fermenty przerobione, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III semestr 6, biotechnologia żywności - technologia fermentacyjna


19.02.2007 TECHNOLOGIA FERMENTACJI - PODSTAWY TEORETYCZNE

Dr inż. M. Lewandowska

2 bloki ćw - 7,5-8h 6-7 tygodni

Pt 10.00 ćw wejściówkowe

FERMENTACJA (łac. fervere, fermentatio, co oznacza burzenie się, kipienie, gotowanie)

Pierwotnie terminem tym określano zjawiska towarzyszące spontanicznym procesom zachodzącym w sokach, moszczach owocowych, zacierach zbożowych podczas przemiany cukrów z wydzieleniem CO2.

Fermentacja alkoholowa = pierwszy proces zaobserwowany i nazwany.

Z punktu biochemicznego wiąże się z procesami beztlenowymi, w praktyce przemysłowej to wszystkie procesy z udziałem dbn.

TEORIA FEREMNTACJI - RYS HISTORYCZNY

C6H12O6 =>2C2H5OH + CO2 + 28 kcal

teoria fermentacji cykl EMP (najbardziej typowy przebieg glikolizy)

glikoliza

0x08 graphic

0x08 graphic
0x08 graphic
2 p i r o g r o n i a n

cykl Krebsa fermentacja w war bezO2

produkty w zal od dbn:

CYKL PENTOZOFOSFORANOWY (ALTERNATYWA GLIKOLIZY)

- włącza w swym przebiegu cukry C5 --> rośliny

- ksyloza, ryboza, arabinoza mogą być włączone w cykl glikolityczny

- różnica:!! dehydrogenaza glukozo-6-P i dehydrogenaza 6-P-glukonianowa - inne niż w cyklu EMP

- dochodzimy do etapu w którym mogą się te szlaki połączyć - aldehyd 3fosfoglicerynowy (obie gałęzie wiążą się z powstawaniem fruktozo-6-P - kolejne wspólne ogniwo)

CYKL ENTNERA - DOUDROFFA

Powstaje 6-P-glukonian (początek jak w cyklu pentozo - fosforanowym)

Glukonian i 2oksoglukonian wprowadzone do cyklu.

- aldolaza-2-oksy-3-deoksy-6-P-glukonianowa --> aldehyd3-P-glicerynowy (wspólny metabolit)

ważniejsze ferm. beztlenowe:

- etanolowa - S. cerevisiae (drożdże), Zymomonas mobili (bakterie konkurencyjne dla drożdży) --> etanol, CO2

- mleczanowa (homofermentacja) Streptococus, Lactobacillus, Pediococcus --> kw. mlekowy

heterofermentacja - Leuconostoc, Lactobacillus, Bifidobacterium, inne --> kw. mlekowy i octowy, etanol, CO2, diacetyl, acetoina = związki aromatyczne, H2

- propionowa - Propionibacterium, Clostridium propionicum- kwas propionowy i octowy

- octanowa- (fermentacja tlenowa) Clostridium thermoaceticum, formiaceticum - kw. octowy

- mieszana fermentacja kwasowa - bakterie jelitowe- kwas mlekowy, mrówkowy, octowy, bursztynowy, etanol, 2,3-butanodiol, CO2, H2

- metanowa - Methanobacterium, Methanococcus => metan, CO2 - procesy kompostowania

- acetonowo - butanolowa - Clostridium acetobutylicum i inne C. =>butanol, aceton, kw.masłowy, octowy; sluży powstawaniu rozpuszczalników organicznych

PORÓWANANIE METABOLIZMU DROŻDŻY W WAR O2 I O2

bilans energetyczny:

BEZTLENOWE:

glukoza --> 2CH3CH2OH + CO2

2 mole ATP (2x52 kJ) = 104 kJ -->40%,

a w TLENOWYM 34 ATP => metabolizm na poziomie 70 %

GLUKOZA + 6O2 => 6CO2 + 6H2O

TYLKO 2% glukozy z pożywki zużywane są na przyrost biomasy, a reszta przechodzi do produktu

Bilans materiałowy:


TLENOWY

BEZTLENOWY


Glukoza O2

0x08 graphic
100g 47g

0x08 graphic
0x08 graphic

Glukoza 100g

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic

2g 45g 45g 7g


43 g 67g 41g

Białko (biomasa)/ CO2/ H2O

B/ CO2 / EtOH / produkty uboczne


Hodowle drobnoustrojów - podział:

- okresowa - statyczna

- powierzchniowa --> tak produkowany kwas cytrynowy

- wgłębna

- okresowe z zasilaniem

- okresowe z powtórnym zasilaniem

- półciągłe

- ciągłe

Powierzchniowa

Porastanie biomasy na powierzchni pożywki (płynna lub stała)

Wgłębna (batch fermentation): => bardziej skuteczny

- warunki tlenowe i beztlenowe

- z neutralizacją lub bez

- z napowietrzaniem lub bez

zalety:

w czasie rozwoju dbn nie doprowadza się świeżych substancji odżywczych i nie odprowadza się końcowych produktów metabolizmu.

prawo minimum Liebiega stwierdza, że rozwój organizmów ogranicza ten czynnik, który pierwszy wystąpi w ilości minimalnej oraz tolerancji Shelforda, określające wytrzymałość organizmów na nadmiar jakiegoś czynnika, powyżej którego niemożliwy jest ich rozwój.

Decydują o przebiegu procesu.

Zalety hodowli okresowej:

FAZY WZROSTU:

        1. inkubacyjna (przystosowawcza, lag faza) - zapoczątkowanie procesu fermentacyjnego - powinna być najkrótsza, ale też niezbędna (wstępne namnożenie biomasy)

        2. faza zapocząkowanego wzrostu

        3. log wzrostu

        4. zahamowanego wzrostu

        5. stacjonarna - wytwarzanie metabolitów wtórnych

        6. letalna -zamierania - wyczerpanie źródeł E

0x01 graphic

Proces przerywa sie przy końcu log fazy lub przed rozpoczęciem fazy zamierania

TYPY WZROSTU DBN:

  1. NIEOGRANICZONY

  1. OGRANICZONY

Szybkość wzrostu NIEOGRANICZONEGO jest ~ do c komórek:


dX

---- = X

dt

- właściwa szybkość wzrostu ( h -1) - szybkość wzrostu komórek do komórek istniejących

dN

--- = N

dt N- gęstość komórek (1/dm3)



