm³ reaktora.

Rys. 6.9. Transformacja cefalosporyn z wykorzystaniem acetylotransferazy B.subtilis

3.3. Oksydaza glukozowa

Szczepy Aspergillus, Penicillium, Acetobacter, Gluconobacter oraz Pseudomonas wytwarzają oksydazę glukozową (EC 1.1.3.4). Enzym ten katalizuje utlenienie D-glukozy do δ-D-glukonolaktonu.

Enzym jest częściowo wewnątrz-, a częściowo pozakomórkowy. Jest to enzym indukcyjny - induktorem jego biosyntezy jest glukoza. Intensywnej biosyntezie sprzyja pH 6,0-6,5 i silne natlenienie podłoża hodowlanego.

Zastosowanie oksydazy glukozowej:

1. do produkcji glukonianów:

• Glukonian sodowy - środek alkalizujący (np. myjnie butelek, itp.),

• Glukonian wapniowy - lek (w terapii wapniowe).

Przemysł spożywczy, analityka biochemiczna, biosensory, diagnostyka laboratoryjna.

Wytwarzanie

Podłoże hodowlane: glukoza (stężenie > 150g/dm³), namok kukurydziany, PO₄^3-, NH₄⁺, Mg²⁺, CaCO₃ lub NaOH dozowany do pH 6,0.

Temp. 30°C, hodowla wgłębna, tlen w podłożu około 80% nasycenia, 24 godziny.

Wyodrębnianie produktu

Podłoże pohodowlane

Oddzielanie biomasy

supernatant lub przesącz biomasa (grzybnia Asp. Niger)

neutralizacja dezintegracja komórek

(pH 7, 100°C, mieszanie)

autoliza (bufor)

krystalizacja

(etanol, 20°C)

oddzielanie biomasy

wirowanie + przemywanie wodą

roztwór

suszenie (80°C) wysalanie

Kryształy glukonianu wapnia Oksydaza glukozowa

3.4. Kwas asparaginowy

Kwas asparaginowy znalazł zastosowanie w lecznictwie lub przemyśle spożywczym.

Wykorzystuje się reakcję transformacji kwasu fumarowego do kwasu asparaginowego katalizowaną prze amoniakoliazę asparaginianową (aspartazę - EC 4.3.1.1.). Enzym ten jest mało stabilny, wrażliwy na wiele czynników pozakomórkowych. Dlatego w praktyce stosuje się dwa różne typy procesu technologicznego: z immobilizowanymi komórkami lub immobilizowanym enzymem.

Typ I technologii. Wykorzystuje się E.coli - szczep specjalnie wyizolowany i udoskonalony na drodze mutacji genetycznej o zwiększonej produktywności aspartazy. Komórki immobilizuje się na poliakryloamidzie lub wg nowszego patentu na karaginianie aktywowanym aldehydem glutarowym i heksametylenodiaminą [podobne prace z subtilizyną autorstwa Trzmiela z 1991].

Bioproces: bioreaktor sekcyjny w kształcie kolumny wypełniony nośnikiem z immobilizowanymi komórkami E.coli przemywa się przez 48 godzin 1M wodnym roztworem substratu o pH8,5 (powolna częściowa liza komórek) i temp. 27°C. pH8,5 sprzyja powolnej częściowej lizie komórek, co zwiększa przepuszczalność błony komórkowej. Substrat dostaje się do wnętrza komórki, gdzie zostaje transformowany i następnie wydzielany na zewnątrz. Aktywatorem reakcji są jony Mg²⁺.

Typ II technologii. Wykorzystuje się immobilizowany enzymu. Operacyjny okres połowicznego zaniku aktywności immobilizowanego enzymu wynosi 2 lata. Ogólny schemat technologiczny procesu jak w typie I.

3.5. Kwas jabłkowy

Wykorzystuje się bądź enzym - z cyklu Krebsa - hydratazę fumaranową (EC 4.2.1.2) lub też komórki Brevibacterium ammoniogenes albo B.flavum. Komórki bakterii immobilizuje się na żelu poliakrylo-amidowym.

Substrat: 1M fumaran sodu, pH 7,0- 7,3 temp. 37°C, szybkość przepływu przez kolumnę 0,2 dm3/dm3 wypełnienia/h. Wydajność procesu 70%. Aktywatorem proce-su są związki powierzchniowo czynne (ostatnio biosurfaktanty) zwiększające przepuszczalność błony komórkowej.

