. GENY: REPLIKACJA I EKSPRESJA

PODRĘCZNIKI

Piśmiennictwo obowiązkowe:

Lubert Stryer „BIOCHEMIA”PWN, Warszawa, 2000.

R.K.Murray, D.K.Granner, P.A.Mayes, V.W.Rodwall

„Biochemia Harpera”, PZWL, Warszawa 2002.

Piśmiennictwo zalecane:

Thomas M.Devlin „Biochemistry with Clinical Correlations”,

Willey-Liss, New York, 2002.

V.L.Davidson, D.B. Sittman “Biochemia”

Urban & Partner , Wrocław 2002.

S.Angielski, Z.Jakubowski, M.H.Dominiczak

„Biochemia kliniczna”, PERSEUSZ, Sopot, 1997.

D.L.Nelson., M.M.Cox., “Lehninger Principles of Biochemistry”

Worty Publishers, New York, 2000.

L.Baynes., M.Dominiczak, „Medical Biochemistry”

Mosby, London Edinburg, 1999.

C.K. Mathews., K.E.van Holde., K.G.Ahern, “Biochemistry”

Addison Wesley Longman, Inc.2000.

P.N. Cambell., A.D.Smith, “Biochemistry”

Harcourt Publishers Limited, 2000.

P.N. Cambell., A.D.Smith, “Biochemistry Illustrated”

Churchill Livingstone, 2000.

M.L.Bishop., J.L.Duben-Engerlkirk., E.P.Fody,

“Clinical Chemistry”, Lippincott Williams&Wilkins, 2000.

Czasopisma

„Postępy Biochemii”- kwartalnik wydawany przez KBN.

Monografie Polskiego Towarzystwa Biochemicznego.

„Świat Nauki”(SCIENTIFIC AMERICAN), Prószyński i S-ka

Rok akademicki 2002/2003

Definicja:

BIOCHEMIA -

BADANIE MOLEKULARNYCH FORM ŻYCIA

(?) - Dlaczego jest tak wielkie zainteresowanie

tą dziedziną nauki na całym świecie ?

Stwierdzono, że różne przejawy życia opierają się na wspólnych podstawach molekularnych;

- wytwarzanie ATP

- jednakowe elementy konstrukcyjne

- identyczny przepływ informacji genetycznej

od DNA przez RNA do białka.

2

Poznano mechanizmy procesów metabolicznych

- do wybitnych osiągnięć biochemii należy;

- rozwikłanie głównych szlaków metabolicznych,

- określenie struktury i funkcji wielu białek,

- uzyskanie informacji o molekularnych

mechanizmach i strukturach:

- magazynujących energię,

- wykrywających sygnały,

- przetwarzających informację,

- odkrycie struktury DNA,

- wyjaśnienie przepływu informacji od genu

do białka,

- rozwój rekombinacyjnej technologii DNA

(genom).

Rozwiązywanie najbardziej złożonych problemów biologii i medycyny

• jaki jest mechanizm kontroli wzrostu komórek?

• w jaki sposób komórki tworzą złożony narząd?

• jaki jest molekularny mechanizm pamięci?

• jakie są molekularne podstawy zaburzeń umysłowych?

• jakie są przyczyny raka?

(?) Jaki wpływ na medycynę ma

biochemia

• wyjaśniono podstawy molekularne wielu chorób genetycznych

• wprowadzono skuteczne metody leczenia:

• sondy DNA do diagnozowania chorób

- dziedzicznych

- infekcyjnych

- nowotworowych

• metody inżynierii genetycznej

1. produkcja insuliny,

2. hormonu wzrostu

3. stymulatory rozwoju komórek

krwi,

4. racjonalne opracowywanie

nowych leków

Molekularne mechanizmy

procesów biologicznych o fundamentalnym znaczeniu wyjaśniamy na podstawie

- chemii białek

- biologii strukturalnej

- rekombinacyjnej technologii DNA

zmieniła biochemię;

- klonowanie i sekwencjonowanie

milionów zasad,

- genom

integracja genetyki molekularnej i chemii białek.

5

I Z O E N Z Y M Y ( I Z O Z Y M Y )

Def: FORMY ENZYMÓW WYWODZĄCE SIĘ

Z GENETYCZNIE UWARUNKOWANYCH

RÓŻNIC W BUDOWIE I - RZĘDOWEJ.

Katalizują ten sam proces, różnią się:

1. Ruchliwością elektroforetyczną,

2. Powinowactwem do substratu i kofaktorów,

3. Lokalizacją w organiżmie,

4. Właściwościami immunologicznymi,

5. Wpływem temp., pH, hormonów, i in.

PODZIAŁ IZOENZYMÓW

I. TKANKOWE ( narządowe),

II. KOMÓRKOWE ( w mitochondriach i cytoplażmie )

III. ROZWOJOWE (płód, osobnik dojrzały)

6

LDH - DEHYDROGENAZA MLECZANOWA

GLUKOZA K GLUKOZA

6-P GLUKONEOGENEZA R GLIKOLIZA 2P

Cykl

Corich PIROGRONIAN E PIROGRONIAN

MLECZAN W MLECZAN

W WĄTROBIE W MIĘŚNIACH

LDH - tertramer ( 4 monomery, c.cz. 35kD)

2 rodzaje łańcuchów polipeptydowych:

H - (ang. heart - serce) -duże powinowactwo do mleczanu

pH 7.0-7.3

M - (ang. muscle - mięśnie) -małe powinowactwo do pirogro-

nianu, pH < 7 (kwaśne)

Tworzą 5 rodzajów tetramerów - izoenzymy

H H M H M H M M

mięsień mięśnie

serca, wątroba hybrydy szkieletowe

Reakcja:

COO LDH COO

C=O + NADH + H H-C-OH + NAD

CH CH

pirogronian mleczan

7

c.d. Izoenzymy

- KWAŚNE (FK)

FOSFATAZY:

- ALKALICZNE (FA)

1. FOSFATAZA ALKALICZNA (FA)

Formy w surowicy:

I. a. kostna

b. wątrobowo-żółciowa

II. c. jelitowa

III. d. łożyskowa

Diagnostyka (we krwi)

kostna - choroby kości

wątrobowa - żółtaczka zastoinowa

jelitowa - nowotwory,

choroby przewodu pokrmowego,

marskość wątroby

łożyskowa - wzrost akt. w 16-20 tyg. ciąży,

po porodzie spadek akt. w ciągu 3-6 dni.

2. FOSFATAZA KWAŚNA (FK)

a. z prostaty - winian

b. z erytrocytów - formaldehyd

Choroba nowotworowa - kiedy wzrasta aktywność

nie hamowana przez ww inhibitory.

8

c.d. Izoenzymy

A L D O L A Z A

IZOENZYMY - 3 typy:

A - MIĘŚNIE , krwinki czerwone, nerki

( tam, gdzie przebiega glikoliza)

B - WĄTROBA

(aktywniejszy w procesach anabolicznych,

tzw. syntezie glukozy)

60x I aktywniejszy od A w rozkładzie F-1P

(przemiana fruktozy)

Fruktozuria - nietolerancja fruktozy.

