Kolokwium 3. Magdalena Pawełkiewicz 18.01.2011 r.

Mapowanie i markery molekularne

Jak poznać strukturę genomu…?

• Genomy składają się z regionów kodujących i nie kodujących

• Regiony kodujące stanowią niewielki % całego genomu, są jak „wyspy” rozrzucone między sekwencjami nie podlegającymi transkrypcji. Dąży się do ustalenia:

- rozmieszczenia na chromosomach

- sekwencji w loci kodujących

- ich funkcji

- zmienności allelicznej

- wzajemnej interakcji

• Poprzez poznanie sekwencji całych genomów

- PROJEKTY SEKWENCJONOWANIA

Arabusopsis thaliana - rzodkiewnik - dwuliścienny gatunek

Oryza sativa - ryż - jednoliścienny gatunek

• Poprzez przyjęcie strategii badawczej

- PROJEKTY MAPOWANIA Z UŻYCIEM MARKERÓW MOLEKULARNYCH

Większość gatunków roślin

Mapy:

• Schematyczne odwzorowanie genomu organizmu lub elementu genetycznego (np. plazmidu) przedstawiające wzajemne położenie poszczególnych genów i innych elementów genetycznych.

Geny ułożone są liniowo na chromosomach - mapy liniowe

GENETYCZNE:

• Odległość genetyczna między genami (markerami) na chromosomie (grupa sprzężeń), wyrażana częstością zachodzenia rekombinacji mejotycznej między nimi

FIZYCZNE:

• Fizyczna odległość między markerami wyrażona w tysiącach lub w milionach par zasad

Co to jest mapa genetyczna?

• Mapy genetyczne wskazują na względne położenie specyficznych markerów wzdłuż chromosomu - informacja na temat struktury, funkcji i ewolucji genomu

• Spokrewnione gatunki zazwyczaj mają podobną zawartość i lokalizację genów i markerów

Markery:

• Potencjalnym markerem to jakakolwiek dziedziczna cecha fizyczna czy molekularna, różna pomiędzy osobnikami, łatwo wykrywalna

• Markerem może być gen lub odcinek nie kodujący jeżeli jego dziedziczenie można prześledzić

• Marker musi być polimorficzny co znaczy, że muszą istnieć alternatywne formy (allel) pomiędzy osobnikami w badanej populacji

• Im bliżej markery leżą obok siebie, mniejsze jest prawdopodobieństwo rozdzielenia alleli podczas rekombinacji = będą dziedziczyć się razem

• Odległość między dwoma punktami nie jest mierzona w jednostkach fizycznych ale w centymorganach

1 cM = 1% rekombniacji

• Im dalej od siebie są markery 1 i 2 - tym częstsze rekombinacje

Jednostka mapowa nie równa się 1 stałej odległości fizycznej ponieważ crossing over zachodzi z różną częstością w różnych rejonach w obrębie chromosomów

telomery - c/o zachodzi częściej

centromery - c/o zachodzi rzadziej

• Do raz stworzonej mapy dodajemy następne markery używając do analiz dokładnie tej samej populacji

• Takie mapy powstały dla wielu roślin, głównie użytkowych jak: ryż, kukurydza, soja….

Co to jest mapa fizyczna?

Mapa fizyczna mierzona jest w parach zasad (pz) i określa odległość między dwoma punktami.

Dwa markery mogą być genetycznie bardzo blisko siebie, np. mały współczynnik rekombinacji między nimi, ale daleko fizycznie - tysiące pz (zależy od gatunku)

Gatunek kpz/cM

- rzodkiewnik 139

- pomidor 510

- kukurydza 2140

Określ czy między markerami genetycznym odległość 1kpz (1.000pz) czy 1Mpz (1.000.000pz)

Koncepcje mapowania fizycznego:

• Określenie kolejności specyficznych sekwencji - markerów na chromosomach i ustalenie odległości między nimi w parach zasad

