Agnieszka Filemonowicz, 172332
Beata Korkuś, 172648
Grupa: II, piątek 8:15
Data zajęć: 8.04.2011r., 15.04.2011r.
Prowadzący kurs: mgr M. Kozłowska
Sprawozdanie z Laboratorium Inżynierii Genetycznej
Ćwiczenie nr VI i VII
Cel ćwiczenia:
Ekspresja domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD) z plazmidu pGEX-2T ( pGEX-2T/ EcRDBD ), w komórkach E. Coli szczepu XL1-Blue.
Indukcja ekspresji EcRDBD.
Analiza białkowych produktów ekspresji z wektora pGEX-2T i pGEX-2T/ EcRDBD w poliakrylamidowym żelu denaturującym, w układzie nieciągłym wg Laemlli'ego (SDS-PAGE).
Metodyka:
Punkty 1-3 wykonane zostały przez asystenta.
Z płytki po ligacji pobrano kilka kolonii, każdą z nich zainokulowano w 3 ml pożywki płynnej LB zawierającej karbenicylinę w stężeniu końcowym 100 μg/ml. Uzyskane w ten sposób kultury inkubowano w temp. 37 ºC przez 12 h na wytrząsarce rotacyjnej przy 182 obr./min. Wyizolowano plazmidowe DNA z 1,5 ml przygotowanych w ten sposób hodowli bakteryjnych (izolacja plazmidowego Dna w małej skali) oraz zidentyfikowano klony zawierające wektor z insertem wklonowanym w poprawnej orientacji wykorzystując trawienie klonów rekombinowanego plazmidu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i/lub PCR.
Bakterie szczepu XL1-Blue transfekowane odpowiednim plazmidem, w który wklonowano pożądany fragment DNA, wysiano na płytkę LB z karbenicyliną w stężeniu końcowym 100 μg/ml i inkubowano w temperaturze 37 ºC przez 12h. Z płytki pobrano jedną kolonię i zaszczepiono nią 10ml pożywki płynnej LB zawierającej karbenicylinę. Kultury inkubowano w temp. 37 ºC przy 182 obr./min. Aż do pojawienia się wyraźnego zmętnienia, po czym wykorzystano bezpośrednio jako szczep do przygotowania hodowli właściwej.
W analogiczny sposób przygotowano hodowlę XL1-Blue, transformowanych wyjściowym plazmidem pGEX-2T.
Z przygotowanych przez asystenta hodowli starterowych pobrano 5 ml zawiesiny komórek XL1-Blue transformowanych wektorem pGEX-2T lub pGEX-2T/ EcRDBD i przeniesiono je do dwóch osobnych kolb zawierających każda po 50 ml świeżego medium LB z karbenicyliną w stężeniu końcowym 100 μg/ml. Kolby inkubowano w temp. 37 ºC przy 182 obr./min., aż gęstość optyczna hodowli mierzona przy λ=600 nm (OD600) osiągnie wartość 0,5-0,6.
Po uzyskaniu odpowiedniej wartości OD600 z obu kolb pobrano po 1ml hodowli, odwirowano w wirówce Eppendorfa (1,5 min, ~ 14000xg), odrzucono supernatant, a osad bakterii zawieszono w 100 μl 2xSB. Przygotowane w ten sposób próbki NI/EcRDBD ( z hodowli z wektorem pGEX-2T/EcRDBD) oraz NI/K (z hodowli z wektorem pGEX-2T) zamrożono w -20 ºC.
Następnie do obu kolb odano 26μl ZnCl2 w stężeniu końcowym 50 μM oraz 26 μl IPTG w stężeniu końcowym 0,25 mM i kontynuowano inkubację w temp.37 ºC przy 182 obr./min.
W czasie trwania hodowli pobierano po 1 ml próbki wg poniższego schematu:
Czas (min) |
P (próbka) |
K (kontrola) |
0 |
- |
- |
15 |
A |
- |
30 |
B |
- |
60 |
C |
- |
90 |
D |
- |
120 |
E1 EcR |
E2K |
Do pobranych zawiesin komórkowych po odwirowaniu i usunięciu supernatantów dodano 2xSB zgodnie z powyższą procedurą podaną dla próbek NI/EcRDBD i NI/K.