C - MÓZG, tkanka nerwowa, soczewka oka.

W rozwoju ontogenetycznym najwcześniejszą jest forma A,

w miarę rozwoju pojawia się w jelicie i wątrobie forma B

oraz w mózgu i soczewce oka forma C.

Nowotwory

Gen A w wątrobie jest represjonowany .

W nowotworach wątroby znika aldolaza B i jest tylko A, czyli wraca do formy płodowej, odzywa się gen A.

w płodzie : wyłącznie aldolaza A (tetramer),

- po 6 miesiącach A B,

- po urodzeniu B i ślady B A.

9

STRUKTURA I FUNKCJA BIAŁEK

B I A Ł K O (proteina), ( gr.proteinos) („pierwszorzędny”, o pierwszorzędnym znaczeniu)

- decydująca rola właściwie we wszystkich

procesach biologicznych.

Zakres pełnionych funkcji:

1. KATALIZA ENZYMATYCZNA

Enzymy ( E )- prawie wszystkie są białkami

Odkrycie katalitycznej aktywności RNA pozwala nam wyobrazić sobie świat, istniejący wcześnie

w ewolucji życia, przed pajawieniem się DNA

i białka).

- dotychczas w pełni scharakteryzowano kilka

tysięcy E ,

- b.silne katalizatory, przyspieszają V reakcji

przynajmniej milion razy,

10

2. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE

wielu małych cząsteczek i jonów zachodzi

z udziałem białek,

np.

a) Hb - przenosi tlen w krwinkach czerwonych,

Mioglobina - „ w mięśniach.

b.) Fe - w osoczu krwi;

- przenoszone jest przez transferynę,

- a w wątrobie przechowywane w kompleksie

z ferrytyną.

3. RUCH UPORZĄDKOWANY

Białkowe układy kurczliwe;

- skurcz mięśnia.

- poruszanie się plemników za pomocą wici,

- przemieszczanie się chromosomów podczas

mitozy, etc.

4.FUNKCJE MECHANICZNO-STRUKTURALNE

np. kolagen (białko fibrylarne) -

elastyczność mięśni i tkanki kostnej.

11

5. OCHRONA IMMUNOLOGICZNA

- przeciwciała - białka o dużej swoistości;

odgrywają istotną rolę w rozróżnieniu między

tym co własne i obce (wirusy, bakterie, etc.)

dla danego organizmu.

6. WYTWARZANIE I PRZEKAZYWANIE

IMPULSÓW NERWOWYCH.

Reakcje komórek nerwowych

na specyficzne bodżce przebiegają z udziałem białek receptorowych (np. rodopsyna- białko fotoreceptorowe, wyst. w komórkach pręcikowych siatkówki).

Acetylocholina - pobudza cz.receptorów odpowiedzialne za przenoszenie impulsów w synapsach, czyli połączeniach między komórkami nerwowymi.

12

7. KONTROLA WZROSTU I RÓŻNICOWANIA.

Białka kontrolują przepływ energii i materii

w komórkach.

Kontrola odpowiedniej kolejności ekspresji informacji genetycznej jest zasadniczym warunkiem uporządkowanego wzrostu i różnicowania komórek.

Istotnym elementem kontroli są:

- u bakterii;

- białka represorowe

- w organizmach wyższych;

- białkowe czynniki wzrostu.

W organizmach wielokomórkowych hormony koordynują aktywność różnych komórek.

- wiele hormonów to białka

(np. insulina, hormon tyreotropowy).

13

STRUKTURA I FUNKCJA BIAŁEK

Białka mają ściśle określone sekwencje aminokwasowe, zgodnie z zapisem genetycznym.

Łańcuch peptydowy

- 22AA - liczba kombinacji niewyobrażalna

Znamy pełne sekwencje AA ponad 10000 białek

Każde białko ma jedyną w swoim rodzaju, właściwą sobie sekwencję aminokwasów, która jest zdeterminowana genetycznie.

Sekwencja nukleotydów w DNA,

cząsteczce dziedziczności,określa komplementarną sekwencję nukleotydów w RNA,

która determinuje sekwencję AA w białku.

Każdy z 20 AA jest kodowany przez jedną lub więcej sekwencji trzech nukleotydów.

Mechanizm syntezy białek z aminokwasów, wchodzących w ich skład , jest wspólny dla wszystkich organizmów.

12

INSULINA

- hormon białkowy,

- pełną sekwencję określił F.Sanger w 1953r.

(Nobel-1958r.)

(?) narzędzia i metody

- Nagroda Nobla 1980r.

- z sekwencji nukleotydów w genach

- Berg - pionier inżynierii genetycznej,

- Gilbert - badanie struktury DNA,

dziedzicznośći,

- Sanger - (Cambridge, Anglia).

• Nagroda Nobla 1999r. z zakresu Medycyny Gunter Blobel - Rockeffeler Univ. , N.Y.

• Za „ odkrycie, iż białka maja wewnętrzne sygnały, które kierują ich transportem i lokalizacją w komórce”.

(?) Dlaczego oznaczanie sekwencji aminokwasowej białek jest ważne?

• wyjaśnienie mechanizmu ich działania;

zmieniając sekwencję białka o znanej strukturze, można uzyskać białko o nowych właściwościach, m.in. leki.

• analiza zależności pomiędzy sekwencją aminokwasów, a strukturą przestrzenną białka pozwala określić reguły rządzące fałdowaniem polipeptydów.

Sekwencja aminokwasów łączy

informację genetyczną (zapisaną w DNA) ze strukturą przestrzenną białka,

od której zależy jej funkcja biologiczna.

• w medycynie -

• zmiany sekwencji AA mogą być przyczyną nienormalnego funkcjonowania lub choroby organizmu,

• oznaczanie sekwencji jest niezbędne w

patologii molekularnej

np. zmiana tylko jednego AA ciężkie

choroby;

• anemia sierpowata,

• mukowiscydoza,

• sekwencje aminokwasowe dostarczają cennych informacji dotyczących ewolucji białek.

Paleontologia molekularna

- podobieństwa sekwencji występujące

tylko w białkach, wywodzących się ze

wspólnego pnia ewolucyjnego.

(?) Zasadnicze elementy tworzenia

i funkcjonowania białek

MODYFIKACJE:

W niektórych nowo powstałych łańcuchach polipeptydowych wiele aminokwasów ulega modyfikacjom umożliwiającym tym białkom pełnienie właściwej funkcji,

np.- acylowanie N-końcowego aminokwasu wielu

białek sprawia,że są one odporniejsze na rozkład.

- w nowo zsyntetyzowanym kolagenie

wiele reszt Pro ulega hydroksylacji do -OH-Pro;

gr.-OH stabilizują włókna kolagenu.