1 dN

 = ------ ----

N dt

1 dX

 = ------ ----

X dt


Czas generacji (tg) jest to czas potrzebny do podwojenia ilości komórek lub ilości biomasy.

ln2 = tg   ln2/ tg

OGRANICZONY - limitacja wzrostu wywołana niskim stężeniem

dX S

---- = max x ----------- =0,5 max

dt Ks + S

S= stężenie substratu

K= stala Michaelisa-Menten, pólnasycenia, określa połowę szybkości maksymalnej

max - maksymalny wzrost dbn

 (s) - szybkość wzrostu i ubytku substratu

Czyli właściwa szybkość wzrostu w tych warunkach wynosi:

S

 (s) = max x -----------

0x08 graphic
Ks + S

0x08 graphic

1 - składnik limitujący

2 - sl w niskim stężeniu

0x08 graphic
0x08 graphic
i hamujący w wysokim c

0x08 graphic

Limitowanie nadmiarem składnika też może występować!! Jak na wykresie

hamowanie wzrostu - wywołane obecnością inhibitora w podłożu np. nagromadzony metabolit

dX Kp

---- = max x -----------

dt Kp + P

P - stężenie produktu n = 0,5 n max

Kp - stała hamowania - c produktu przy którym szybkość jest = połowie szybkości max

Metoda okresowa z zasilaniem - doprowadza się w sposób okresowy lub ciągły świeżą pożywkę bez odprowadzania przereagowanej, zużytej pożywki, zwiększenie objętości fermentora

Repeat-fed batch fermentation - z wielokrotnym zasilaniem => co pewien czas odbiera się część pożywki z nagromadzoną biomasą

Fermentacja półciągła (semicontinuous fermentation)-

Zawracanie części biomasy do fermentora-> metoda zwrotnego wirowania (2- krotne zwiększenie wydajności procesu

Biomasa oddzielona od cieczy pohodowlanej (warunki sterylne) =>inoculum do następnego procesu (fermentacji) --> procesy gorzelnictwa przemysłowego - wiąże się z przetwarzaniem melasy

Ciągła

DAJĄ NAJLEPSZY SKUTEK EKONOMICZNY - dają przedłużenie fazy log wzrostu

- pominięcie etapu produkcji inokulum (rozpoczynanie i kończenie fermentacji)

- wyższa wydajność w porównaniu z procesami okresowymi

- zmniejszenie powierzchni użytkowej zakładu

wymywanie organizmów (szybkość rozcieńczania)= szybkość wzrostu

= D

1 dX

= ---- x -----

X dt

D - objętość wpływająca do bioreaktora

- stała wydajnośc Y XS= stała ilość biomasy/zużycie substratu lub stała ilość produktu na ilość zużywanego substratu i gęstość komórek w środowisku fermentacji

D Ks

X = Y XS ( S0 - --------------)

max - D

S0 - stężenie substratu na wejściu do fermentora

Ks - stała półnasycenia

PROCES OKRESOWY - wydajność 2,5 g, CIĄGŁA 2x większa, IMMOBILIZACJA, HOLLOW-FIBRE

MODELE PROCESÓW BIOSYNTEZY MIKROBIOLOGICZNEJ


  1. Produktem jest biomasa = namnażanie komórek równoznaczne z przyrostem biomasy np. procesy drożdżownictwa dP/dt = DX/dt P=X

  1. Powstawanie produktu jest związane ze wzrostem komórek (zanika w fazie stacjonarnej) (produktem jest np. enzym- otrzymywanie) dP/dt= DX/dt



  1. Tworzenie produktu zachodzi zarówno w czasie wzrostu jaki i w fazie stacjonarnej (np.etanol, kw.mlekowy, beztlenowa) dP/dt=DX/dt + X

  1. Powstawanie produktu następuje tylko w komórkach nie namnażających się (powstawniae metabolitów wtórnych np. biosynteza antybiotyków, toksyn, AA np. Lys)

dP/dt = X


Wg Gadena

Powiązał szybkość wytwarzanai produktu ze zużywaniem substratu


Typ I - tworzenie produktów jest związane bezpośrednio ze zużyciem węglowodanów np. etanol

Typ II - tworzenie produktów jest związane pośrednio ze zużyciem węglowodanów np. kwas cytrynowy (P wytwarza się w II fazie procesu


Typ III - tworzenie produktów nie jest związane ze zużyciem węglowodanów np. penicylina (metabolit wtórny)

Wg Deindeoerfera (kryterium - rodzaj zachodzącej reakcji)

  1. PROSTA - składniki pożywki przekształcają się w produkty o określonych stosunkach stechiometrycznych bez nagromadzenia się produktów pośrednich; produktem może być biomasa

  1. RÓWNOCZESNA - składniki pożywki przekształcają się produkty o zmiennych stosunkach stechiometrycznych bez nagromadzenia się produktów pośrednich

  1. NASTĘPCZA - składniki pożywki przekształcają się w produkty z nagromadzeniem się metabolitów pośrednich

  1. STOPNIOWANA składniki pożywki przekształcają się w produkty pośrednie a te w produkt końcowy lub składniki pożywki całkowicie przekształcają się w produkty w ściśle uprzywilejowanej kolejności

Namnażanie komórek dbn <= => tworzenie produktów

Komórka <= => środowisko

Koordynacja metabolizmu drobnoustrojów - mechanizmy regulacyjne

Oparta na dwóch podstawowych punktach:

  1. występowanie równowagi pomiędzy procesami dostarczającymi i zużywającymi metabolity pośrednie

  2. istnienie energetycznego sprzężenia metabolizmu - oparte na bilansowaniu się zysku energetycznego reakcji z sumą potrzeb na energię

Mechanizmy regulacyjne:

0x08 graphic
Źródło info /środ. wew i zewnątrzkomórkowe/

0x08 graphic
Nośnik info /metabolity, S i P końcowe szlaków metabolicznych/

Mechanizmy molekularne kontrolujące (tym komórka może sterować):

Układy regulacji aktywności enzymów

KATEGORIE ENZYMÓW I ICH ROLE

Dbn posiadają potencjalną możliwość syntezy kilku tysięcy enzymów.