Produktem ubocznym jest kwas bursztynowy:

II. Biotransformacja steroidów

2. Ogólne wiadomości o hormonach steroidowych

2.1. Budowa i nazewnictwo hormonów steroidowych

Steroidy swą nazwę wywodzą od steranu (cyklopentanoperhydrofenantrenu), którego są pochodnymi. Steran posiada rdzeń cykliczny, przypominający fenantren (pierścienie A, B i C), do którego jest dołączony cyklopentan (D). Atomy węgla w rdzeniu steroidowym są numerowane jak pokazano poniżej:

Nazwa związków steroidowych zawiera przedrostek określający stereochemię (np. α, izo-, epi-, allo-), a odpowiedni wzór strukturalny wskazuje konfigurację absolutną na każdym chiralnym atomie węgla.

Przestrzenne usytuowane atomów lub grup atomów przyłączonych do układu pierścieniowego we wzorach steroidów oznacza się przy pomocy określników. Określnik α oznacza, że znajdują się one pod płaszczyzną papieru, a β że znajdują się nad płaszczyzną. We wzorze androstanu wiązania z atomami wodoru znajdującymi się pod płaszczyzną papieru oznaczono przerywaną linią (----), natomiast wiązania z grupami metylowymi leżącymi nad płaszczyzną oznaczono linią ciągłą (——).

Ze względu na asymetrię cząsteczki steroidu możliwe jest istnienie wielu stereoizomerów. Każdy z pierścieni sześciowęglowych rdzenia steroidowego może istnieć w trójwymiarowej konformacji „krzesełkowej lub łódeczkowej”.

Konformacja krzesełkowa Konformacja łódeczkowa

Konformacje cykloheksanu.

W steroidach naturalnych wszystkie pierścienie występują właściwie w formie krzesełkowej, która jest bardziej stabilną konformacją. Poszczególne pierścienie mogą znajdować się względem siebie w konformacji cis lub trans, co przedstawiono na rys 2.

W naturalnych steroidach sposób połączenia pierścieni A / B może być cis lub trans (stąd dwie serie steroidów - α i β), między B / C jest zawsze trans, natomiast połączenie C/D jest trans z wyjątkiem glikozydów nasercowych i jadów wydzielanych przez ropuchy.

Przedrostek izo- stosuje się wtedy, gdy pojawia się inny asymetryczny układ C-C aniżeli 5-10 (np. wspomniany już układ cis przy 13 i 14 atomie węgla z podstawnikiem -CH₃ lub atomem H). Jeżeli podstawnikiem przy węglu 13 lub 14 jest -OH stosuje się przedrostek epi-.

Związki steroidowe, które można rozpatrywać jako produkty modyfikacji lub podstawienia związku podstawowego, nazywa się w myśl ogólnych zasad nomenklatury chemii organicznej. Dla ważnych pochodnych steroidowych, które przeważnie są związkami naturalnymi o silnym działaniu biologicznym stosuje się nazwy zwyczajowe. W tabeli 1 podano kilka przykładów.

Rys. 2 Stereochemia steroidów:

A - konfiguracja trans między wszystkimi sąsiadującymi pierścieniami

B - konfiguracja cis między pierścieniami A / B

Tabela 1. Przykłady nazewnictwa niektórych steroidów

Aldosteron	18,11-Hemiacetal-11β,21-dihydroksy -3,20-dioksy-4-pregen-18-alu
Cholesterol	5-Cholesten-3β-ol
Estriol	1,3,5(10)-Estratrien-3,16α,17β-triol
Estron	3-Hydroksy-1,3,5(10)estratrien-17-on
Kortyzol	11β,17,21-Trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion
Kortyzon	17,21-Dihydroksy-4-pregnen-3,11,20-trion
Kortykosteron	11β,21-Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion
Progesteron	4-Pregnen-3,20-dion
Testosteron	17β-Hydroksy-4-androsten-3-on

2.2. Naturalne hormony steroidowe

Nazwy hormonów steroidowych wywodzą się od węglowodorów macierzystych:

Związek macierzysty	Hormon	Przykład
Estran	estrogeny (żeńskie hormony płciowe)	Estradiol Δ^2Δ^4Δ^10-estran-3β,17β-diol
Androstan	Androgeny (męskie hormony płciowe)	Testosteron Δ^4-androstan-17β-ol-3-on
Pregnan	gestageny (hormony ciałka żółtego) kortykosteroidy (hormony kory nadnerczy)	Progesteron (hormon ciąży)

Wszystkie hormony steroidowe pochodzą z wyżej wymienionych prekursorów. Hormony te można podzielić na następujące grupy:

A: Hormony steroidowe kory nadnerczy:

• mineralokortykosteroidy (wytwarzane w warstwie kłębkowatej), należy tu aldosteron

• glikokortykosteroidy -należy tu kortyzol (wytwarzany w warstwie pasmowatej) oraz kortykosteron (syntetyzowany zarówno w warstwie pasmowatej jak i kłębkowatej)

• w warstwie pasmowatej i siatkowatej kory nadnerczy wytwarzany jest w dużych ilościach prekursor androgenów- dehydroepiandrosteron oraz słaby androgen androstendion

• androgeny pochodzenia nadnerczowego -są to ważne prekursory estrogenów (powstających przez aromatyzację androgenów w tkankach obwodowych ) u kobiet w okresie pomenopauzalnym

B: Hormony steroidowe gonad:

- hormony żeńskie:

• estrogeny- tworzą grupę hormonów syntetyzowanych w różnych tkankach. Biosynteza estrogenów odbywa się głównie w komórkach ziarnistych pęcherzyka jajnikowego. W mniejszych ilościach estrogeny powstają w komórkach ciałka żółtego, łożysku i nadnerczach. Współczesne poglądy na temat biosyntezy estrogenów uwzględniają tzw. teorię dwóch przedziałów.

• gestageny- hormony ciałka żółtego których przedstawicielem jest progesteron

- hormony męskie

• 
  androgeny- wśród których wyróżniamy: testosteron, androsteron, androstenolon. Wytwarzane są one przez komórki Leydiga zlokalizowane w tkance śródmiąższowej.

Aldosteron Kortyzol Kortykosteron

Dehydroepiandrosteron 17-β-estradiol Estron

Estriol Progesteron Testosteron

2.3. Biotransformacja związków steroidowych

Hormony steroidowe opisane w poprzednim rozdziale wytwarzane są w tkankach i gruczołach wydzielania wewnętrznego. W lecznictwie mogą być stosowane hormony naturalne, lecz obecnie zostały one niemal całkowicie wyparte przez analogi syntetyczne. Sterole roślinne: stygmasterol, β- i γ-sitosterole, oraz diosgenina są podstawowymi surowcami do produkcji leków steroidowych. Chemi- czna synteza związków steroidowych wymaga przeprowadzenia szeregu operacji technologicznych. Wprowadzenie mikrobiologicznej biotransformacji umożliwiło znaczne usprawnienie tego procesu. Mikrobiologiczna degradacja łańcuchów bocznych steroli przebiega bowiem z wydajnością 70 - 90 %. Procesy biotransformacji steroidów obejmują zarówno przemiany zachodzące w obrębie układu pierścieniowego, jak i w łańcuchu bocznym łącznie z jego degradacją. Na rys. 4 przedstawiono ogólny schemat reakcji biotransformacji związków steroidowych. Pokazane tam przemiany prowadzone są przez drobnoustroje z rodzajów: Nocardia, Streptomyces, Corynebacterium, Mycobacterium i inne. Znaczenie przemysłowe mają te produkty, które zawierają grupę ketonową w pozycji C-17 oraz grupę karboksylową w pozycji C-20, a także produkty z ugrupowaniem laktonowym w pierścieniu D.

Rys. 4. Ogólny schemat reakcji biotransformacji związków steroidowych.