- szkorbut - ch.wywołana osłabieniem procesu

hydroksylacji kolagenu z powodu braku wit.C

- Y-karboksyglutaminian,

- potranslacyjnie modyfikowany AA

Wskutek niedoboru wit.K zachodzi

niedostateczna karboksylacja Gln

w protrombinie(białko krzepnięcia krwi)-krwotok!

16

- większość białek wydzielanych przez komórki, takich jak przeciwciała - zaw. gr.węglowodanowe na specyficznych resztach Asp.

- dodatkowe reszty cukrowe nadają białkom

charakter bardziej hydrofilowy.

- przyłączenie reszt kwasów tłuszczowych do

grupy alfa-aminowej lub hydrosulfidowej w

Cys zwiększa hydrofobowy charakter białka.

Wiele hormonów, np.adrenalina (epinefryna), zmienia akt. E przez stymulację fosforylacji

grup -OH Ser i Thr.Fosfoseryna i fosfotreonina to modyfikowane AA najczęściej występujące w białkach.

Czynniki wzrostu - aktywują fosforylację

-OH-Tyr, powst. fosfotyrozyna

Grupy fosforanowe w Ser,Thr,Tyr łatwo ulegają usunięciu, dzięki czemu funkcjonują jako odwracalne stymulatory w procesach regulacji komórkowej,

np. niektóre onkogeny (geny odpowiedzialne za powstawanie raka), powodują stymulację nadmiernej fosforylacji reszt Tyr w białkach kontrolujących proliferację komórek. 17

ROZCIĘCIE BIAŁEK

Wiele białek po zsyntetyzowaniu

ulega rozcięciu , np.

Enzymy trawienne-

- syntetyzowane w postaci nieaktywnych

prekursorów,

- które mogą być bezpiecznie przechowywane

w trzustce,

- po uwolnieniu ich do jelita są aktywowane

przez rozcięcie wiązania peptydowego.

W procesie krzepnięcia krwi

- rozpuszczalny fibrynogen zostaje zmieniony

w nierozpuszczalną fibrynę przez rozcięcie

wiązania peptydowego.

Wiele hormonów ,

- np. adrenokortykotropowy,

powst.z rozcięcia dużego białka prekursorowego

tzw. „molekularnego rogu obfitości”

18

Białka wirusa

- polio tworzą się w wyniku rozcięcia ogromnego

prekursora poliproteinowego.

- HIV-1, białka ludzkiego wirusa niedoboru

immunologicznego, wywołującego zespół

nabytego niedoboru odporności(AIDS) powst.

przez specyficzne rozcięcie długiego prekursora.

(chorych jest 30,5 mln osób na świecie-HPG-X3)

To tylko kilka przykładów modyfikacji

i rozcinania - zasadniczych elementów

tworzenia i funkcjonowania białek.

(?) Za co odpowiedzialne są te potranslacyjne

zmiany ?

- za precyzję oraz wszechstronność działania

białek i ich regulacji.

19

STRUKTURA BIAŁEK

W budowie białek wyróżnia się cztery poziomy ich struktury, ( struktura I-IV rzędowa), czyli cztery zasadnicze poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego.

Badania : - konformacji,

- funkcji,

- ewolucji

białek doprowadziły do wyróżnienia jeszcze dwu ważnych, dodatkowych poziomów ich organizacji

- naddrugorzędowa struktura

(np. motyw naz.jednostką)

- domeny

(zaw.100-400 AA,np.łańcuch polipeptydowy

przeciwciała, 25kD, jest pofałdowany w

4 domeny,b.podobne, co sugeruje, że

pojawiły się one w wyniku duplikacji

pierwotnego genu.

Analiza sekwencji genów i białek wykazała, że domeny białek są często kodowane przez części genów zw. eksonami.

Główna zasada biologii molekularnej:

- Sekwencja określa konformację. 20

STRUKTURA A FUNKCJA BIAŁEK

Białka:

MIOGLOBINA i HEMOGLOBINA

- są przenośnikami tlenu u kręgowców,

- stanowią doskonałą ilustrację wielu ważnych

zasad dotyczących konformacji białka, jego

dynamiki i funkcji.

MIOGLOBINA (mięśnie) - magazyn tlenu

(J.Kendrew, krystalografia Rtg.)

HEMOGLOBINA (erytrocyty)

- przenośnik tlenu we krwi,

- odgrywa decydującą rolę w transporcie CO i H

(M.Perutz)

21

MIOGLOBINA

- przenośnik tlenu w mięśniach

(ssaki nurkujące - wieloryb)

- zawiera HEM,

- pojedynczy łańcuch polipeptydowy(153 AA,18 kD)

- b.ściśle upakowana (4.5 x 3.5 x 2.5 nm),

- 8 odc.helisy (A,B,C...H) (70%), zagięcia - 4 Pro,

- wnętrze;- niemal wyłącznie AA niepolarne

(Leu,Wal,Met,Phe) - jedyne polarne to 2 His:

(F8-proksymalna, E7-dystalna nie wiąże się z gr.

hemową) w miejscu aktywnym wiązania tlenu.

- wyst. w 3 formach fizjologicznych:

Fe pozycja koordynacyjna

5 6

- nieutlenowanej(+2) His F8 wolna

- utlenowanej(+2) „ tlen

- żelazowej(ferri-)(+3) „ woda

- Środkowy ekson (kodujący reszty AA od 31

do 105; B12 do G6) w genie mioglobiny koduje

aminokwasy tworzące miejsce wiązania hemu. 22

HEMOGLOBINA

(Hb)- przenośnik tlenu wyst. w erytrocytach

Hemo- (przedr.z greckiego - „krew”)

Myo- ( „ - „mięsień”)

Globina- (białko z rodziny mioglobin

i hemoglobin)

Struktura przestrzenna - (Max Perutz w1959r.,

mapa gęstości elektronowej) - kula o śr.5,5 nm.

- 4 łańcuchy polipeptydowe , forma czworościanu,

- gr.hemowe w każdej podjednostce,

- w zagłębieniach na pow.

- 4 miejsca wiązania tlenu,

- znacznie od siebie oddalone

- odległość między dwoma najbliżej położonymi

Fe wynosi 2.5 nm.

- każdy łańcuch kontaktuje się z obydwoma ,

natomiast nieliczne są oddz. między dwoma

lub dwoma

- poznano sekwencję AA ponad 60 gatunków

(od minoga morskiego do człowieka) - istnieje 10

pozycji konserwatywnych, istotnych dla funkcji.

23

RODZAJE Hb

Hb A - u ludzi dorosłych (podstawowa Hb)

Hb A - „ ( 2% całej Hb)

Hb F - płodowa

zarodek: łańcuchy ( ) - odpowiadające łańc.

i „ ( ) - „

Łańcuchy - 141 AA

„ - 146 AA

Oddziaływania między podjednostkami Hb

mają decydujące znaczenie dla jej zdolności

do transportu w sposób sprzężony z warunkami fizjologicznymi.

(?)

- Dlaczego Hb składa się z wielu różnych

polipeptydów ?