Mechanizmy koordynacyjne pozwalają na wytworzenie tylko niezbędnych w danych warunkach enzymów:

  1. enzymy konstytutywne - syntetyzowane stale, niezbędne w procesach, cykl EMP

  2. enzymy indukcyjne - stymulowane w określonych potrzebach:

Gdy w środowisku jest glukoza galaktoza nie jest zużywana i dochodzi do fazy stacjonarnej - indukcja enzymów dla galaktozy - następny etap……..

Najlepiej spowodować jak najszybsza indukcję enzymatyczną.

Mechanizm kontroli negatywnej jest przeważnie dominujący

DWUFAZOWOŚĆ WZROSTY /Diauxc growth/

W pierwszej kolejności gdy dostępna jest glukoza dbn właśnie ją zużywają. Galaktoza nie jest naruszana. Dochodzi do zatrzymania i fazy stacjonarnej i to jest jednocześnie faza początkowego wzrostu i galaktoza może być zużywana - wzrost wykładniczy.

Dwufazowość wzrostu w biosyntezie penicyliny

Glukoza na początku celowo dodawana by szybko namnożyć biomasę. Potem laktoza i wytwarza się dużo penicyliny.

Efekt Craptree =>tlenowa fermentacja przy wysokim stężeniu cukrów z wytwarzaniem licznych metabolitów ubocznych

Efekt Pasteura (życie bez tlenu)=> hamowanie procesów fermentacyjnych w obecności tlenu /współzawodnictwo o fosforan i ADP między fosforylacją oksydatywną - łańcuch oddechowy, a fosforylacją substratową/

Efekt Cystersa =>negative Pasteur efekt /Brettanomyces spp/, niektóre dbn przy obecności tlenu produkują więcej etanolu niż by wynikało z efektu Pasteura

Efekt Kluyvera - niezdolność drożdży fermentowania określonych sacharydów (wzrostu w war beztl):

TRANSPORT KOMÓRKOWY - system pobierania przez błonę cytoplazmatyczną jako początkowy etap przemian komórkowych. Za transport odpowiadają enzymy, które są aktywowane oraz inaktywowane. Podlega kontroli genetycznej i metabolicznej

REGULACJA TRANSPORTU - może mieć charakter:

Konstytutywny

Indukcyjny:

Cel regulacji przemian metabolicznych

Znajomość mechanizmów regulujących wiążących się z kolejnymi etapami są niezbędne dla poznania istoty procesów i ukierunkować je. Mamy spowodować nadprodukcję metabolitów poprzez ingerencję w mechanizmu regulacyjne.

STOSUNKI MIĘDZY DROBNOUSTROJAMI:

  1. SYMBIOZA - współżycie gatunków dbn przy jednoczesnym odnoszeniu korzyści przez partnerów. W zależności od poziomu korzyści:

  1. SYNERGIZM - współdziałanie np. jeden hydrolizuje substrat drugi fermentuje możliwe jest wytworzenie określonych metabolitów

  2. METABIOZA - polega na określonym następstwie gatunków lub grup w środowisku. Każda kolejna grupa wytwarzając określone metabolity - modyfikując podłoże, stwarza korzystne warunki rozwoju dla swoich następców np. procesy kwaszenia kapusty

  3. KONKURENCJA - o źródło pokarmu, opanowywanie środowiska, wyczerpywanie zasobów; pożądana cecha dla drożdży, gdy chcemy uzyskać wysoką wydajność etanolu, gdy są konkurencyjne do bakterii

  4. ANTAGONIZM - wydzielanie metabolitów antagonistycznych dla drugiego dbn

  5. ANTYBIOZA - szczególny rodzaj antagonizmu. Wytwarzanie wtórnych metabolitów działających hamująco lub zabójczo na inne dbn /toksyn działających również na organizmy wyższe/. Szereg tych metabolitów to substancje antybiotyczne w pewnej wybiórczości utrzymujące równowagę biologiczną i środowiska naturalnego. Zastosowanie w medycynie /antybiotyki/

26.02.2007

PIWOWARSTWO

Sumerowie - Mezopotamia 2800 p.n.e

1516 - „Niemieckie prawo czystości” - do produkcji piwa stosuje się słód jęczmienny, wodę, chmiel i drożdże.

Christian Hansen wprowadził czyste kultury drożdży

Paul Linder - „drop culture metod”

1842 - technologia produkcji piwa jasnego typu pilzneńskiego “Pilsner Urquell” najpopularniejsze piwo na świecie

SUROWCE:

Słód -kiełkowane ziarno jęczmienia. Zanim następuje kiełkowanie dochodzi do zmian wewnątrz jęczmienia - syntetyzują się enzymy proteolityczne, amylolityczne, niektóre są tylko aktywowane np. beta-amylaza.

Polega na wywołaniu kiełkowania ziarna po namoczeniu do określonego poziomu wilgotności. Rozluźnienie struktury ziarna.

Zmianie ulega struktura ziarna oraz powstają odpowiednie cechy aromatyczne

Stan ten utrwala się przez suszenie

SCHEMAT BLOKOWY OTRZYMYWANIA SŁODU

  1. Jęczmień, może być pszenny

  2. Czyszczenie i sortowanie

  3. Magazynowanie

  4. Moczenie

  5. Kiełkowanie ziarna

  6. Suszenie

  7. Oddzielanie korzonków - odkiełkowywanie

  8. Magazynowanie

Nie stosuje się słodowania.

Sposoby moczenia ziarna jęczmienia:

Moczenie powietrzno-wodne: polega na przetrzymywaniu ziarna naprzemiennie pod woda i bez wody

Stały przepływ napowietrzanej wody

Pozwala na ciągłe usuwanie CO2, zanieczyszczeń i substancji wyługowanych z łuski (polifenole).

WADA - duże zużycie wody

Moczenie przez zraszanie - stosowane po dokładnym wymyciu ziaren i wstępnym moczeniu powietrzno-wodnym. W ostatnim okresie moczenia następuje zraszanie ziarna wodą ze stałym odprowadzaniem CO2 i wyługowanych substancji.

Szybkość wchłaniania wody:

Największa szybkość wchłaniania wody pierwszy okres moczenia =1%/h

Z czasem maleje => wyrównywanie ciśnienia osmotycznego, naprężenie półprzepuszczalnych błon kom.

Zależy od:

Wpływ temperatury wody na szybkość jej wchłaniania: wyższa temp lepsza

Zjawiska zachodzące w trakcie moczenia jęczmienia:

Woda dyfunduje do wnętrza ziarna, rozpuszczone proste związki odżywcze dostają się z części przyzarodkowej do zarodka. Zwiększa się objętość ziarna.

