WYKŁAD 1.

Biochemia zajmuje się strukturą molekularną organizmu i procesami metabolicznymi zachodzącymi w komórce, macierzy pozakomórkowej i w płynach ustrojowych.

Pierwiastki:

tlen, węgiel, wodór, azot, wapń, fosfor (99%)

Makrocząsteczki:

• białka

• cukry

• tłuszcze

• kwasy nukleinowe

PLAN BUDOWY LUDZKIEGO CIAŁA:

Komórka - najmniejsza jednostka życia. Zawiera jądro, mitochondria, rybosomy i inne organella.

Tkanka - zespół komórek o podobnej strukturze i funkcji. Wyróżniamy: tkankę nabłonkową, mięśniową, łączną i nerwową.

Narząd - zespół tkanek, pełniących określoną funkcję, posiadających określony kształt, np. wątroba, nerka, płuco.

Układ narządów - grupa narządów, związanych z określoną czynnością.

Aminokwasy należą do najlepiej poznanych składników żywych organizmów. Opisano ponad 300 aa, a jedynie 20 z nich występuje w białkach zwierzęcych.

Są pochodnymi kwasów organicznych. Każdy aminokwas (za wyjątkiem proliny) posiada grupę aminową i grupę karboksylową oraz łańcuch boczny połączony z węglem α.

Łańcuch jest oznaczony symbolem R - jego struktura decyduje o roli aminokwasu w białku.

W fizjologicznym ph (około 7,4) większość grup karboksylowych jest zdysocjowana - tworzy anion -COO^-, a większość grup aminowych wiąże H⁺ - tworząc kation -NH₃⁺.

Dominującą formą aminokwasu jest jon obojnaczy, będący nośnikiem dwóch przeciwstawnych ładunków elektrycznych.

Struktura aminokwasów:

Aminokwasy są związkami optycznie czynnymi - ich roztwory skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego (za wyjątkiem glicyny wszystkie zawierają węgiel asymetryczny). Występują w formie dwóch izomerów optycznych - D i L. W białkach dominuje forma L.

Aminokwasy są zaliczane do związków amfoterycznych (wykazują właściwości buforujące - stabilizują pH). W środowisku wodnym wykazują właściwości słabych kwasów i słabych zasad. Zawierają słabo kwasową grupę karboksylową i słabo zasadową grupę aminową. W środowisku kwaśnym aminokwas jest kationem, w środowisku zasadowym jest anionem.

Istnieje pewna wartość pH, przy której aminokwas staje się jonem obojnaczym, a jego wypadkowy ładunek elektrostatyczny równa się 0.

Takie pH nazywane jest punktem izoelektrycznym (pI) aminokwasu.

Środowisko kwaśne	Obojętne	Zasadowe
Kation	Jon obojnaczy Punkt izoelektryczny	Anion

1. Aminokwasy z łańcuchami niepolarnymi

Łańcuchy boczne nie zawierają grup funkcyjnych: alanina, walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, tryptofan, metionina, glicyna, prolina. Są hydrofobowe - nie wiążą wody.

2. Aminokwasy z łańcuchami polarnymi bez ładunku

Łańcuchy boczne zawierają grupy SH - cysteina, grupy OH - seryna, treonina i tyrozyna. Do tej grupy należy również asparagina i glutamina. W fizjologicznym ph wykazują zerowy ładunek elektryczny.

3. Aminokwasy z łańcuchami kwasowymi

Łańcuchy boczne zawierają grupy karboksylowe, dysocjujące z uwolnieniem protonów[COO^-]: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.

4. Aminokwasy z łańcuchami zasadowymi

Łańcuchy boczne zawierają grupy aminowe, wiążące protony [NH₃⁺]: lizyna, arginina i histydyna.

Inne aminokwasy:

• hydroksyprolina, hydroksylizyna - nie są wbudowywane do białek w trakcie ich syntezy, powstają w procesie posttranslacyjnej modyfikacji reszt proliny i lizyny.

• selenocysteina i pirololizyna - pochodne cysteiny i lizyny.