- Jaka jest przyczyna ich różnorodności?

24

MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA

Struktura przestrzenna tych białek

(szczegółowo określona na poziomie atomowym) dostarcza wielu danych dotyczących:

- sposobu fałdowania białek,

- wiązania innych cząsteczek,

- integrowania informacji.

Wiązanie tlenu przez Hb regulują:

H ,CO i organiczne fosforany, wiążące się w rejonach oddalonych od miejsc wiązania tlenu.

Oddziaływania między przestrzennie oddalonymi miejscami w białku nazywamy allosterycznymi.

Hb jest najlepiej poznanym białkiem allosterycznym.

Oddziaływania allosteryczne umożliwiają Hb skoordynowany transport O , CO , H

25

W odróżnieniu od mioglobiny, Hb jest białkiem allosterycznym - różnice są następujące:

1. Wiązanie tlenu z Hb jest kooperatywne,

a z mioglobiną - niekooperatywne.

2. Powinowactwo Hb do tlenu zależy od pH,

natomiast powinowactwo mioglobiny do tlenu

nie zależy od pH.

3. Powinowactwo Hb do tlenu jest sterowane za

pomocą fosforanów organicznych,

np.2,3-bis-P-glicerynian(BPG)

Hemoglobina wykazuje mniejsze powinowactwo do tlenu niż mioglobina.

MIOBLOBINA i podjednostki HEMOGLOBINY

mają bardzo podobną strukturę przestrzenną pomimo, że ich sekwencje AA wykazują znaczne różnice (te same AA tylko w 24 pozycjach na141).

Bardzo różne sekwencje aminokwasowe mogą określać bardzo podobne struktury przestrzenne

26

Skomplikowane pofałdowanie łańcucha polipeptydowego, ujawnione po raz pierwszy dla mioglobiny, stanowi wyznacznik naturalnego, podstawowego modelu przenośnika tlenu; stwarza ono odpowiednie warunki dla grupy hemowej,umożliwiając odwracalne wiązanie tlenu.

HEM- gr.prostetyczna, nadaje mioglobinie i hemoglobinie charakterystyczne zabarwnienie.

Niepolarne otoczenie gr.hemowej ma decydujące znaczenie dla odwracalnego utlenowania.

27

(?) Dlaczego CO jest trucizną?

CO jest trucizną, ponieważ;

- łącząc się z nieutlenowaną Hb lub mioglobiną

hamuje transport tlenu

- powinowactwo wiązania CO jest ok.220 razy

większe niż dla tlenu;

- w roztworze wyizolowany HEM wiąże CO

ok.25000 razy silniej niż tlen.

(?) - W jaki sposób białka znoszą naturalną

dla HEM-u zdolność wiązania CO?.

Ilość endogennie syntetyzowanego CO jest taka,

że zajmuje ok.1% miejsc wiązania w mioglobinie i Hb, co stanowi tolerowany przez organizm poziom hamowania.

Obecność białka powoduje, że CO wiąże się pod kątem - ten nieliniowy układ przestrzenny

( ang. bent geometry ) w globinach osłabia oddziaływanie CO z hemem.

28

Formy Hb :

Fe(+2) - ferrohemoglobina (tylko ona wiąże tlen)

Fe(+3) - ferrihemoglobina (zw. methemoglobiną)

- analogiczne nazewnictwo dla mioglobiny

- wiązanie tlenu z Hb jest kooperatywne,

- kooperatywne wiązanie tlenu zwiększa

skuteczność Hb jako przenośnika tlenu

(ok.1,8razy większy w warunkach fizjologicznych,

w porównaniu z niezależnym układem).

- miarą kooperatywności jest współczynnik Hilla,

- mioglobina wykazuje większe powinowactwo do

O niż Hb,

- Hb płodu wykazuje większe powinowactwo do

tlenu niż Hb matki,

- krzywa dysocjacji tlenu dla mioglobiny

(hiperbola) a dla Hb (sigmoidalna).

29

- uwalnianie tlenu zwiększa powinowactwo miejsc

wiązania protonów (przy przejściu od Hb utleno-

wanej do nieutlenowanej His 146 ma większe

powinowactwo do H ).

- CO wiąże się z końcowymi grupami

aminowymi Hb i zmniejsza jej powinowactwo

do tlenu.

- związanie tlenu zmienia strukturę IV- rzędową,

przesuwając atom Fe w płaszczyznę porfiryny.

- utlenowanie prowadzi do znacznych zmian

w IV rzędowej strukturze Hb;

- nieutlenowana (formaT(ang.tense,taut-napięta)

- utlenowana (forma R(ang.relaxed-rozlużniona)

- BPG zmniejsza powinowactwo do tlenu przez

tworzenie wiążań poprzecznych w nieutleno-

wanej Hb.

(?) W jaki sposób Hb wiążąc kolejne cz.O

zmienia strukturę?

30

Modele oddziaływań allosterycznych:

- sekwencyjny (Koshlanda)- zmiana konformacji

zachodzi kolejno w różnych podjednostkach,

- jednoprzejściowy,

model MWC (Monod, Wyman, Changeux)

- zmiana konformacji zachodzi równocześnie

we wszystkich podjednostkach.

Te dwa modele proponują przeciwstawne wyjaś-nienie przebiegu oddziaływań kooperatywnych

W przypadku Hb rzeczywisty model allosteryczny jest bardziej złożony, niż wynika to z prostego modelu sekwencyjnego lub modelu jednoprzejściowego.

Poszczególne ligandy O , H , CO , BPG mają odrębne miejsca wiązania. We współdziałaniu pomiędzy poszczególnymi miejscami wiązania pośredniczą zmiany w IV-rz.strukturze.

W ewolucyjnym przejściu od mioglobiny do Hb obserwujemy pojawienie się makrocząsteczki zdolnej do odbioru informacji ze swojego środowiska.

31

Badanie hemoglobin pacjentów z objawami hematologicznymi oraz zwykłych populacji doprowadziły do odkrycia kilkuset mutantów hemoglobin.

Patologia molekularna Hb:

- większość nieprawidłowych Hb nie niesie ze

sobą nowych wartości selekcyjnych; są one

neutralne lub szkodliwe.

- istnieje kilka rodzajów nieprawidłowej Hb:

1. zmieniona powierzchnia

(prawie wszystkie są nieszkodliwe;

wyjątek - HbS).

2. zmienione miejsce aktywne

(wadliwa podjednostka nie wiąże tlenu,

np.HbM - sinica).

3. zmieniona III-rz.struktura

(np. Hb Riverdale-Bronx;

zamiast Gly w poz.B6 jest Arg)

4. zmieniona IV-rz.struktura

(nieprawidłowe powinowactwo do tlenu,

utrata właściwości allosterycznych). 32

Patologia molekularna Hb - wywołana mutacją zmiana pojedynczego aminokwasu(HbS,łańcuch w poz.6 - Val) jest przyczyną choroby zwanej

niedokrwistością sierpowatą

- najlepiej poznanym, przekazywanym genetycznie schorzeniem molekularnym.