Wszystkie probówki z uzyskanymi próbkami zamrożono w -20 ºC.
Próbki białek bakteryjnych poddano denaturacji przez pięciominutową inkubację w temp. 95 ºC w termomikserze, po czym odwirowano w wirówce Eppendorfa przy ~14000xg przez 10 min.
Przygotowano żel poliakrylamidowy i aparaturę do przeprowadzenia elektroforezy.
Na żel naniesiono 7 μl roztworu niskocząsteczkowych białek standardowych, przygotowany w 1xSB, w przypadku próbek pobranych przed dodaniem IPTG, na żel naniesiono 12 μl roztworu, natomiast z próbek indukowanych- po 10 μl roztworu.
Elektroforezę przeprowadzono w żelu poliakrylamidowym o wymiarach 97x55x1,5 mm w układzie nieciągłym (żel 4% - gówny, zagęszczający, żel 12%- dolny, rozdzielający), w warunkach denaturujących.
Elektroforezę prowadzono w 1x buforze do SDS-PAGE, przez ok 1h, przy stałym natężeniu 30 mA.
Po przeprowadzeniu elektroforezy żel umieszczono dwukrotnie w roztworze do odbarwiania żeli na 10 minut.
Następnie żel zabarwiono przy pomocy roztworu z Coomassie, po czym odbariwono tło przez moczenie z roztworze do odbarwiania żeli.
Wyniki
OD600 odczytane po 34 minutach inkubacji:
ODEcRDBD = 0,612
ODK = 0,553
Zdjęcie żelu po elektroforezie SDS-PAGE
Wyniki:
Elektroforeza analityczna w żelu agarozowym:
M K 1 2 3 4 5 6
M - marker
K - kontrola
1 - 6 - numery poszczególnych próbek trawionego wektora pGEX-2T
Elektroforeza preparatywna:
|
MASA [g] |
Próbka |
0,960 |
DNA |
0,111 |
Wnioski:
W buforze 6 x SB znajduje się m.in. 20% fikol 400, który służy do zagęszczenia próbki.
Żel
Elektroforeza analityczna:
Pasmo kontroli (K) po rozdziale elektroforetycznym umiejscowiło się poniżej pasm odpowiadających poszczególnym próbkom, ponieważ kontrola zawiera wyłącznie koliste DNA, natomiast próbki (1-6) zawierają liniowe DNA. Migracja kontroli (kolistego DNA) w żelu agarozowym jest szybsza od migracji próbek (liniowe DNA).
Liniowość DNA wynika z faktu, że zostało ono wcześniej poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymem BamHI, który tnie DNA w jednym miejscu, w związku z czym otrzymujemy po jednym pasmie z każdej próbki.
Porównując pasmo markera, kontroli i poszczególnych próbek możemy stwierdzić, że cięcie restrykcyjne oraz elektroforeza przebiegły pomyślnie - DNA zostało przecięte według założenia.
Elektroforeza preparatywna nie przebiegła do końca pomyślnie. Powodem tego był fakt, że początkowo zalano żel zbyt małą ilością buforu, w wyniku czego żel był za suchy, bufor nie dostał się do studzienek, elektroforeza nie postępowała i nastąpiła częściowa utrata DNA. Czas trwania błędnie prowadzonej elektroforezy wynosił 10 minut. Następnie żel ponownie polano dodatkową ilością buforu, dzięki czemu warunku prowadzonej elektroforezy uległy polepszeniu. W prawidłowych warunkach elektroforeza przebiegała 22 minuty. Skutkiem wyżej opisanego błędu była mniejsza niż przypuszczalna masa DNA wyciętego z żelu. W związku ze zmniejszoną masą DNA na kolumnę nałożono 25 μl buforu TE zamiast podanej w instrukcji wartości
30 μl.
Żel analizowano w świetle UV przy długości fali równej 365 nm, aby badane przez nas DNA pozostało w formie nienaruszonej.
W doświadczeniu użyto:
- roztwór R7S - rozpuszcza agarozę oraz przygotowuje DNA do związania z kolumną,
- izopropanol - strąca DNA i zmniejsza jego rozpuszczalność,
- roztwór A1 - zawiera rozpuszczalniki organiczne; przepłukuje DNA.