Niektóre aa nie są składnikami białek:

• β-alanina - składnik koenzymu A

• ornityna, cytrulina - metabolity cyklu mocznikowego

• γ-aminomaślan - neuromediator

• homocysteina - metabolit aa siarkowych

Każdemu aminokwasowi występującemu w białkach przypisano symbole trój literowe i jednoliterowe. Symbole trój literowe to najczęściej pierwsze trzy litery nazwy anglojęzycznej, np.:

• cysteina Cys C

• histydyna His H

• Izoleucyna Ile I

• alanina Ala A

• glicyna Gly G

BIOLOGICZNE ZNACZENIE AMINOKWASÓW:

Są składnikami peptydów i białek, uczestniczą w budowie centrów katalitycznych enzymów.

Są prekursorami:

• hormonów (adrenaliny, noradrenaliny, tyroksyny, trijodotyroniny, histaminy, serotoniny, dopaminy, melatoniny),

• barwników biologicznych (melanin, hemu),

• niektórych koenzymów (np. koenzymu A),

• neuroprzekaźników (np. acetylocholiny i kwasu γ-aminomasłowego).

Pełnią rolę substratów w syntezie puryn i pirymidyn.

Szkielety węglowodorowe aa są zużywane do syntezy glukozy, ciał ketonowych lub utleniają się do CO₂ i H₂O dostarczając energii.

Niektóre aa są źródłem siarki, inne uczestniczą w syntezie fosfolipidów.

• Dwa aminokwasy wiążą się ze sobą w wyniku reakcji grupy α-karboksylowej jednego z nich z grupą aminową drugiego. Odłącza się cząsteczka wody - powstaje wiązanie peptydowe.

• Wiązanie peptydowe jest sztywne, wykazuje cechy wiązania podwójnego.

• Produkt reakcji aminokwasów do dipeptyd, zachowujący wolną grupę aminową jednego z aminokwasów i wolną grupę karboksylową drugiego z nich. Grupa karboksylowa dipeptydu może reagować z grupą aminową trzeciego aminokwasu tworząc tripeptyd.

Peptydy złożone z kilku - kilkunastu aminokwasów to oligopeptydy. Dłuższe peptydy, zawierające kilkadziesiąt reszt aa noszą nazwę polipeptydów.

Peptydy są strukturami nierozgałęzionymi. Posiadają dwa końce: aminowy-N i karboksylowy-C. Mogą występować również w formach cyklicznych.

Nazwę i analizę sekwencji peptydu rozpoczyna się od końca N, a sekwencję zapisuje się przy pomocy symboli trój- lub jednoliterowych.

Peptydy biologicznie aktywne:

• Glutation - tri peptyd, występuje w formie zredukowanej i utlenionej, bierze udział w procesach oksydacyjno-redukcyjnych.

• Kininy np. bradykinina - mediatory stanu zapalnego.

• Angiotensyna I - podnosi ciśnienie tętnicze.

• Enkefaliny - pentapeptydy mózgu, wykazują silne działanie przeciwbólowe.

• Endorfiny - peptydy przysadki mózgowej, wykazują działanie przeciwbólowe.

• Oksytocyna i wazopresyna - oksytocyna pobudza czynność skurczową macicy w okresie porodu, wazopresyna (adiuretyna) pobudza resorpcję wody w kanalikach nerkowych.

• Glukagon, insulina, parathormon, kalcytonina, ACTH

BIAŁKA

• Białka są wielkocząsteczkowymi produktami powstałymi poprzez interakcję grup α-karboksylowych z grupami α-aminowymi aminokwasów z wytworzeniem wiązań peptydowych.

• Nie ma wyraźnej granicy pomiędzy peptydami i białkami. Na ogół zakłada się, że produkt zawierający ponad 100 aminokwasów jest białkiem

• W skład jednego łańcucha białkowego wchodzi najczęściej od 100 do 1000 reszt aminokwasowych.

Strukturę białek można rozpatrywać na czterech „poziomach”. Są to struktury: pierwszo, drugo, trzecio i czwartorzędowe. Trzy ostatnie określane są wspólną nazwą - konformacji białka.

STRUKTURA PIERWSZORZĘDOWA BIAŁEK

Sekwencja, czyli kolejność aminokwasów w łańcuchu białkowym, nosi nazwę struktury pierwszorzędowej białka. Jest uwarunkowana genetycznie, determinuje pozostałe struktury.