Talasemia - ( gr.thalassa-”morze” szeroki zasięg ok.20% u osób zamieszkujących basen Morza Śródziemnego) jest to genetyczne zaburzenia syntezy jednego lub obu łańcuchów Hb, brak lub niedobór łańcucha globinowego z powodu:

1. delecji genu

2. uszkodzenia syntezy lub dojrzewania RNA

3. globinowy mRNA powstaje w normalnych

ilościach, ale koduje całkowicie nieprawidłowe

białko.

33

SKUTKI ODKRYCIA

SCHORZEŃ MOLEKULARNYCH

Opisanie mutacji Hb wywarło olbrzymi wpływ na:

- biologię molekularną

- medycynę

- genetykę

1. Opisanie mutacji umożliwiło wyjaśnienie

zależności struktury i funkcji Hb;

- mutacje jednego AA-

to wysoce specyficzne modyfikacje

chemiczne występujące w naturze.

2. Jedno z podstawowych pojęć w medycynie to

schorzenie molekularne

- jego początek to odkrycie mutantów Hb.

3. Opisanie mutantów Hb pozwoliło na lepsze

zrozumienie procesów ewolucji - mutacje są

„surowcem” dla ewolucji

Badania niedokrwistości sierpowatej wykazały,

że mutacja może być jednocześnie korzystna

i szkodliwa dla organizmu.

34

BIOCHEMIA KRWI

BIAŁA OSOCZA I ICH ROLA

- Średnie stężenie białek w osoczu wynosi ok. 7 g/dl

- Funkcje białek osocza:

• Regulują ciśnienia osmotycznego

• Zapewniają właściwe rozmieszczenie wody między wnętrzem łożyska naczynia a tkankami pozanaczyniowymi

• Transportują substancji, także tych nierozpuszczalnych w wodzie

• Wiążą produkty rozpadu niektórych makrocząsteczek i przenoszą je do układu siateczkowo-śródbłonkowego, gdzie ulegają degradacji

• Transportują hormony, witaminy i inne ciała czynne

• Niektóre są naturalnymi inhibitorami enzymów proteolitycznych

• Immunoglobuliny biorą udział w odporności ustroju

• Zapewniają krzepliwość krwi

- większość białek osocza powstaje w wątrobie, dlatego większość chorób wątroby przebiega ze zmianami stężeń białek w osoczu

- wszystkie oprócz albumin to glikoproteiny

- rozdzielane są elektroforezą, wysalaniem, chromatografią jonowymienną

ALBUMINY

• Stanowi ok. 60% wszystkich białek osocza

• Wątroba produkuje 12g albumin / 24h

• Jest to białko globularne, o pojedynczym łańcuchu, nie zawiera kowalencyjnie związanych składników cukrowych

• Nie przenika przez nerki

• Obecna w płynie śródmiąższowym i chłonce

• Zapewnia ok. 80% ciśnienia onkotycznego osocza

• Wysokie stężenie albuminy w osoczu wymusza powrót wody do wnętrza łożyska

• Gdy stężenie albuminy zmniejszy się do wartości <2 g/dl, przeważa ciśnienie hydrostatyczne nad onkotycznym. Płyn przemieszcza się do przestrzeni śródmiąższowej - OBRZĘK

• Wiążą substancje drobnocząsteczkowe, np. kwasy tłuszczowe, tyroksyna, kortyzol, hem, bilirubina, jony np. Ca²⁺, substancje obce, leki

• Lek związany z albuminą jest nieczynny, dlatego zmniejszenie stężenia albuminy może spowodować większe działanie leku

• Niedobór albuminy może powodować hiperkalcemię

• Wiążą wodę: 1g albuminy podany do krwi powoduje wzrost objętości osocza o 17Ml

GLOBULINY

• Są glikoproteinami, zawartości sukru jest różna, od kilku do 40%

1. α₁-globuliny

kwaśna glikoproteina (orozomukoid lub alfaseromukoid) - zawiera wysoki procent reszt cukrowych, inaktywuje progesteron

lipoproteina HDL₁ - transportuje fosfolipidy i cholesterol

haptoglobina - wiąże hemoglobinę uwalnianą z krwinek czerwonych w trakcie ich rozpadu. Kompleksy hemoglobina-haptoglobina są usuwane przez układ siateczkowo-śródbłonkowy

transkortyna - wiąże glukokortykoidy

2) α₂-globuliny

• ceruloplazmina - biało wiążące miedź. Ma właściwości oksydacyjne, utlenia fenole i polifenole, a także Fe²⁺ Fe³⁺

• α-makroglobulina - jest inhibitorem proteaz, przez co regulują proteolizę w krzepnięciu i fibrynolizie. Hamuje enzymy proteolityczne w procesach zapalnych. Ma najwyższą masę cząsteczkową. Wiąże się z protezami a powstały kompleks proteza - inhibitor fagocytują komórki ukł siateczkowo-śródbł.

• α₁ -antyproteaza - inaczej antytrypsyna. Inhibuje enzymy proteolityczne o centrach serynowych. (elastazę , kolagenozę). Wrodzony niedobór tego inhibitora nasila procesy proteolizy, powodując m.in. rozedmę płuc. Zawarta w wydzielinach dróg oddechowych, może być inaktywowana prze dym tytoniowy.

• Lipoproteina HDL₂

• Protrombina - białko jednołańcuchowe, hydroliza wiązań pep w nim zachodząca pod działaniem czynnika X uwalnia z niej trombinę.

3) pre-β-globuliny

• VLDL

4) β-globuliny

• Lipoproteina LDL

• Transferyna - przenosi żelazo w osoczu. Komórki szpiku kostnego mają na powierzchni receptory dla transferyny. W ten sposób żelazo niezbędne do syntezy hemoglobiny dostaje się do szpiku

• Plazminogen

• Fibrynogen - w krzepnięciu zmienia się w nierozpuszczalną fibrynę. Jego stężenie w osoczu 200-400 mg/dl. Zawiera 6 jednakowych podjednostek ułożonych parami. Każda połówka fibrynogenu zawiera łańcuch A, B, oraz gamma. Połówki zespolone sąwiązaniami disiarczkowymi.

5) gamma-globuliny

• Immunoglobuliny, pełnią funkcję odpornościową

• Mają po dwa łańcuchy ciężkie H i dwa lekkie L połączone mostkami siarczkowymi

• Zawierają też część cukrową

• W obu łańcuchach można wyróżnić część stałą C i część zmienną V. część zmienna znajduje się na N-końcu łańcucha , w domenie wiążącej antygen

• Wyróżniamy IgG, Iga, IgE, IgM, IgD

• Wiążą antygen, aktywują dopełniacz, pobudzają komórki tuczne do uwalniania histaminy

• Zawierają dwa regiony wiążące antygen, co ułatwia tworzenie wielkich agregatów, składających się na przemian z cząsteczek antygenu i przeciwciała. Duże agregaty są nierozpuszczalne

• Zjawisko precypitacji - reakcja rozpuszczalnego antygenu z rozpuszczalnym przeciwciałem - powstaje nierozpuszczalny produkt

• Jeżeli przeciwciało zawiera dwa miejsca wiążące, wiąże dwa antygeny zlokalizowane na różnych komórkach co powoduje ich sklejenie - aglutynację

• Niektóre immunoglobuliny występują w postaci oligomerów.