1. izomeryzacja Δ⁵ do Δ⁴ połączona z utlenieniem grupy hydroksylowej;

2. utworzenie podwójnego wiązania;

3. odwodornienie;

4. aromatyzacja;

5. utlenienie połączone z rozerwaniem pierścienia A;

6. 11β- hydroksylacja;

7. epoksydacja;

8. biodegradacja łańcucha bocznego z wytworzeniem grupy hydroksylowej;

9. biodegradacja łańcucha bocznego z wytworzeniem grupy ketonowej;

10. biodegradacja łańcucha bocznego z wprowadzeniem atomu tlenu do pierścienia D i jego laktonizacja;

11. redukcja grupy ketonowej do hydroksylowej

12. utlenienie grupy hydroksylowej do ketonowej

2.3.1. Surowce do produkcji hormonów steroidowych

Sterole

Sterole to monohydroksysteroidy mające w pozycji C-17 łańcuch boczny zawierający 8-10 atomów węgla. Wyróżniamy sterole pochodzenia roślinnego - fitosterole (stygmasterol, β-sitosterol, γ-sitosterol) i sterole pochodzenia zwierzęcego - zoosterole (cholesterol).

Stygmasterol β-sitosterol

γ-sitosterol Cholesterol (3-hydroksy-5,6-cholesten)

Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej znanym steroidem ze względu na jego udział w rozwoju miażdżycy. Odgrywa on bardzo ważną rolę biochemiczną, ponieważ jest prekursorem wielu różnych ważnych steroidów takich jak: kwasy żółciowe, hormony kory nadnerczy, hormony płciowe, witaminy D, glikozydy nasercowe, sitosterole w świecie roślin i niektóre alkaloidy.

cholesterol (C 27)

pregnenolon (C 21)

progestageny (C 21)

glukokortykoidy mineralokortykoidy androgeny

(C21) (C21) (C19)

estrogeny

(C18)

Rys. 6. Biosynteza hormonów steroidowych

Cholesterol jest szeroko rozpowszechniony we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej. Jest jednym z ważniejszych składników błon plazmatycznych i lipoprotein surowicy krwi. Występuje zwykle jako ester cholesterolu - gdzie grupa hydroksylowa w pozycji 3 cholesterolu jest zestryfikowana długołańcuchowym kwasem tłuszczowym. Znajduje się w tłuszczach zwierzęcych lecz brak go w tłuszczach roślinnych.

Sapogeniny i glikoalkaloidy

Sapogeniny i glikoalkaloidy charakteryzują się obecnością dwóch heterocyklicznych pierścieni połączonych szeregowo z pierścieniem D zrębu steroidowego pozycji C-16 i C-17. Do sapogenin zaliczamy diosgeninę i hekogeninę, zaś przedstawicielami glikoalkaloidów są solasodyna i tomatydyna.

Diosgenina Solasodyna

Kwasy żółciowe

Kwasy żółciowe są pochodnymi cholesterolu. Powstają poprzez wprowadzenie do cząsteczki cholesterolu dodatkowych grup hydroksylowych, redukcję pierścienia oraz skrócenie i utlenianie łańcucha bocznego do grupy karboksylowej. Sole kwasów żółciowych są syntetyzowane w wątrobie, magazynowane i zagęszczane w pęcherzyku żółciowym i uwalniane stamtąd do jelita cienkiego. Sole te będące głównym składnikiem żółci, działają emulgująco na tłuszcze pokarmowe. Związki te są wysoce efektywnymi detergentami, ponieważ ich cząsteczki zawierają zarówno polarne, jak i niepolarne rejony. Skuteczne zwiększenie powierzchni cząsteczek lipidów ma dwie konsekwencje: ułatwia hydrolizę tłuszczów przez lipazy i ich wnikanie przez ściany jelita. Przedstawicielem tej grupy związków jest kwas cholowy.

Kwas cholowy Ergosterol

Ergosterol

Ergosterol występuje w roślinach i drożdżach. Związek ten jest ważnym prekursorem witaminy D.

Ergosterol w wyniku reakcji fotochemicznej zachodzącej pod wpływem promieniowania nadfioletowego, zmienia się w prewitaminę D, która spontanicznie izomeryzuje do witaminy D. Przemianie ulega tutaj pierścień B układu steronowego. Brak witaminy D w dzieciństwie powoduje krzywicę, charakteryzującą się zaburzeniami w wapnieniu chrząstek i kości. U dorosłych brak witaminy D prowadzi do rozmiękania kości w procesie zwanym osteomalacją.