Zmienia się barwa ziarna - ze słomkowej na brązową

Następuje wyługowanie z łuski substancji goryczkowych, garbnikowych, polifenoli, barwników i innych, utrudniających wchłanianie wody

Pod koniec moczenia zaczynają wyrastać z ziarna na zew korzonki (tzw. oczkowanie ziarna).

Ziarniak jęczmienia po moczeniu - gdzie kiełek startuje tam ziarno najbardziej zmodyfikowane. Najpierw korzonki potem kiełki liścieniowe się pojawiają.

URZĄDZENIA - komory z perforowanym dnem

Schemat komory do kiełkowania ziarna: nawilżanie powietrza dostającego się od dołu do góry, mieszadła ślimakowe poruszają się w poprzek komór

System w układzie ciągłym - system Wanderhaufen'a produkcji słodu - podzielona na sekcje

Powstawanie enzymów w kiełkującym ziarnie jęczmienia

Zarodek wytwarza kwas giberelinowy i substancje giberylinopodobne, które pobudzają syntezę hemicelulaz (odpowiada za rozluźnienie struktury ziarna, przemianę celulozy), enzymów amylolitycznych i proteolitycznych.

W pierwszej kolejności powstaje endo-beta-glukanaza, a nast. alfa-amylaza i proteinaza, jednocześnie tworzy się fosfataza.

W endospermie tioalkohole aktywują betaamylazę - występującą w bielmie w stanie nieczynnym.

Enzymy biorą udział w procesie technologicznym w procesie zacierania.

Aktywatory i inhibitory kiełkowania:

  1. Aktywatory - kw g - w początkowej fazie kiełkowania - przyspieszenie; dawka -> 0,2 mg kwasu/ kg jęczmienia

  2. Inhibitory - bromian potasu lub bromian potasu z chlorkiem wapnia; dawka ->50 mg KBrO3 + 3 gCaCl2 na kg jęczmienia

Suszenie słodu -FAZA SUSZENIA WSTĘPNEGO - efekty łagodne

Obejmuje okres spadku zawartości wody w surowym słodzie do wartości poniżej 10% (o połowę). Temp nie przekracza 45-50OC.

Zjawiska => proces rozwoju korzonka, oddychanie, rozluźnienie enzymatyczne

W temp 40-45 OC i wilgotności poniżej 20% funkcje życiowe zarodka wyraźnie zanikają

Powstające w tej fazie z rozkładu cukrów złożonych cukry proste oraz z rozkładu peptydów aminokwasy powodują zmianę barwy słodu

Regulując dopływem świeżego powietrza do suszonego słodu można regulować powstawanie cukrów prostych i aminokwasów => wpływać na zmianę barwy słodu

FAZA PRAŻENIA - DOSUSZANIE - suszenie w wyższej temp

Obejmuje okres spadku zawartości wody od 10-40% lub poniżej. Temp w tej fazie wzrasta do temp maksymalnej (wartość zależy od gatunku słodu: jasny, monachijski)

Zanikają prawie całkowicie funkcje życiowe zarodka (spadek wilgotności o tym decyduje). Miarą prawidłowego przebiegu suszenia słodu jasnego jest jego wysoka siła enzymatyczna przy prawie zerowej liczbie ziaren zdolnych do kiełkowania

Przemiany enzymatyczne pod koniec fazy prażenia ulegają zahamowaniu ->enzymy ulegają inaktywacji w różnym stopniu; => w szczególności beta-amylaza, endopeptydazy, i beta-glukanazy (nawet do 60%)

Tworzą się związki barwne - melanoidy.

Musimy zapewnić aktywność enzymatyczną przy malejących funkcjach życiowych zarodka.

Schemat jednowarstwowej suszarni słodu - podobne do urządzeń do kiełkowania, wprowadza się ciepłe gorące powietrze. Mogą być w układzie dwuwarstwowym =>Słód ciemny (przepływa zarówno powietrze świeże jak i po cyrkulacji, na dnie jest większa wilgotność.

Słód ciemny (monachijski) a jasny:

CIEMNY:

Słód barwiący - odmiana ciemnego, ciemnobrunatny

Prażenie słodu jęczmiennego lub słodu mokrego w temperaturze 200-220OC - otrzymywanie. Służy tylko zmianie barwy, gdyż wszelkie funkcje życiowe zanikają.

Gotowy słód przed prażeniem należy poddać moczeniu przez kilkanaście godzin

Słód b stosuje się jako dodatek przy produkcji piw ciemnych w ilości 1:2%

Słód karmelowy

I -> otrzymywany z mokrego słodu jęczmiennego (powyżej 20% wilgotności) poddanego prażeniu w temp 150-180 OC do uzyskania odpowiedniej pożądanej barwy. Sprzyja powstawaniu substancji typ karmel.

Prażenie w specjalnych obrotowych suszarniach walcowych ogrzewanych pośrednio spalinami.

II -> ze słodu dosuszonego, który ponownie się nawilża i podgrzewa do temp 70OC

W tych war następuje częściowa enzymatyczna hydroliza skrobi i subst białkowych

Nast. Słód poddaje się prażeniu w temp 150-180OC

S k stosuje się do produkcji piwa ciemnego w ilości 3-5%.

PARAMETRY SŁODU:

WILGOTNOŚĆ ze względu na trwałość słodu 4-5% (2% dla słodu ciemnego). Zbyt niska wilgotność słodu -> większy udział ziaren połamanych (słód jest kruchy) oraz pyłów

ROZLUŹNIENIE SŁODU różnice w ekstrakcie z przemiału na mąkę i ekstraktu uzyskanego w brzeczce sporządzanej ze śruty (przemiał laboratoryjny). Różnica 1,2-1,8 %.

ZAWARTOŚĆ EKSTRAKTU W MĄCE -EKSTRAKTYWNOŚĆ - wyrażona w % s.s. słodu. W celu oznaczenia ekstraktywności sporządza się tzw. brzeczkę kongresową (powstaje ze słodu mielonego na mąkę). Dla słodów jasnych ekstraktywność =79 do 82%, ciemnych 75-78%. Im wyższy ekstrakt tym lepszy słód.

AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNA W SŁODZIE - SIŁA DIASTATYCZNA WG KOLBACHA (WK) - akt enzymatyczną beta-amylazy; podaje się w jedn Windisch-Kolbach'a. Słody jasne - powyżej 240WK
(z jęczmienia ozimego ->powyżej 350 WK). Słody ciemne od 150-180 WK

BARWA BRZECZKI PO GOTOWANIU - na jej podstawie można określić końcową barwę piwa. Maksymalna zawartość dla słodów jasnych wynosi 7EBC.

KWASOWOŚĆ CZYNNA - pH brzeczki kongresowej 5,6-5,9 - świadczy o właściwej kwasowości słodu. Poza granicami świadczy o zakażeniu.

LEPKOŚĆ BRZECZKI KONGRESOWEJ - charakteryzuje stopień modyfikacji słodu. Norma lepkości brzeczki -1,51 do 1,63 mPa x s. Wyższe wartości -> wynik niedostatecznego rozkładu ścian kom (niewłaściwe rozluźnienie słodu)->trudności w czasie filtracji brzeczki i piwa

Chemiczne -> świadczą o prawidłowym rozwoju drożdży:

OGÓLNA ZAW BIAŁKA W SŁODZIE - waha się od 10 do 10.8%, dopuszczalna 9,5 do 11,5%, świadczą o ilości powstającej piany (właściwy układ koloidalny)

ZAWARTOŚĆ AZOTU ROZPUSZCZALNEGO - ilość azotu przechodząca do r-ru ……..

ZAWAROŚĆ WOLNEGO AZOTU AMINOWEGO (FAN) - ilość wolnego azotu aminokwasowego, która może być dostępna dla drożdży w trakcie fermentacji. Wynosi: 120-160 mg/100g s.s słodu

LICZBA KOLBACHA - procentowy stosunek rozpuszczalnego azotu w brzeczce do ogólnej zawartości azotu w słodzie; przechodzenie właściwej proporcji związków azotowych ze słodu do brzeczki

LICZBA HARTONGA VZ 45OC - charakt akt enzymów proteolitycznych i cytolitycznych. Ściśle wiąże się z zawartością FAN. 33-39%

ZAWARTOŚĆ DMS (siarczek dimetylu) - nie powinna przekraczać 0,45 mg/kg słodu

ODKIEŁKOWANIE SŁODU

Jest procesem niezbędnym => źle przeprowadzony wpływa na pogorszenie smaku piwa

Kiełki usuwa się gdy słod jest gorący.

Odkiełkowanie przeprowadza się w urządzeniu zw odkiełkownicą - sitowy cylinder ze spiralnie ustawionymi łopatkami. Słód przemieszcza się przez perforowaną rurę.

Obrót łopatek +ocieranie się ziaren o siebie ->odłamanie kiełków, które przechodzą przez otwory sita i są usuwane

Usuwanie pyłów powstających w czasie podkiełkowywania - przed warzeniem słód poddaje się ostatecznemu oczyszczaniu (przepłukiwanie)

Kiełki mają w sobie szereg substancji niewłaściwych decydujących o smaku piwa, barwie.

WODA

Woda w Polsce jest wysoko zachlorowana, stosunkowo twarda (500 gCaCO3/m3),

Dobra woda do produkcji piwa:

Mętność nie przekracza 10 mg/m3

Brak twardości! Woda niechlorowana!

Żelazo 0,1 mg Fe2+/dm3

Mangan 0,1 mg Mg2+/dm3

Substancje rozpuszczalne 500 mg/dm3

Zasadowość 75 mg CaCO3/dm3

Zapach/smak - brak

Siarkowodór - 0,2 mg/dm3

Inne NaCl<275 ppm, pH 6,5-7,0

Alkaliczność resztkowa - najważniejszy parametr wody; powstaje po zmiękczaniu wody - usuwanie twardości

Twardość Ca + twardość Mg

AR = TW - -----------------------------------

3,5

AR - alkaliczność resztkowa (on)

TW - twardość węglanowa

1on = 10 mg CaO/l = 7,19 mg MgO/l

W wodzie po prod piwa AR nie powinna przekraczać 5 on.

CHMIEL:

Rozdzielnopłciowa pnąca bylina należąca do rodziny Cannalis

W browarnictwie stosuje się kwiatostan żeński rośliny dwupiennej- zawiera gorzkie żywice (twarde, miękkie)

Stosowany jest pod postacią suszonych szyszek lub produktów pochodnych

Słowne obszary produkcji chmielu goryczkowego ->St. Zjednoczone, Niemcy, Australia, Chiny, a chmiel aromatyczny (dużo olejków chmielowych)->Niemcy, Czechy, USA, Ukraina, Polska

Skład chemiczny szyszek chmielowych:

Alfa(więcej) i betakwasy

OLEJKI CHMIELOWE - nadają aromatyczność

Związki siarki bez tlenu

Zw.hydrokarbonowe (ok. 75% olejków) MYRCEN z grupy monoterpenów

Zw zawierające tlen (ok. 25% olejków)

GARBNIKI I POLIFENOLE W CHMIELU (występują też w słodzie)

Szyszki chmielowe zawierają 2-5% polifenoli w s.s.

Mieszanina tanin, flawonoidów, katechin, antycyjanogenów (80%)

Nadają piwu cierpki smak

Utleniają związki barwne

Tworzą czarne kompleksy ze związkami żelaza

Odpowiedzialne za tworzenie się zmętnień w piwie, ponadto nadają mu barwę i smak

W czasie warzenia 80% związków polifenolowych obecnych w piwie przechodzi do brzeczki ze słodu, a 10% z chmielu.

WARTOŚĆ GORYCZKOWA => wskazuje jakość chmielu

Najważniejsza wartością żywic chmielowych jest `wartość goryczkowa”

Beta-kwasy

WG = alfa-kwasy + ------------------

9

Równanie Wólmera

Zależy od zawartości alfa-kwasów (nierozpuszczalnych) i szybkości ich konwersji do rozpuszczalnych izo-alfakwasów.

Sposoby przetwarzania chmielu:

DROŻDŻE

W Polsce do produkcji piwa używa się wyłącznie drożdży, w innych krajach (Niemcy, Belgia) również bakterie np. FM. Dają specyficzny rodzaj piw.

Wszystkie drożdże piwowarskie należą do gat S.cerevisiae

D fermentacji dolnej - s.c ssp uvarum var calsbergensis

Górnej - s.c ssp uvarum var cerevisiae

Różnią się pod względem morfologii. Dolnej nie tworzą łańcuchów, ale zgrupowania komórek. Górne tworzą skupiska unoszące się na powierzchni.

