Agnieszka Filemonowicz, 172332

Beata Korkuś, 172648

Grupa: II, piątek 8:15

Data zajęć: 11.03.2011r., 18.03.2011r.

Prowadzący kurs: mgr M. Kozłowska

Sprawozdanie z Laboratorium Inżynierii Genetycznej

Ćwiczenie nr II i III

• Cel ćwiczenia:

- Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania - trawienie wektora enzymem restrykcyjnym BamHI

- Analiza elektroforetyczna wektora pGEX-2T trawionego enzymem BamHI

- Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania - defosforylacja plazmidu zlinearyzowanego enzymem restrykcyjnym BamHI.

- Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania - elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu.

- Elucja DNA z żelu agarozowego (metoda Gel - Out^®)

• Metodyka:

1. Przygotowano reakcję na 1 trawienie:

2 μl pGEX-2T (2 μg)

1 μl BamHI (10 U/ μl, MBI Fermentas)

1,5 μl buforu BamHI⁺ ( 10x, MBI Fermentas )

10,5 μl H₂O_{miliQ auto}

= 15 μl

2. Przygotowano próbkę:

2 μl pGEX-2T (2 μg plazmidowego DNA )

13 μl MIX

= 15 μl

3. Przygotowano MIX:

7 μl BamHI (10 U/ μl)

10,5 μl buforu BamHI⁺ (10x)

73,5 μl H₂O_{miliQ auto}

= 91μl

4. Przygotowano 1 kontrolę dla wszystkich grup:

2 μl pGEX-2T (2 μg plazmidowego DNA)

1,5 μl buforu BamHI⁺ (10x)

11,5 μl H₂O_{miliQ auto}

= 15 μl

Przy przygotowywaniu wyżej wymienionych mieszanin składniki dodawano w kolejności od największej do najmniejszej objętości.

5. Plazmidowe DNA poddano trawieniu przez 1h w temperaturze 37ºC.

6. Przygotowano próbki wektora pGEX-2T do elektroforezy:

2 μl mieszaniny po trawieniu wektora pGEX-2T

8 μl TE

2 μl 5x bufor do próbek (6 x SB)

= 12 μl

7. Przygotowano kontrolę (K):

2 μl próbki kontrolnej

8 μl TE

2 μl 6 x SB

= 12 μl

8. Strawione DNA plazmidu pGEX-2T poddano elektroforezie w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, przygotowanym w buforze 1xTBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,4 μg/ml. Wymiary żelu wynoszą 81x56x3 mm.

Na żel agarozowy naniesiono 5 μl markera wagowego FastRuller^TM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas), 12 μl próbki kontrolnej oraz po 12 μl każdej z przygotowanych próbek trawionego wektora pGEX-2T. Elektroforezę przeprowadzono w aparacie BIO-RAD w buforze 1xTBE, przy stałym napięciu 70V.

Żel analizowano w świetle UV (254 nm).

9. Rozcieńczono bufor BamHI⁺:

5 μl 10x buforu BamHI⁺

45 μl H₂O_{miliQ auto}

= 50 μl

10. Przygotowano roztwór do defosforylacji:

13 μl mieszaniny po trawieniu pGEX-2T

6 μl buforu BamHI⁺ (1x)

1 μl fosfatazy alkalicznej

~20 μl

11. Plazmid pGEX-2T zlinearyzowany enzymem restrykcyjnym BamHI poddano defosforylacji na końcu 5' fosfatazą alkaliczną z krewetek (SAP):

do 13 μl mieszaniny reakcyjnej pozostałej po trawieniu plazmidu i jego analizie elektroforetycznej dodano 6 μl 1x buforu BamHI⁺ i 1 μl enzymu. Trawienie prowadzono w objętości końcowej 20 μl przez 1h, w temperaturze 37ºC. Po zakończeniu defosforylacji do mieszaniny reakcyjnen dodano 5 μl buforu do nanoszenia próbek na żel agarozowy (6 x SB).

12. Przygotowano próbkę do naniesienia na żel preparatywny:

20 μl mieszaniny po defosforylacji

5 μl 6 x bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy (6 x SB )

= 25 μl

13. Zlinearyzowane i defosforylowane DNA plazmidu pGEX-2T poddano horyzontalnej elektroforezie preparatywnej w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, przygotowanym w 1x TBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,4 μg/ml. Wymiary żelu wynoszą 72 x 85 x 5 mm. Na żel agarozowy naniesiono 7 μl markera wagowego FastRuller^TM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas) oraz po 25 μl każdej z przygotowanych próbek defosforylowanego wektora pGEX-2T. Elektroforezę prowadzono w aparacie BIO-RAD w buforze 1xTBE, przy stałym napięciu 92V, przez 32 minuty (10 minut w suszy, 22 minuty w dobrych warunkach). Żel analizowano w świetle UV (365 nm).