• Iga - we łzach, ślinie, mleku, śluzie oskrzelowym i jelitowym. Jest to imm. Sekrecyjna.

• IgG - przekracza barierę łożyskową. Ochrania płód przed zakażeniem

• IgE - uczestniczy w reakcjach alergicznych. Wiąże się z bazofilami i komórkami tucznymi, gdzie pełni funkcję receptora antygenowego. Związanie antygenu powoduje uwalnianie histaminy z tych komórek.

• IgM - pierwsza immunoglobulina pojawiająca się na powierzchni limfocytów B. ostatnią jest IgG, A lub E. limfocyty aktywują się gdy do immunogl przyłączy się antygen. Następnie dzielą się i wydzielają wytworzone przeciwciała. Nazywają się wtedy komórkami plazmatycznymi.

PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI

Hemostaza - proces zapobiegający utracie krwi z uszkodzonego naczynia

1. Adhezja płytek. Uszkodzenie śródbłonka powoduje, że płytki wiążą się ze składnikami tkanek - adhezja płytek. Pośredniczy tu czynnik von Hillebranda, białko występujące w osoczu i macierzy pozakomórkowej. Wiąże się zarówno z receptorem błonowym płytki i z włóknem kolagenowym tkanki.

2. Aktywacja płytek. Następuje przebudowa błon, przemieszczenie lipidów błonowych, odsłaniają się receptory fibrynogenu.

3. Agregacja płytek. Do receptorów na powierzchni płytek przyłącza się fibrynogen, którego cząsteczki sklejają płytki w agregaty płytkowe.

4. Uwalnianie. Zaktywowane płytki uwalniają przede wszystkim: ADP, ATP, serotoninę, jony Ca, trombosan, fibrynogen, czynnik von Hillebranda, czynnik XIII, płytkowy 4 oraz PDGF. Trombosan, serotonina i ADP pobudzają dalszą agregację. Czynniki krzepnięcia V, XIII i fibrynogen uczestniczą w tworzeniu skrzepu. PDGF pobudza podziały fibroblastów i syntezę składników macierzy pozakomórkowej przez te komórki, przyspieszają więc proces gojenia się rany.

5. Powstanie czopu płytkowego. Wystarcza on do zamknięcia drobnych uszkodzeń naczynia. Nie jest jednak wystarczający aby zatrzymać duże krwawienia.

6. Powstanie skrzepu fibrynowego. Substratem jest fibrynogen, ma duży wymiar podłużny a mały poprzeczny. Jest substratem dla proteazy serynowej - trombiny. Hydrolizuje ona 2 wiązania pep położone w pobliżu końców aminowych łańcuchów A i B. z łańcuchów A uwalnia sięfibrynopeptyd A a z łańcucha B - fibrynopeptyd B. są one nośnikami ładunków ujemnych. Pozostający trzon jest nazywany monomerem fibryny. Agregują one koniec do końca i bok do boku tworzą nierozpuszczalną fibrynę. Ma charakter żelu i nie hamuje skutecznie krwawienia.

7. Proces transglutaminacji. Poszczególne cząsteczki zespolone są słabymi wiązaniami wodorowymi. Dopiero stabilizacja fibryny nadaje jej sprężystość i wytrzymałość. Następuje tworzenie wiązań poprzecznych między cząsteczkami monomeru. Grupy amidowe reszt glutaminy wchodzą w reakcję grupami ε-aminowymi reszt lizyny sąsiedniego monomeru. Rozpada się wiązanie amidowe Gln, tworzy się amoniak a uwolniona grupa γ-karboksylowa reszty kwasu Glu wiąże się z grupą aminową reszty lizolowej sąsiedniego monomeru. Powstaje wiązanie amidowe między monomerami. Katalizuje to transglutaminaza osoczowa - czynnik XIII.

TROMBINA - powstaje z protrombiny, na powierzchni płytek, aktywowanej w czasie ich adhezji i agregacji. Generatorem trombiny jest czynnik X. powstaje z nieaktywnego zymogenu drogą proteolizy. Zachodzi to szlakiem wewnątrz lub zewnątrzpochodnym.

SZLAK WEWNĄTRZPOCHODNY - aktywacja przez kontakt

Kalikreina działa na czynnik XII, zamienia go na XIIa. Ten uwalnia kalikreinę z jej prekursora - prekalikreiny działając zwrotnie dodatnio. Czynnik XIIa aktywuje XI do XIa. Czynnik XIa aktywuje czynnik IX do IXa. Czynnik IXa aktywuje czynnik Xa. Ta reakcja wymaga obecności czynnika Viii.

SZLA KZEWNĄTRZPOCHODNY

Czynnik X jest aktywowany przez czynnik VIIa i czynnik tkankowy, które łączą się w kompleks pod wpływem uszkodzonego naczynia.

Dalsze etapy są wspólne. Czynnik Xa z układu wewn. aktywuje czynnik VII ukł zewnątrzpochodnego. Czynnik VIIa może aktywować czynnik IX.

REGULACJA PROCESU KRZEPNIĘCIA

• Proces krzepnięcia nie zachodzi w nieuszkodzonym naczyniu, ponieważ wytwarzanie czynnika XIa i działanie VIIa jest możliwe dopiero po kontakcie osocza ze składnikami tkanek podśródbłonkowych

• Większość czynników krzepnięcia jest inaktywowana przez antyproteazy: α₁-antyproteaza, α₂ -makroglobulina.

• Antytrombina III - inhibitor trombiny, jej aktywność zwiększają heparyna i siarczan heparanu. Siarczan występuje na powierzchni komórek śródbłonka, dlatego nieuszkodzony śródbłonek wzmaga antykoagulacyjne działanie antytrombiny. Reszty siarczanowe umożliwiają wiązanie antytrombiny. Kompleks heparyna-antytrombina wykazuje silne działanie antyproteolityczne, unieczynnia większość czynników krzepnięcia.

• Trombomodulina - działanie antykoagulacyjne, obecna na powierzchni nieuszkodzonego śródbłonka. Wiąże krążącą trombinę. Trombina w kompleksie z trombomoduliną traci swoją aktywność wobec fibrynogenu, czynników VII, V i XIII a zyskuje zdolność aktywacji białka C. aktywne białko C jest protezą o właściwościach antykoagulacyjnych. Degraduje czynniki Va i Viii

• Komórki śródbłonka wytwarzają prostacyklinę, która hamuje przyleganie płytek krwi do ściany naczynia i przeciwdziała ich agregacji.