Fermentacji dolnej całkowicie odfermentowują rafinozę. Temperatura wzrostu podobna 28OC. Optymalne warunki działania katalazy (dolnej w wyższej temperaturze). Proces fermentacji w odwrotnych temperaturach: dolnej 5-10OC, górnej 15-25OC. Górnej można stosować nieskończenie długo. Nie wymagają zwiększania szarży. Fermentacja drożdży zachodzi w opakowaniach. Dolnej leżakują 0OC 4-6 tygodni.

Górnej przeprowadzają szybciej fermentację.

Sposoby przetwarzania chmielu:

sprasowane palety chmielowe

0x08 graphic

0x08 graphic
proszki chmielowe

0x08 graphic

0x08 graphic
wysuszony chmiel ochłodzony do temp 60OC, młyn młotkowy

0x08 graphic

ekstrakty chmielowe

0x08 graphic

0x08 graphic

izomeryczne ekstrakty chmielowe

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
SZYSZKI CHMIELOWE CAŁE

rozpuszczalniki organiczne

0x08 graphic

ogrzewanie

destylacja z parą wodną

0x08 graphic
ciekły CO2 (warunki nadkrytyczne)

ekstrakty chmielowe

0x08 graphic

0x08 graphic

olejki chmielowe aromatyczne (aromat starego chmielu"

frakcjonowane ekstrakty chmielowe

aromatyczne olejki chmielowe

S c h e m a t t e c h n o l o g i i p i w a

0x08 graphic
SŁÓD

mielenie

0x08 graphic
(rozdrobnienie słodu)

śruta

0x08 graphic
(słód rozdrobniony)

0x08 graphic

0x08 graphic

DODATKI NIESŁODOWANE (grysik)

0x08 graphic
WODA

zacieranie

0x08 graphic

filtracja brzeczki

0x08 graphic

wysłodziny

0x08 graphic
(zacieru)

(osady)

brzeczka słodka

(przednia)

0x08 graphic

CHMIEL

0x08 graphic

0x08 graphic
gotowanie brzeczki z chmielem

0x08 graphic

syropy lub cukier

0x08 graphic
brzeczka chmielona (gorąca)

usuwanie osadów gorących

0x08 graphic

chmieliny, osady gorące

0x08 graphic

chłodzenie i napowietrzanie

0x08 graphic

brzeczka nastawna

0x08 graphic
DROŻDŻE

0x08 graphic
0x08 graphic
fermentacja

gęstwa drożdżowa

PIWO MŁODE

0x08 graphic

ŚRODKI POMOCNICZE

0x08 graphic

0x08 graphic
leżakowanie i kondycjonowanie

0x08 graphic
0x08 graphic

brzeczki rozlew do butelek, ferm. wtórna

0x08 graphic

0x08 graphic
0x08 graphic
klaryfikacja

drożdże, osady zimne (metody membranowe)

Rozlew

stabilizacja biologiczna

0x08 graphic

0x08 graphic

stab biologiczna

rozlew

0x08 graphic

0x08 graphic

małe opakowania

duże opakowania (nalewaki)

Przemiał słodu - charakterystyka, różny sposób mielenia zależnie od urządzenia

Kadź filtracyjna - wymaga dużych łusek, filtr zacierny-tradycyjny, filtr Meura (udział łuski niewielki), filtr podciśnieniowy - uzyskamy lepszą ekstraktywność, można dobrze rozdrobnić słód

URZADZENIA ODDZIELAJĄCE

Śrutownik na mokro

Etapy pracy:

  1. Moczenie (namoczenie słodu wodą)

  2. Odpompowanie wody namoczonej

  3. Rozdrobnienie słodu (wyciśnięcie ziarna (bielma) bez uszkodzenia łuski)

  4. Płukanie

Śrutownik na sucho:

Zwykle używane w przypadku wykorzystania kadzi filtracyjnych.

W zależności od ilości walców rozróżniamy: ś dwuwalcowe, 4walcowe

Działanie beta-amylazy

Beta-amylaza jest pierwszym enzymem, który działa w tym układzie. Jest w stanie oddzielać dwucukry maltozy od łańcucha. Amyloza złożona jest z małych podjednostek maltozowych. Amyloza jest rozkładana w całości. Amylopektyna - 1,6 glikozydowe nie są hydrolizowane przez beta - tylko alfa-amylazę.

Zjawiska zachodzące w czasie zacierania:

37-45 OC - hemicelulazy - rozkład składników ścian kom

45-50 OC- endobetaglukanaza, endopeptydazy - rozkład betaglukanów i białka; przemiana betaglukonowo-białkowa

Temp 52-55 OC- endopeptydazy, też egzopeptydazy - rozkład białek do peptonów i aminokwasów - przerwa białkowa

62-65 OC beta-amylaza - rozkład skrobi do maltortiozy, maltozy i glukozy - przerwa maltozowa

70-76 OC alfa amylaza (enzym termostabilny)- rozkład skrobi do dekstryn (dekstryny ograniczne)-przerwa scukrzająca

Sposoby zacierania: mają na celu najlepsze wydobycie składników, doprowadzenie do całkowitej
hydrolizy

ZACIERANIE INFUZYJNE (TEMP POCZĄTKOWA 35OC) - podnosimy temperaturę zacieru, przerwy - przetrzymywanie danego zacieru przez określony czas

ZAŁOŻENIE: słód jest słabo rozluźniony

ZACIERANIE INFUZYJNE Bardziej typowy sposób od 54OC, od endopeptydaz, 30 min pozwala na zapewnienie im optimum działania.

Procedura ta jest najprostsza, nie wymaga dużych urządzeń.

ZACIERANIE DEKOKCYJNE JEDNOWAROWE

Istnienie 2 urządzeń na etapie kadzi zaciernej i kadzi gotującej. W pewnym momencie część zacieru można odpompować do drugiego urządzenia (sterowanie temperaturą) i doprowadzić do wrzenia.

Początek procedury taki jak poprzednio (zaciery dobrze rozluźnione). Podnosimy temp do 60OC. Część odpompowana jest do innej kadzi. Odpompowana podlega skokowemu wzrostowi temperatur. Dochodzi do zagotowania. Część skrobi jest sklejkowana (zawracana jest do pierwszej kadzi). Gwałtowny wzrost temp.