2.3.2. Kierunki biotransformacji steroidów

Można uznać, iż największe znaczenie przemysłowe posiadają następujące kierunki biotransformacji związków steroidowych:

1. degradacja łańcucha bocznego połączona z utlenianiem w układzie pierścieniowym

2. degradacja łańcucha bocznego połączona z laktonizacją w pierścieniu D

3. 11α- ,11β-,17α-, 21- hydroksylacja

4. redukcja grupy ketonowej w pozycji 17

5. odwodornienie w pozycji Δ¹ pierścienia A

6. utlenienie grupy 3β-hydroksylowej połączone z izomeracją układu Δ⁵ do Δ⁴

Degradacja łańcucha bocznego

Degradacja łańcucha bocznego steroli może zachodzić z utlenieniem w układzie pierścieniowym bądź też może być połączona z laktonizacją w pierścieniu D. Reakcje te zachodzą pod wpływem szczepów: Arthrobacter simplex, Brevibacterium lipolitycum, Aspergillus spp. czy Streptomyces spp. Największe znaczenie przemysłowe mają produkty z grupą ketonową w pozycji 17 oraz grupą karboksylową w pozycji 20. Dzięki tym reakcją powstają m.in. androsteno-3,17-dion, androsta-1,4-dieno-3-17-dion, androsteno-9-hydroksy-3,17-dion czy też 20-karboksypregna-1,4-dieno-3-on. Prostym przykładem degradacji krótkich łańcuchów bocznych w cząsteczkach pregnanów może być reakcja biokonwersji progesteronu do testosteronu (rys. 7). Wiele innych przykładów biodegradacji łańcucha bocznego steroli przedstawiono na rys. 8.

Progesteron Testosteron

Rys.7. Biokonwersja progesteronu do testosteronu

Rys 8. Przykłady biodegradacji łańcucha bocznego steroli.

Hydroksylowanie

Pierwszą wykorzystaną na skalę przemysłową biotransformacją związków steroidowych była reakcja hydroksylowania progesteronu w pozycji 11α do 11α-hydroksyprogesteronu. Historyczna transformacja - patent w 1952 roku Petersona i Murray'a. Dzięki tej reakcji synteza kortyzonu (świetnego leku w chorobach reumatycznych) została zredukowana z 36 etapów na drodze chemicznej do 11 etapów. Cena leku spadła z 200$/kg do 6$ za kilogram!

Rys. 9. Biotransformacja progesteronu do 11-α-hydroksyprogesteronu Hydroksylowanie progetseronu

Reakcję tą można przeprowadzić wykorzystując następujące szczepy drobnoustrojów: Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus, Aspergillus olivaceus, Curvularia lunata czy też Streptomyces fradiae. Od użytego szczepu drobnoustroju zależy także czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji 11α lub 11β, czy też reakcja będzie dwukierunkowa. Nie bez znaczenia jest tu również budowa cząsteczki substratu. Mechanizm reakcji hydroksylowania polega na wprowadzeniu jednego atomu tlenu cząsteczkowego do substratu przy udziale specyficznych oksygenaz.

Hydroksylowanie w pozycji 17α zachodzi przy udziale Trichoderma viridae oraz Cephalothecium roseum. Progesteron ulega w tej reakcji transformacji do 17α-hydroksyprogesteronu, natomiast 11-dehydrokortykosteron do kortyzonu.

Pellicularia filamentosa hydroksyluje 19 atom węgla.

Progesteron 17-α-hydroksyprogesteron

Rys. 11. Biotransformacja progesteronu do 17α-hydroksyprogesteronu

Rys. 12. Biotransformacja 11-dehydrokortykosteronu do kortyzonu

Hydroksylowanie w pozycji 21 zachodzi natomiast w łańcuchu bocznym substratu steroidowego przy udziale Curvularia lunata, Wojnowicia graminis i Aspergillus niger, co pozwala na biotransformację progesteronu do 11-deoksykortykosteronu.

progesteron 11-deoksykortykosteron

Rys. 13. Biotransformacja progesteronu do 11-deoksykortykosteronu

Redukcja grupy ketonowej w pozycji 17

Zdolność redukcji grupy ketonowej w pozycji 17 wykazują drożdże Saccharomyces uvarum, Saccharomyces cerevisiae oraz Saccharomyces chevalieri. Przykładem tego typu biotransformacji może być przemiana androsteno-3,17-dionu do testosteronu.

androsteno-3,17-dion testosteron

Rys.14. Biotransformacja androsteno-3,17-dionu do testosteronu

Odwodornienie w pozycji Δ1 pierścienia A

Zdolność przeprowadzania tej reakcji wykazują drobnoustroje z rodzajów: Arthrobacter, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas. Stosując szczepy Arthrobacter simplex, Bacillus lentus, Mycobacterium globiforme lub Septomyxa affinis można przeprowadzić kortyzon w prednizon, a kortyzol w prednizolon.