• Rekonstrukcja genomu przez uporządkowanie mniejszych fragmentów DNA w specjalnych wektorach

Populacja mapująca:

• Ma podstawowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu

• Formy rodzicielskie - to homozygotyczne linie wsobne, niski stopień pokrewieństwa, co zwiększy poziom polimorfizmu w potomstwie

• Populację mapującą stanowią rozszczepiające się potomstwo

• Liczebność

Markery - podział

Marker to cecha odróżniająca jednego osobnika od drugiego, cecha fenotypowa choroba dziedziczna, występowanie lub brak jakiegoś polipep. różnice w sekwencjach DNA

Markery genetyczne

• Markery morfologiczne, mutacje w genach z konsekwencjami w postaci zmian fenotypowych

- kształt liścia, barwa kwiatów, nasion, karłowatość, omszenie itp…

- mutacje, problemy z epistazą

- podlegają wpływom środowiska

- fenotyp przejściowy

- trudne do znalezienia sprzężeń

• Markery molekularne

• Markery białkowe: izozymy, allozymy

• Markery DNA

Restrykcja:

• RFLP (+)

Restrykcja + PCR:

• AFLP (+)

• SAMPL

PCR:

• RAPD (+)

• SSR (+)

• AP-PCR; DAF; SCAR; RAMP; AMP-FLP; SPAR; ISSR; SSCP

Dobry marker:

• Nieinwazyjna analiza (przeżyciowa)

• Powtarzalny

• Wykrywalny na wczesnych etapach rozwoju

• Losowo występujący w genomie

• Analiza zautomatyzowana

• Łatwa do śledzenia w potomstwie (cecha jakościowa, nie ilościowa)

• Wolna od wpływów środowiska - fenotyp przejściowy

• Monogeniczna (niemodyfikowana epistatycznie)

• Polimorficzna (zmienna w populacji)

- polimorfizm prosty - substytucja, delecja, insercja pojedynczych nukleotydów (zwykle dwa allele)

- polimorfizm złożony - zmiany na większą skalę (kilka do kilkunastu alleli)

???

• Z supernatantu musimy pozyskać DNA poprzez wytrącanie

• DNA wytrąca się w niskiej temperaturze w środowisku kwaśnym poprzez dodanie alkoholu

- alkohol etylowy - 2,5V supernatantu

- alkohol izopropylowy - 0,7-1V supernatantu

- wyizolowane DNA przemywamy etanolem (z resztek buforu, izopropanolu)

- osuszamy (etanol odparowuje)

- rozpuszczamy w buforze TE lub w wodzie:

4^oC - przez noc - najlepiej

RT - do godziny

65^oC - 10 min

Elektroforeza DNA

• Ilość DNA - przybliżeniu porównując intensywność prążków DNA w drabince

• Jakość - stopień degradacji:

- 1 wyraźny prążek

- SMIR ciągnący się za prążkiem świadczy o degradacji DNA

DNA dobrej jakości - jeden prążek

Marker wielkości - tzw. drabinka DNA

Zdegradowane SMIR to DNA pocięte przez enzymy, połamane; są to cząsteczki różnej długości migrujące w żelu

Definicje i zasady

Elektroforeza = ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym poprzez żel w wyniku przyłożonego napięcia.

Molekuły rozdzielane są ze względu na:

1. Wielkość

2. Strukturę

3. Rozkład ładunku

Czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu:

• Wielkość cząsteczki

• Konformacja DNA

• Koncentracja agarozy

• Wartość przyłożonego napięcia

• Skład nukleotydowy i temperatura

• Obecność barwników interkalacyjnych

• Skład buforu do elektroforezy (siła jonowa)

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy

Końce DNA nie są takie same: koniec 3` - OH<sup>-</sup> ; koniec 5` - PO₃⁺

Nici dupleksu są przeciwstawne ale komplementarne. Nici DNA mogą denaturować i ponownie łączyć się (renaturacja).