Z.D. DWUWAROWE - o wyborze metody decyduje surowiec; inna temp początkowa procesu

Ekstrakt fermentujący:

W jakim stopniu składniki zawarte w słodzie przemieściły się do gotowej brzeczki.

Ok. 75-78% stanowią czynniki rozpuszczone. Reszta to jest młóto (odpad usuwany).

Skład ekstraktu: cukry (fruktoza, glukoza, sacharoza, maltoza, maltotriozy, dekstryny), białka, substancje azotowe, trochę gumy, związki mineralne. Nie wszystkie składniki są składnikami fermentującymi.

FILTRACJA BRZECZKI - KADZ FILTRACYJNA - posiada podwójne dno

  1. Wypełnienie wodą (temp 78OC) przestrzeni pomiędzy sitem i dnem kadzi (wypchnięcie powietrza)

  2. Wpompowanie od góry zacieru przy włączonym mieszadle

  3. Pozostawienie w spokoju 20-30 min => ułoży się warstwa osadów słodu - sedymentacja (ważny sposób mielenia słodu) - tworzy się naturalny filtr warunkujący uzyskanie klarownej brzeczki

  4. Ściąganie brzeczki przedniej - I etap filtracji - punkt wybicia brzeczki (po tym jak na początku odciągnięta została woda); wprowadza się dodatkowo ciepłą wodę - dodatkowe płukanie

  5. Wysładzanie (2-3krotne) - brzeczka wysłodkowa (do zaw.ekstraktu 0,5%wag)

FILTR ZACIEROWY - PRZEBIEG PRACY

Warstwa wysłodzin <6 cm => lepsze wyługowanie ekstraktem

ZAGADNIENIA FERMENTACJA


  1. Podstawy procesów fermentacyjnych

  2. Szlaki metaboliczne, energetyka procesów

  3. Kinetyka wzrostu kultur

  4. Modele wzrostu dbn

  5. Regulacja metabolizmu dbn

  6. Surowce stosowane w produkcji piwa

  7. Produkcja słodu

  8. Materiały pomocnicze

  9. Mikroorganizmy w produkcji piwa

  10. technologia produkcji piwa

  11. przemiany enzymatyczne w czasie zacierania

  12. chmielenie

  13. fermentacja i dojrzewanie

  14. wady i choroby piwa

  15. metody utrwalania piwa

  16. produkty uboczne i odpadowe

  17. winiarstwo: surowce i mikroorganizmy

  18. klasyfikacja i podział win

  19. technologia produkcji win

  20. dojrzewanie win


01.03.2007

GOTOWANIE BRZECZKI Z CHMIELEM 60-120 min

Chmiel jest czynnikiem wzrostowym.

  1. gotowanie z zewnętrznym pogrzewaczem

  2. z wewnętrznym podgrzewaczem - nowoczesne kotły warzelne z wewnętrznym podgrzewaczem /płaszczowo rurowy - pionowy wymiennik ciepła/ przez który przepływa brzeczka. Spełnia dodatkowo rolę mieszalnika. Brzeczka jest przepompowywana przez element zewnętrzny.

Cel gotowania brzeczki z chmielem:

KADŹ OSADOWA /whirpool/

Dochodzi tutaj do oddzielenia strąconych osadów.

Do whirpoola brzeczkę wpompowuje się po stycznej zewnętrznej ścianki, wynikiem czego jest wirowy ruch cieczy - powodujący zbieranie się gorącego osadu w środku naczynia (placka, czopa) - jest dołem odciągany, usuwany.

Niewłaściwe usunięcie osadów gorących może powodować:

CHŁODZENIE BRZECZKI - etapy/ fazy

Chłodzenie należy przeprowadzić szybko, gdyż może zasiedlić się obca mikroflora - wtórne zakażenie brzeczki.

NAPOWIETRZANIE BRZECZKI

1. Chłodzenie brzeczki musi przebiegać sprawnie, pośrednie temp. sprzyjają rozwojowi mikroflory niepożądanej

2. Jednocześnie z ochładzaniem przeprowadza się napowietrzanie brzeczki

Tlen jest niezbędny dla szybkiego namnażanie drożdży - zostaje zużyty w ciągu kilku h po zaszczepieniu

Sposoby:

Natlenienie brzeczki = 9mg/l. Zwykle jest nieco wyższe.

ZASZCZEPIANIE DROŻDŻAMI

Do zaszczepiania brzeczki chmielowej stosuje się wybrane odpowiedni szczep drożdży, który dobrze zaadoptował się w warunkach browaru.

Drożdże nastawne przygotowuje się w dziale propagacji drożdży z czystej kultury (Kolekcje Czystych Kultur)

W browarach przede wszystkim wykorzystuje się drożdże z wcześniejszych szarż produkcyjnych.

Drożdże wypowiadają odpowiedniego postępowania /dekarbonizacja - usunięcie CO2/ pielęgnacji i przechowywania (przemywanie, dokwaszanie).

GODPODARKA DROŻDŻAMI W BROWARZE

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic

Końcowa sedymentacja

0x08 graphic

Zbiór drożdży 60%

0x08 graphic

I sedymentacja

0x08 graphic

Kadzie w postaci Unitanków pionowe - kształt stożkowaty
umożliwia burzliwość (sedymentację) i utworzenie się
warstw drożdży.
60% drożdży pochodzi ze środkowej części, gdyż
te które docierają do sedymentu jako pierwsze są nieatrakcyjne

(stare, ugniatają się i podlegają zniszczeniu).
Końcowa sedymentacja - komórki mniejsze i powiązane
z zanieczyszczeniami. Osady mieszają się z górną w-wą.