Niektóre białka wykazują duże podobieństwo (homologię) sekwencji aminokwasowej. Często białka o homologicznej sekwencji pełnią podobne funkcje. Na przykład trypsyna i chymotrypsyna są enzymami proteolitycznymi, trawiącymi białka. Homologiczne względem siebie łańcuchy α i β hemoglobiny oraz w mniejszym stopniu mioglobiny wiążą tlen cząsteczkowy.

Zastąpienie choćby jednego aminokwasu innym w łańcuchu hemoglobiny powoduje powstanie hemoglobiny patologicznej. Opisano ponad 100 takich hemoglobin.

Hb. A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb.S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…

Hb.C Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-Glu-Lys…

Krwinki czerwone, obarczone tak zmienioną hemoglobiną, mają nietypowy kształt, żyją krócej, są bardzo podatne na hemolizę. Rozwija się obraz chorobowy określany niedokrwistością (anemią) hemolityczną.

OZNACZANIE SKŁADU I SEKWENCJI AMINOKWASOWEJ BIAŁEK

Skład aminokwasowy ustala się metodą chromatografii jonowymiennej, po uprzedniej hydrolizie białek w środowisku kwaśnym (zwykle 6M HCl). Pomiaru składu aminokwasowego hydrolizatów dokonuje analizator aminokwasowy.

Sekwencję aminokwasową ustala się metodą Edmana, przy użyciu automatycznego analizatora (sekwenatora). Czynność tę nazywa się sekwencjonowaniem białka.

Długie polipeptydy są najpierw poddawane fragmentacji na krótsze odcinki, poprzez:

• fragmentację enzymatyczną, np. przy udziale trypsyny

• fragmentację chemiczną przy udziale bromocyjanu, który rozkłada wiązania peptydowe powstałe z udziałem grup karboksylowych metioniny

STRUKTURA DRUGORZĘDOWA BIAŁEK

Jest to sposób przestrzennego rozmieszczenia łańcucha peptydowego. Ocenia się ją metodami dyfrakcji promieni X.

α - helisa

Jest najczęściej spotykaną formą struktury drugorzędowej. Na jeden skręt α - helisy przypada 3,6 reszt aminokwasowych. Skok spirali wynosi 0,54 nm, a odległość osiowa dwu reszt - 0,15 nm. Taki układ pozwala na tworzenie wewnątrzłąńcuchowych wiązań wodorowych.

Struktura β

Zwana jest także „pofałdowaną kartką” lub „harmonijką β”. Łańcuch o strukturze β jest bardziej rozciągnięty w kierunku osiowym. Odległość dwu sąsiednich reszt aminokwasowych jest ponad dwukrotnie większa niż w łańcuchu α - helisy i wynosi około 0,35 nm. W białkach o tej strukturze dominują międzyłańcuchowe wiązania wodorowe.

STRUKTURA KOLAGENOWA:

Kolageny cechują się nietypowym składem aminokwasowym, którego następstwem są specyficzne struktury przestrzenne. Ponad 30% reszt aminokwasowych kolagenu stanowi glicyna, a na szczególną uwagę zasługuje obecność hydroksyproliny i hydroksylizyny.

Łańcuchy kolagenów układają się w specyficzną strukturę przestrzenną, zwaną potrójną helisą kolagenową. Podstawową jednostką strukturalną kolagenu jest tropokolagen - cząsteczka złożona z trzech łańcuchów polipeptydowych, zwanych podjednostkami α. Łańcuchy kolagenowe są bardziej rozciągnięte w kierunku osiowym niż łańcuchy białek o strukturze α-helisy, ale mniej niż łańcuchy białek o strukturze β. Szczególną właściwością kolagenu, jest występowanie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, pomiędzy łańcuchami α.

STRUKTURA TRZECIORZĘDOWA BIAŁEK

Określa sposób wtórnego, trójwymiarowego pofałdowania cząsteczki białka z zachowaniem elementów struktury drugorzędowej. Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana przez mostki dwusiarczkowe, wiązania hydrofobowe, wiązania wodorowe, wiązania jonowe. Jest indywidualna dla każdego białka (dobrze poznano strukturę Mio- i hemoglobiny).