FIBRYNOLIZA - ROZKŁAD SKRZEPU

Jest to proces proteolityczny

Główną proteazą jest plazmina, powstająca z plazminogenu. Plazminogen wiąże się z fibryną, następnie jest aktywowany przez tkankowy aktywator plazminogenu - tPA. Przechodzi on w plazminę także pod wpływem urokinazy, streptokinazy. Te związki stosuje się w leczeniu chorób zakrzepowych, np. świeżego zawału mięśnia sercowego.

ANTYKOAGULANTY

• Cytrynian, wersenian, szczawian - dodane do świeżej krwi powodują związanie jonów wapnia. Brak wapnia sprawia, że krew nie krzepnie. Jedynie cytrynian jest używany jako środek zapobiegający krzepnięciu krwi do przetoczenia.

• Heparyna - działa krótko lecz skutecznie. Stosowana w chorobach zakrzepowych. Nie wchłania się z przewodu, musi być podawana dożylnie.

• Pochodne kumaryny - warfaryna, dikumarol - nie hamują krzepnięcia In vivo lecz In vitro.

BIOCHEMIA TKANKI ŁĄCZNEJ

SKŁADNIKI TKANKI ŁĄCZNEJ, ICH BUDOWA I FUNKCJA

Tkanka łączna to: macierz międzykomórkowa, chrząstki, powłoki narządów, więzadła, ścięgna, skóra, kości.

Na tkankę łączną składają się jej komórki oraz macierz międzykomórkowa.

Komórki tkanki łącznej:

1. histiocyty

2. osteocyty

3. fibrocyty

4. i inne

Główne składniki macierzy międzykomórkowej to:

1. Białka strukturalne: kolagen, elastyna, fibrylna

2. Białka swoiste: fibrylina, fibronektyna, laminina

3. Proteoglikany

Proteoglikany.

• Powstają z przyłączenia do glikozaminoglikanu rdzenia białkowego

• Glikozaminoglikanami są: siarczan chondroityny, siarczan keratanu, siarczan heparanu czy dermatanu. Zbudowane są z powtarzających się jednostek disacharydowych gdzie jednym ze składników jest zawsze aminocukier a drugim kwas uronowy. Mogą mieć grupę siarczanową.

• Proteoglikany to: syndekan, dekorin, agrekan, betaglikan, perlekan

• Mają krótki łańcuch peptydowy połączony z licznymi długimi łańcuchami polisacharydowymi

• Proteoglikan powstały z siarczanu chondroityny to główny składnik chrząstki, kości, zębów. Budowa - GalNAc + Gulca. Siarczan chondroityny występuje w miejscach wapnienia w kościach.

• Siarczan dermatanu - IdUAGlcNAc - GalNAc. Występuje w skórze i rogówce i twardówce.

• Kwas hialuronowy - Gulca - GlcNAc. Nadaje żelowany charakter płynom oka i stawów. Chroni komórki przed bakteriami. Zatrzymuje wodę

• Mają ładunek ujemny i wiążą kationy

• Poszczególne cząsteczki proteoglikanów splatają się ze sobą, tworząc strukturę wzmacniającą włókna kolagenowe

• Zapewniają przezroczystość rogówce

• Dzięki siateczce, jaką tworzą, powstaje sito, co umożliwia selektywny transport do komórki i usuwanie ciał wielkocząsteczkowych

• Heparyna ma właściwości antykoagulacyjne

Fibrylina

• Glikoproteina

• Wydzielana przez fibroblasty i wbudowana do nierozpuszczalnych mikrofibryli które są rusztowaniem dla odkładającej się elastyny

• Mutacja genu fibrylny powoduje chorobę Marfana - następuje przemieszczenie soczewki, wysoki wzrost, długie palce, stawy o nadmiernej ruchomości, osłabienie układu sercowo - naczyniowego

Fibronektyna

• Glikoproteina

• W postaci rozpuszczalnej występuje w osoczu a w nierozpuszczalnej jako składnik macierzy pozakomórkowej

• Zawiera dwa identyczne łańcuchy połączone wiązaniami disiarczkowymi

• Zawiera fragment, który wiąże heparynę, włóknik, kolagen, DNA i powierzchnię komórek. Dlatego białko to należy do integryn. Odgrywa rolę w adhezji komórek

• Bierze udział w przemieszczaniu się komórek

Laminina

• Jest składnikiem błon podstawnych

• Ma miejsce wiążące kolagen IV, heparynę, integryny

• Kolagen łączy się z lamininą, która oddziałuje z integrynami lub białkami receptorowymi dla lamininy i przyłącza błonę podstawną komórek

Entaktyna

• Zwana nidogenem, glikoproteina zawierająca sekwencję RDG

• Wiąże się z lamininą, łączy się z komórkami

Kolagen

• Stanowi 25% wszystkich białek

• Jest ok. 19 typów

• Buduje chrząstki, skórę,, kości, włókna, ciało szkliste oka

• Ma budowę potrójnej helisy. W tropokolagenie każdy łańcuch to lewoskrętna helisa (3 reszty aminokwasowi na jeden skręt). Trzy takie łańcuchy tworzą prawoskrętną superhelisę. Co trzeci aminokwas to glicyna (Gly - X - Y). około 100 reszt X to prolina a ok. 100 reszt Y to hydroksyprolina.

• Tropokolagen - podstawowa jednostka strukturalna - może być homotrimerem lub heterotrimerem, tzn mieć dwie jednakowe podjednostki alfa1 a trzecią inną alfa2

• Niektóre fragmenty tropokolagenu mogą mieć budowę globularną

• Struktura potrójnen helisy nadaje kolagenowi właściwości giętkiego, nierozciągliwego pręta, i decyduje o jego odporności na działanie nieswoistych enzymów proteolitycznych. Trudno rozpuszcza się w wodzie

Synteza kolagenu

Kolagen syntetyzuje się z prokolagenu, który po przejściu do macierzy międzykomórkowej jest proteolitycznie przekształcany do kolagenu. Wewnątrz komórki następuje:

• Oderwanie peptydu sygnalnego

• Hydroksylacja reszt proliny w pozycji Y i niektórych reszt lizyny w pozycji Y

• Glikozylacja reszty Hliz

• Tworzenie między i wewnątrzłańcuchowych wiązań S-S przy peptydach końcowych

• Tworzenie potrójnej helisy - powstaje prokolagen

Etapy pozakomórkowe:

• Oderwanie N- i C-końcowych propeptydów od prokolagenu - powstaje tropokolagen

• Fibrogeneza - agregacja cząsteczek kolagenu z zachowaniem przesunięcia o ¼ długości

• Deaminacja grup ε-aminowych reszt Liz i Hliz do aldehydów

• Wytwarzanie śród- i międzyłańcuchowych wiązań poprzecznych

Regulacja procesu

• Hydroksylaza prolinowa i hydroksylaza lizylowa - katalizują hydroksylację Pro i Liz. Wymagają obecności Fe²⁺, tlenu, kwasu askorbinowego, α-ketoglutaranu.