Replikacja DNA in vivo wymaga wielu enzymów. Denaturacja nici; synteza starterów (fragmenty Okazaki); synteza nowego dupleksu DNA.

Synteza DNA in vitro wymaga jednego enzymu

• denaturacja DNA przez podgrzanie

• chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy DNA (primery, startery)

• dNTPs (wolne nukleotydy)

• synteza DNA odbywa się w kierunku 5` - 3`

• wymagany wolny koniec 3`-OH

• polimeraza Taq DNA - enzym

Polimeraz Taq

• nie jest niszczona w temperaturze 95^oC

• stabilność termiczna

• optimum działania w temperaturze 72^oC

• do swej aktywności wymaga jonów Mg w postaci MgCl₂

PCR co to jest?

Reakcja łańcuchowa polimerazy - umożliwiająca amplifikację specyficznych sekwencji DNA w warunkach in vitro.

Po raz pierwszy opublikowana w Science przez Saiki i wsp. w 1985.

Średnia długość amplifikowanych odcinków - to 5 kb modyfikacje umożliwiają amplifikację fragmentów do 40 kb.

Standardowy program PCR (dla produktów o długości 0,1 - 3 kb)

RAPD - przypadkowo amplifikowane polimorficzne DNA

• Analiza produktów PCR na drodze elektroforezy agarazowej.

• Nie jest wymagana uprzednia znajomość sekwencji, startery o przypadkowej sekwencji.

• Jednoczesna analiza 3-10 miejsc w genomie (tyle samo produktów/1 starter)

• Łatwa w wykonaniu i stosunkowo niedroga

• Startery do RAPD: jeden na jedną reakcję, krótki: 9-10 nukleotydów, arbitralny

- wiąże się do wielu miejsc w genomie dają 3-10 produktów amplifikacji,

- o długości do kilku tys. par zasad.

SSR - mikrosatelity, markery mikrosatelitarne, SSR

• Sekwencje mikrosatelitarne zamplifikowane w reakcji PCR, startery projektuje się na podstawie unikalnych sekwencji flankujących mikrosatelity

• Powtórzenie typu: (AT)_n, (A)_n(T)_n, (AG)_n(CT)_n, (GAA)_n, itp.

• Amplifikacja PCR regionu powtórzeń

• Rozdział w żelu poliakrylamidowy

• Wybarwienie DNA azotanem srebra

RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

• Fragmenty restrykcyjne powstają gdy na cząsteczkę działa nukleaza, która rozpoznaje specyficzne sekwencje

• Trawienie restrykcyjne określonej cząsteczki DNA powinno dawać ten sam zbiór fragmentów

• W przypadku genomowego DNA niektóre miejsca restrykcyjne są polimorficzne i występują jako dwa allele np..:

A - ma sekwencje rozpoznawaną przez enzym

a - ma zmienioną sekwencję nie rozpoznawaną przez enzym

AFLP - polimorfizm amplifikowanych fragmentów restrykcyjnych

• Polimorfizm oparty o pojawienie się lub utratę miejsc restrykcyjnych lub selektywnych nukleotydów

• Technicznie skomplikowane i stosunkowo drogie

• Znacznie bardziej informatywne niż RAPD

• Nie wymagają uprzedniej znajomości sekwencji

• Jednoczesna analiza śr 100 miejsc w genomie = prążków

Porównanie metod

Markery molekularne nie są jednakowe.

Żaden nie jest idealny.

W zależności od celu, jedne są lepsze od innych.

Są one o wiele korzystniejsze przy mapowaniu od markerów morfologicznych.