Rys. 15. Biotransformacja kortyzonu do prednizonu

kortyzol prednizolon

Rys. 16. Biotransformacja kortyzolu do prednizolonu

Wśród towarzyszącym tym przemianom reakcji ubocznych na uwagę zasługują: odszczepianie łańcucha bocznego w pozycji 17 z równoczesnym otwarciem pierścienia D, redukcja grupy ketonowej w pozycji C-20 do grupy hydroksylowej oraz niemal całkowita degradacja substratu.

Utlenienie grupy 3β-hydroksylowej połączone z izomeryzacją układu Δ5 do Δ4

Mikroorganizmy z rodzaju Aspergillus i Streptomyces mogą prowadzić proces odwodornienia i izomeryzacji. Tego typu reakcje wykorzystano do otrzymania progesteronu z surowców roślinnych i zwierzęcych. W technologii proces ten w ostatnim etapie może być prowadzony metodą chemiczną Oppenauera. Metoda ta polega na działaniu w środowisku bezwodnym, w roztworze toluenowym, izopropylenem glinu lub butylanem glinu i pozwala na utlenienie drugorzędowych grup alkoholowych do grup ketonowych bez naruszenia wiązań podwójnych w cząsteczce.

pregnenolon progesteron

Rys.17. Biotransformacja pregnenolonu do progesteronu

2.3.3. Wykorzystanie procesów biotransformacji do produkcji leków hormonów

Opisane w rozdziale 4.2. procesy biotransformacji znalazły zastosowanie w produkcji leków steroidowych. Na rys. 18 przedstawiono kierunki przekształceń związków steroidowych, w których stosuje się na skalę przemysłową reakcje biotransformacji.

Jednym z najważniejszych związków steroidowych wykorzystywanych do produkcji leków hormonalnych jest progesteron. Związek ten jest wyjściowym półproduktem do dalszych syntez: testosteronu, korteksonu, kortyzonu, prednizonu, kortyzolu i prednizolonu.

Wytwarzanie wybranych kortykosteroidów

Chemiczna synteza testosteronu przebiega w 9 etapach. Z cholesterolu otrzymuje się octan androstenolonu, a następnie związek ten jest przekształcany w testosteron. Drogą mikrobiologiczną syntezę testosteronu można zredukować do 2 etapów. Stosując szczep Pseudomonas testosteroni można przekształcić androstenolon w Δ⁴-androsteno-3,17-dion, a następnie przy udziale drożdży Saccharomyces cerevisiae otrzymać testosteron.

Androstenolon Δ⁴-androsteno-3,17-dion Testosteron

Rys. 19. Biotransformacja androstenolonu do testosteronu

Na drodze biotransformacji mikrobiologicznej testosteron otrzymuje się z progesteronu przy użyciu szczepu Penicillium notatum.

Kortyzon otrzymuje się z progesteronu na drodze mikrobiologicznej transformacji. Pierwszy etap tej biotransformacji zachodzi przy udziale pleśni Rhizopus nigricans i prowadzi do powstania 11α-hydroksyprogesteronu.

Rys.20. Mikrobiologiczna transformacja progesteronu do kortyzonu

Kortekson natomiast otrzymuje się na drodze hydroksylowania w pozycji 21 cząsteczki progesteronu, przy użyciu drobnoustrojów z rodzaju: Ophiobolus herpothichus, Aspergillus niger czy Wojnowichia graminis.

Progesteron Kortekson

Rys.21 Mikrobiologiczna transformacja progesteronu do korteksonu.

Do produkcji leków jak i hormonów płciowych wykorzystuje się mikrobiologiczne odwodornienie w pozycji Δ¹ z wykorzystaniem bakterii Arthrobacter simplex. Na tej drodze otrzymuje się z kortyzonu - prednizon, zaś z kortyzolu - prednizolon.

Rys.22. Biotransformacja kortyzonu do prednizonu.

1

1

Kwas

glukonowy

enzym

---