ZASZCZEPIANIE

Napowietrzanie

Ilość dodawanych drożdży:

Sposoby zadawania drożdżami:

    1. wprowadzanie drożdży bezpośrednio do tanku fermentacyjnego

    2. dozowanie w przepływie - do przewodu z brzeczką

FERMENTACJA:

  1. KLASYCZNA - browar Jurand

  2. W TANKOFERMENTORACH - fermentacja + leżakowanie

FEREMNATCJA KLASYCZNA W KADZIACH OTWARTYCH

  1. zaszczepianie - szybki przyrost biomasy drożdży (liczba kom. zwiększa się 3-4 razy) do momentu wyczerpania tlenu; komórki są z reguły na dnie zbiornika

  2. faza krążków niskich - biała czysta piana na pow brzeczki, która stopniowo gęstnieje i zmienia kolor na brunatny - wytrącenie się żywic chmielowych oraz substancji garbnikowo-białkowych

  3. faza krążków wysokich - główny etap fermentacji - fermentacja burzliwa - wysoka piana; proces fermentacji osiąga maximum; wytrącone żywice pokrywają całą powierzchnię piany => intensywny brunatny kolor

  4. faza opadania krążków - końcowy etap fermentacji, piana zanika, drożdże opadają na dno a młode piwo się klaruje
    Przyśpieszyć opadanie drożdży - obniżyć temperaturę

  5. pod koniec fermentacji powierzchnię brzeczki pokrywa cienka warstwa opadłej piany - powłoka pofermentacyjne, którą należy usuwać

TANKOFERMENTORY

Efekty powstawania piany są niedostrzegalne (zamknięte pojemniki). Proces fermentacji i leżakowania

Fermentacja w Unitanku:

Zmiany temp, kwasowości i zawartości ekstraktu w brzeczce w czasie fermentacji

0x08 graphic

0x08 graphic

Wzrastanie temperatury do 3-4 dnia (jest wyższa niż temp nastawna)

Proporcjonalnie obniża się pH i maleje wartość ekstraktu, głównie fermentującego.

Po 7 dniach burzliwej fermentacji proces się kończy.

Przemiany składników brzeczki z udziałem drożdży

0x08 graphic
0x08 graphic
BRZECZKA DROŻDŻE PIWO

0x08 graphic

0x08 graphic
0x08 graphic
Cukry (maltoza)

0x08 graphic
Produkty odpadowe (alkohol i CO2)

0x08 graphic
0x08 graphic
Zw.azotowe

0x08 graphic

0x08 graphic
O2

Witaminy
i mikroelementy

Więcej komórek drożdżowych

Wzrost i podział komórek

0x08 graphic
ZWIĄZKI SIARKI W PIWIE: => wiążą chmiel

LEŻAKOWANIE: 6 TYGODNI (zwiększone ciśnienie może skrócić)

  1. Odfermentowanie pozostałej części ekstraktu do wymaganego poziomu

  2. nasycenie dwutlenkiem węgla CO2piwa młodego

  3. dojrzewanie i nabieranie delikatnego smaku i zapachu piwa - interakcje między estrami a aldehydami

  4. klarowanie wskutek osadzania drożdży i osadów w wyniku obniżania temperatury

  5. zwiększenie redukcyjnych zdolności piwa => ograniczenie niekorzystnego wpływu tlenu na jego smak

Odbywa się:

Dawniej => w drewnianych kufrach

Obecnie w stalowych tankach leżakowych. Tanki poziome - nie znaczenia etap odbierania drożdży.

FILTRACJA PIWA => uzyskanie klarownego piwa

Mechanizmy filtracji:

Obecnie filtracja krzyżowa!!
Przepływ nad powierzchnią przegrody porowatej

Środki filtracyjne:

Filtr namułowy - przebieg filtracji:

  1. nanoszenie warstwy podstawowej /wstępnej/ w ilości 70% na zasadzie zamulania powierzchni tkaninowej

  2. nanoszenie warstwy podstawowej /zabezpieczającej/ 30%

  3. bieżące dozowanie ziemi

W trakcie prowadzenia filtracji zużycie ziemi okrzemkowej kształtuje się od 60 do 120g/hl przepuszczanego piwa

Filtracja membranowa - moduły zamknięte

STABILIZACJA PIWA

Trwałe piwo to:

Piwo pasteryzowane po pewnym czasie często długo mętnieje. Zmętnienia te są spowodowane głównie przez koloidalne substancje rozpuszczone w piwie.

Zimne zmętnienie - zmętnienie koloidalne, które wyst po schłodzeniu i rozpuszcza się po ogrzaniu do 20 OC

Z czasem zimne z przechodzi w zmętnienie trwałe, które nie zanika

Zmętnienie trwałe - to wiązania wysokocząsteczkowych produktów rozkładu białka z polifenolem, głównie antocyjanogenami.

Środki stabilizujące piwo:

Ż.krzemionkowe wiążą złożone produkty rozkładu białek (wielkocząsteczkowe)

PVPP - zw. organiczny, wiąże i usuwa zw. fenolowe.

Wiązanie to opiera się na wykształceniu w kwaśnym pH mostków wodorowych, które w zasadowym r-rze ponownie uwalniają fenole.

Przeciwutleniacze (środki opóźniające proces starzenia się piwa):

Czynniki powodujące starzenie bukietu piwa: - powodują WADY piwa

ROZLEW PIWA

Napełnianie opakowań

Piwo rozlewa się do naczyń jednostkowych za pomocna urządzenia zwanego monoblokiem /w jednym urządzeniu następuje po sobie nalew butelki lub puszki oraz zamknięcie opakowań

Piwo nalewane jest w systemie zwiększonego ciśnienia z zapewnieniem minimalnego napowietrzania.

STABILIZACJA MIKROBIOLOGICZNA => PASTERYZACJA

>obróbka termiczna, aby zapewnić odpowiednio długi okres przydatności do spożycia

> pasteryzacja w butelkach jest najpewniejsza metoda utrwalania, gdyż nie ma możliwości ponownego
zainfekowania

Warunkiem skuteczności pasteryzacji jest doprowadzenie potrzebnej ilości jednostek pasteryzacji.

Jednostka pasteryzacji => efekt działania w piwie temperatury 600C w ciągu jednej minuty

JP = czas x 1,393 różnica temperatur /temp 60OC/

Do przeprowadzenia pasteryzacji piwa w butelkach służy pasteryzator tunelowy.

ETYKIETOWANIE

Przed opuszczeniem browaru butelka zostaje zaopatrzona w zestaw etykiet i odpowiednio oznaczona, co ułatwia identyfikację.

  1. przemywanie

  2. zakwaszanie /pozbyć się i zapewnić drożdżom czystość/; bakterie preferują środ.alkaliczne

  3. przesiewanie

  4. przewietrzanie

  5. przechowywanie

Najważniejsze gdyż wyczuwane organoleptycznie i trzeba unikać

Nawet jeśli będą nie jesteśmy w stanie ich wyczuć



Wyszukiwarka