Zalety	Wady
RFLP
Wysoce polimorficzny Można określić wiele loci Kodominujące Sekwencje specyficzne	Pracochłonność Czasochłonność Wysokie koszty Zazwyczaj użycie izotopu
RAPD
Szybki, prosty, tani Wiele loci można szybko analizować Możliwość automatyzacji	Wyniki nie zawsze powtarzalne
AFLP
Wiele loci można szybko określić Możliwość automatyzacji Tylko niewielka ilość DNA jest potrzebna Wyniki są bardziej wiarygodne niż przy RAPD	Pracochłonność i czasochłonność-umiarkowana Koszty - pośrednie między RFLP a RAPC Zazwyczaj użycie izotopu Wyniki nie zawsze powtarzalne Potrzebne są żele wysokiej rozdzielczości
SSR
Obfitość Bardzo wysoki polimorfizm Są multialleliczne Kodominujące Sekwencje specyficzne Prosta i szybka detekcja Wykorzystująca technikę PCR powtarzalność	Stworzenie systemu markerów mikrosatelitarnych jest kosztowna, praco- i czasochłonna (wymagana jest znajomość sekwencji) Potrzebne są żele wysokiej rozdielczości

Biologia systemowa (System biology) - zmiana sposobu myślenia, odejście od badania funkcji pojedynczych genów w stronę badania (prawie) wszystkich genów jednocześnie przy użyciu wielu nowoczesnych metod.

Genomika - nauka zajmująca się wszystkimi genami w organizmie czyli genomem. Nauka o strukturze, zawartości funkcji i ewolucji genomu.

Transkryptomika - nauka zajmująca się wszystkimi rodzajami cząsteczek RNA transkryptowanymi przez komórki.

Proteomika - nauka o wszystkich białkach tworzonych w komórce oraz interakcjach białko-białko, białko-molekuły.

Metabolomika - nauka o wszystkich metabolitach tworzonych w komórce.

Masowe badanie genów i ekspresji na 3 poziomach:

Cel: charakterystyka funkcji wszystkich genów i ich wzajemne oddziaływanie:

- jednoczesny pomiar poziomu ekspresji tysiąca genów

- znaczna ilość wyników po każdym eksperymencie

- integracja wyników.

Zastosowanie analiz genów i profili transkrypcyjnych

Monitorowanie ekspresji genów, pozwala na określenie ich funkcji w komórkach oraz:

- identyfikacja funkcji genów

- identyfikacja nowych genów

- diagnostyka

- badanie sieci powiązań pomiędzy genami

- analiza wariantów DNA.

Dlaczego warto mierzyć poziom ekspresji genów, białek i metabolitów?

1. Biochemiczny fenotyp tkanki lub komórki

2. Odpowiedź rośliny na zmiany środowiska, np. rytm dzienny syntezy skrobi i jej rozpadu

3. Monitorowanie i próba ustalenia funkcji genów

4. Bezpośrednie zastosowanie w biotechnologii, np. oznaczanie składników ważnych farmakologicznie, w żywieniu człowieka (ProVita, „golden rice” lub niektóre aminokwasy) oraz w przemyśle (skrobia, „naturalny” plastik).

Kontekst genomiczny:

• Globalna charakterystyka transkryptów, białek i metabolitów

• Identyfikacja kluczowych elementów szlaków metabolicznych

• Badanie funkcji genów

• Poziom transkryptów, białek, metabolitów zmienia się w sposób dynamiczny (jeśli wszystkie metabolity byłyby na wysokim poziomie to nie starczyłoby miejsca w komórce)

• Powstawanie i degradacje małych cząsteczek jest bardzo dynamiczna w czasie

Podstawowe zastosowanie markerów molekularnych w badaniach genetycznych, programach hodowlanych

Tworzenie i wysycanie map genetycznych różnych gatunków roślin:

• praktyczne wykorzystanie markerów genetycznych wymaga znajomości ich dystrybucji w genomie, a więc ich kolejności ułożenia na chromosomach wraz ze względnymi odległościami dzielącymi poszczególne loci markera, co zapewniają wysoce kompletne i równomierne nasycone markerami mapy genetyczne