14. Po zlokalizowaniu na żelu agarozowym w świetle UV pasma, odpowiadającego fragmentowi DNA o odpowiedniej długości wycięto skalpelem z żelu pojedynczy pasek DNA i przeniesiono go do wcześniej zważonej i opisanej probówki Eppendorfa, a następnie zważono na wadze analitycznej i zanotowano masę netto wyciętego fragmentu żelu.

15. Do wyciętego skrawka agarozy dodano 400 μl roztworu R7S.

16. Zawartość probówki wymieszano i inkubowano w termomikserze Eppendorf w temperaturze 50ºC, przy obrotach równych 500 rpm, do momentu rozpuszczenia agarowy (około 5 minut). W czasie rozpuszczania agarozy mieszano od czasu do czasu bardzo delikatnie zawartość probówki tak, aby ułatwić proces rozpuszczania.

17. Następnie dodano 200 μl izopropanolu i dokładnie wymieszano.

18. Mieszaninę krótko odwirowano w celu usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki.

19. Otrzymaną mieszaninę naniesiono na kolumnę do oczyszczania DNA, a następnie całość wirowano około 30 sekund przy około 10 000 x g.

20. Wyjęto kolumnę z probówki, przesącz przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa, a kolumnę ponownie włożono do probówki. Na złoże w kolumnie nałożono 600 μl roztworu A1 do płukania.

21. Wirowano około 30 sekund przy około 10 000 x g.

22. Wyjęto kolumnę z probówki, przesącz odrzucono, a kolumnę ponownie włożono do probówki. Na złoże w kolumnie nałożono 300 μl roztworu A1 do płukania.

23. Wirowano około 2 minuty przy około 10 000 x g.

24. Kolumnę wyjęto z probówki, przesącz odrzucono, a kolumnę ponownie włożono do probówki. W celu osuszenia złoża, kolumnę z probówką inkubowano około 3 minut w temperaturze pokojowej.

25. W celu elucji DNA, osuszoną kolumnę umieszczono w pustej, podpisanej probówce Eppendorfa i na kolumnę nałożono 25 μl buforu TE tak, aby całkowicie pokryć złoże.

26. Pozostawiono kolumnę na około 3 minuty w temperaturze pokojowej.

27. Wirowano 1 minutę przy około 10 000 x g.

28. Otrzymany przesącz zawierający zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T przechowywano w temperaturze -20ºC.

• Wyniki:

• Elektroforeza analityczna w żelu agarozowym:

M K 1 2 3 4 5 6




M - marker

K - kontrola

1 - 6 - numery poszczególnych próbek trawionego wektora pGEX-2T

2. Elektroforeza preparatywna:

	MASA [g]
Próbka	0,960
DNA	0,111

• Wnioski:

W buforze 6 x SB znajduje się m.in. 20% fikol 400, który służy do zagęszczenia próbki.

Żel

1. Elektroforeza analityczna:

Pasmo kontroli (K) po rozdziale elektroforetycznym umiejscowiło się poniżej pasm odpowiadających poszczególnym próbkom, ponieważ kontrola zawiera wyłącznie koliste DNA, natomiast próbki (1-6) zawierają liniowe DNA. Migracja kontroli (kolistego DNA) w żelu agarozowym jest szybsza od migracji próbek (liniowe DNA).

Liniowość DNA wynika z faktu, że zostało ono wcześniej poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymem BamHI, który tnie DNA w jednym miejscu, w związku z czym otrzymujemy po jednym pasmie z każdej próbki.

Porównując pasmo markera, kontroli i poszczególnych próbek możemy stwierdzić, że cięcie restrykcyjne oraz elektroforeza przebiegły pomyślnie - DNA zostało przecięte według założenia.

2. Elektroforeza preparatywna nie przebiegła do końca pomyślnie. Powodem tego był fakt, że początkowo zalano żel zbyt małą ilością buforu, w wyniku czego żel był za suchy, bufor nie dostał się do studzienek, elektroforeza nie postępowała i nastąpiła częściowa utrata DNA. Czas trwania błędnie prowadzonej elektroforezy wynosił 10 minut. Następnie żel ponownie polano dodatkową ilością buforu, dzięki czemu warunku prowadzonej elektroforezy uległy polepszeniu. W prawidłowych warunkach elektroforeza przebiegała 22 minuty. Skutkiem wyżej opisanego błędu była mniejsza niż przypuszczalna masa DNA wyciętego z żelu. W związku ze zmniejszoną masą DNA na kolumnę nałożono 25 μl buforu TE zamiast podanej w instrukcji wartości

30 μl.

Żel analizowano w świetle UV przy długości fali równej 365 nm, aby badane przez nas DNA pozostało w formie nienaruszonej.

W doświadczeniu użyto:

- roztwór R7S - rozpuszcza agarozę oraz przygotowuje DNA do związania z kolumną,

- izopropanol - strąca DNA i zmniejsza jego rozpuszczalność,

- roztwór A1 - zawiera rozpuszczalniki organiczne; przepłukuje DNA.

---