Struktura białek globularnych w roztworach wodnych jest zwarta. Hydrofobowe łańcuchy boczne reszt aminokwasowych są ukryte we wnętrzu cząsteczki, podczas gdy grupy hydrofilowe są zwykle usytuowane na jej powierzchni.

STRUKTURA CZWARTORZĘDOWA BIAŁEK

Określa skład podjednostkowy i wzajemny układ przestrzenny podjednostek w obrębie jednej cząsteczki białkowej. Białka o wysokiej masie cząsteczkowej składają się z dwóch lub większej liczby łańcuchów polipeptydowych, zwanych podjednostkami. Na ogół są one zespolone ze sobą wiązaniami niekowalencyjnymi o niskiej energii, jak wiązania hydrofobowe, jonowe lub wodorowe.

W wielu przypadkach struktura czwartorzędowa białek, a pośrednio ich właściwości biologiczne, jest modyfikowana przez substancje drobnocząsteczkowe, zwane efektorami allosterycznymi.

DENATURACJA BIAŁEK

Polega na zniszczeniu struktur przestrzennych (konformacji białka) z zachowaniem struktury pierwszorzędowej. Ciągłość łańcucha polipeptydowego pozostaje nienaruszona.

Czynnikami denaturującymi są przede wszystkim: podwyższona temperatura (na ogół ponad 60^oC), rozpuszczalniki organiczne, kwasy, zasady, jony metali ciężkich (Hg, Pb), stężone roztwory mocznika lub chlorowodorku guanidyny.

Zmiana konformacji powoduje najczęściej utratę funkcji danego białka - wyjaśnia to zależność pomiędzy budową a funkcją białka.

IZOLACJA BIAŁKA Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

Bezwzględnym warunkiem wstępnym izolacji białka jest przeprowadzenie go w postać rozpuszczalną. Osiąga się to poprzez homogenizacje tkanek w różnych płynach ekstrahujących, jak np. woda, sól fizjologiczna czy różne bufory. Urządzenia służące do rozbijania struktury tkanek noszą nazwę homogenizatorów (nożowe, ultradźwiękowe).

Możliwości oddzielenia poszczególnych białek od siebie, w tym także izolacji jednego z mieszaniny wielu białek, wynikają ze zróżnicowania ich właściwości, takich jak: rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, ładunek elektryczny, punkt izoelektryczny, powinowactwo jednych cząsteczek od innych.

Zwykle doprowadzenie białka do stanu jednorodności wymaga szeregu kolejno po sobie następujących procedur.

• ekstrakcja i wytrącenie białek z roztworu - uwzględnia różnice w rozpuszczalności białek.

• dializa i ultrafiltracja - umożliwia oddzielenie białka od substancji drobnocząsteczkowych.

• filtracja żelowa - polega na rozdziale mieszaniny białek o różnych masach cząsteczkowych.

• chromatografia jonowymienna - jest stosowana do rozdziału białek różniących się ładunkami elektrycznymi.

• chromatografia powinowactwa - polega na wybiórczym wiązaniu się niektórych białek z innymi substancjami.

• chromatografia wysokociśnieniowa (HPLC) - stosuje wymuszony, szybki przepływ roztworów przez kolumnę z żywicą pod wysokim ciśnieniem.

• elektroforeza - opiera się na zróżnicowaniu ruchliwości białek w polu elektrycznym - rozdział zależy od mas cząsteczkowych.

• ogniskowanie izoelektryczne - białko znajdujące się w punkcie izoelektrycznym traci ruchliwość w polu elektrycznym.

PODZIAŁY BIAŁEK:

• proste - zbudowane wyłącznie z aminokwasów, np. albuminy, globuliny.

• złożone - zawierają dodatkowe komponenty, np. glikoproteiny (zawierają cukry), lipoproteiny (tłuszcze), nukleoproteiny (kwasy nukleinowe).

• pełnowartościowe - (najczęściej zwierzęce) - zawierają aa egzogenne.

• niepełnowartościowe - (najczęściej roślinne) - nie zawierają aa egzogennych.

---