• Markery molekularne są wykorzystywane jako bardzo dogodne narzędzie do sporządzania samoistnych map genetycznych i wysycania zintegrowanych map genetycznych (zawierających loci klasyczne - morfologiczne oraz loci markerów izoenzymatycznych i loci markerów DNA)

• opracowanie map genetycznych odbywa się w oparciu o zapoczątkowaną przez T. Morgana (1920) analizę sprzężeń. Sprzężenia to utrwalone kombinacje alleli w chromosomach, które odzwierciedlają gamety rodzicielskie. Sprzężenia mają zwykle charakter częściowy i z określoną, stałą dla danej pary loci częstością wytwarzane są gamety o innych jak u form rodzicielskich układzie alleli na chromosomach - rekombinacja genetyczna będąca wynikiem crossin over między chromatydami chromosomów homologicznych. Częstość crossing over między dwoma punktami chromosomów homologicznych jest proporcjonalna do odległości dzielącej te punkty - 1% crossing over = 1 cM.

• Mapy takie powstają na podstawie analizy populacji segregującej uzyskanych w wyniku przekrzyżowania form polimorficznych pod względem mapowanych cech (fragmenty DNA - prążki na żelu) - strategie z wykorzystaniem: (1) pokolenie F2 ewentualnie F1 uzyskane w wyniku samozapylenia F1, (2) pokolenie Bc1 powstałe z przekrzyżowania F1 z jedną z form rodzicielskich, (3) zrekombinowane linie wsobne RIL3 (recombinant inbred lines) powstałe w wyniku kilkukrotnego samozapylenia poszczególnych osobników pokolenia F2, (4) linii podwojonych haploidów (DH) uzyskanych w wyniku kultur mikrospor pokoleniaF1.

• Informatywność mapy genetycznej jest zależna od stopnia i równomierności jej wysycenia przez loci markerów genetycznych

• Możliwość generowania ogromnej ilości markerów molekularnych zrodziła konieczność automatyzacji procesu mapowania. Obliczanie częstości rekombinacji, odległości mapowych, określenie grup sprzężeń i ułożenia loci są wykonywane przy użyciu specjalnych pakietów oprogramowania komputerowego.

Tworzenie populacji RIL:

• W wyniku tego krzyżowania otrzymano zrekombinowane linie wsobne (RIL), które różnią się pomiędzy sobą, a nie ma zróżnicowania wewnątrz tych linii (każda linia ma po 5 osobników)

Główne zalety markerów molekularnych:

• Eliminacja maskującego różnice genetyczne wpływu środowiska

• Ułatwienie pracochłonnej selekcji cech ilościowych (biomatrycznych)

• Umożliwienie selekcji w stadium siewki cech ujawniających się w późniejszych fazach rozwoju roślin, eliminacja niepożądanych pojedynków, obniżenie kosztów programów hodowlanych

• Możliwość skutecznej selekcji roślin rosnących w warunkach nietypowych, np. w fitotronie, w szklarni w okresie zimowym

• Uniezależnienie się w hodowli odpornościowej od pracochłonnych, zawodnych i kosztownych testów

Główne zastosowania:

• Badania filogenetyczne - określenie pokrewieństwa między gatunkami, formami uprawnymi i dzikimi, porządkowanie systematyki i weryfikacji poglądów na ewolucję gatunków

• Konstruowanie map genetycznych gatunków

• Określanie czystości odmianowej nasion

• Określanie czystości odmianowej gatunków rozmnażanych wegetatywnie

• Identyfikacja odmian przy ochronie praw autorskich (metryczki DNA)

• Identyfikacja linii hodowlanych, rodów

• Przewidywanie trudności przy krzyżowaniu oddalonym na podstawie wykrytego dystansu genetycznego, identyfikacja produktów somatycznej hybrydyzacji (heterokariantów)

• Identyfikacja ras patogenów grzybowych, szczepów bakterii oraz gatunków i podtypów różnych szkodników.

Biotechnologia - ćwiczenia 2010/2011

10

---