• Galaktozylotransferaza i glukozylotransferaza - katalizują glikozylację reszt HLiz.

• Peptydaza prokolagenowa - katalizuje proteolityczne odłączenie propeptydów od prokolagenu. Powstaje tropokolagen.

• Oksydaza lizolowa - katalizuje oksydacyjną dezaminację reszt Liz. Wymaga obecności Cu²⁺ . Zahamowanie tego enzymu - satyryzm.

Choroby tkanki łącznej

Kolagenozy

• Degeneracja kolagenu i zastąpienie go przez fibrynoid, wywodzący się z fibryny osocza

• Są to choroba reumatyczna, sklerodermia, lapus erythematodes

• Następuje depolimeryzacja proteoglikanów

• W arteriosklerozie spada zawartość kwasu hialuronowego w tkankach

• Zespół Ehlersa - Danlosa - niewłaściwe usieciowienie kolagenu i jego nadmierna synteza powoduje nadmierne rozciąganie skóry, nadmiernie ruchliwe stawy

Choroby spichrzeniowe proteoglikanów

• Hurler, Sanfilippo, Huntera

• Proteoglikany odkładają się w nadmiernych ilościach

• Są wydzielane z moczem

BIOCHEMIA KOŚCI

Składniki organiczne kości to białka, p.w. kolagen typu I (stanowi do 95% wszystkich składników organicznych).

Składniki nieorganiczne to kryształy hydroksyapatytu, sód, magnez, węglany, fluorki. Stanowią one 60-70% masy kości.

Kość jest tkanką żywą. Podlega stałej przebudowie. Odżywiana jest przez naczynia krwionośne. Komórkami biorącymi udział w procesach resorpcji i tworzenia kości są osteoklasy i osteoblasty.

• witamina C - pobudza ona syntezę kolagenu i siarczanu chondroityny, jest niezbędna do funkcji osteoblastów

• Witamina A reguluje szybkość syntezy.

• Somatotropina i androgeny- stymulują syntezę kolagenu

• Tyroksyna - pobudza dojrzewanie kości

• Glukokortykoidy - hamują syntezę siarczanu chondroityny

• Parahormon - aktywuje osteoklasty i przyspiesza demineralizację kości

Proces mineralizacji wymaga: zasadowego pH, aktywacji jonów wapnia i fosforanów i ich wysokiego stężenia. Fosforany aktywowane są poprzez wbudowanie ich w cukry w procesie glikolizy i uwolnienie ich przez fosfatazę. Jony wapnia aktywuje siarczan chondroityny.

Grupy aminowe lizyny i hydroksylizyny wiążą się z wapniem z siarczanu chondroityny i z fosforanem, co stanowi początek krystalizacji hydroksyapatytu. Znajdują się w tych miejscach małe pęcherzyki zawierające wapń i fosforany.

BIOCHEMIA WATROBY

ROLA TKANKI WĄTROBOWEJ

jest narządem integrującym metabolizm

co minutę przepływa przez nią 1-2 l krwi

jest miejscem biosyntezy białek osocza krwi, głównie albumin (dlatego pełni ogromna rolę w utrzymywaniu ciśnienia osmotycznego krwi), białek krzepnięcia i fibrynolizy

tu zachodzi detoksykacja amoniaku oraz innych szkodliwych metabolitów

produkuje żółć, z którą wydala się wiele trudno rozpuszczalnych substancji

UDZIAŁ WĄTROBY W PRZEMIANACH

PRZEMIANA WĘGLOWODANOWA

• Zatrzymuje wchłoniętą glukozę, którą następnie kieruje na trzy szlaki w zależności od zapotrzebowania:

1. glikoliza tlenowa - powstaje pirogronian a po jego oksydacyjnej dekarboksylacji - acetylo CoA. Grupa acetylowi spala się do wody i CO2 dostarczając energii. 1 cząsteczka glukozy dostarcza 38 cząsteczek ATP. Tą drogą metabolizuje się ok. 70-90 % glukozy

2. szlak pentozofosforanowy - dostarcza przede wszystkim estrów fosforanowych pentoz, niezbędnych do syntezy nukleotydów i kwasów nukleinowych oraz dostarcza NADPH + H⁺ potrzebnego do różnych biosyntez, np. cholesterolu i kwasów tłuszczowych

3. synteza glikogenu - następuje w przypadku dostatecznej podaży glukozy. Przy zwiększonym zapotrzebowaniu na glukozę, glikogen uwalnia glukozo-1-fosforan, który izomeryzuje do glukozo-6-fosforanu. Dzięki obecnej w wątrobie glukozo-6-fosfatazy uwalnia się glukoza, która z krwią wędruje do tkanek.

• Metabolizm glukozy w wątrobie kontrolują insulina, glukagon i adrenalina

• Tu następuje przekształcenie fruktozy i galaktozy w glukozę

• Zachodzi glukoneogeneza z aminokwasów, mleczanu, pirogronianu

PRZEMIANA LIPIDÓW

• Wątroba jest kolejnym po tkance tłuszczowej magazynem lipidów

• Przebiega tu synteza i elongacja kwasów tłuszczowych, trójglicerydów, fosfolipidów i lipoprotein

• Spala tłuszcze

• Syntetyzuje cholesterol i wydala go do żółci

• Syntetyzuje kwasy żółciowe z cholesterolu

• Gromadzi zapas witamin rozpuszczalnych w tłuszczach

• Syntetyzuje aktywną postać witaminy D - 25-hydroksycholekalcyferol

• Tu zachodzi proces ektogenezy

PRZEMIANA AZOTOWA

• Zachodzi tu transaminacja i dezaminacja aminokwasów

• Synteza endogennych aminokwasów

• Synteza białek osocza

• Powstawanie mocznika z amoniaku, kwasu moczowego z puryn, barwników żółciowych z hemu

• Syntetyzuje kreatynę

PROCESY BIOTRANSFORMACJI I DETOKSYKACJI

Biotransformacja zachodzi na drodze:

1. utleniania i redukcji

2. hydrolizy

3. sprzęgania

1. Utlenianie.

Większość procesów utleniających zachodzi pod wpływem nieswoistych oksygenaz - tzw. Monooksygenaz mieszanych - działają z NADPH i O₂, czasem z flawoproteiną, reduktazą i cytochromem P₄₅₀. Zawartość tych składników wzrasta, gdy rośnie ilość utlenianych substancji. Oksygenazy działają na związki o różnej budowie chemicznej poprzez np. wbudowanie grupy -OH, tlenową dezaminację czy dekarboksylację.

np. oksygenaza arylowa - utlenia cykliczne węglowodory. Posiada cytochrom P₄₄₈. katalizuje utlenianie m.in. benzopirenu, benzoantracenu, które po utlenieniu mają duże powinowactwo do DNA i wiążą się z genomym, co wywołuje transformację nowotworową,

alkohol etylowy utlenia dehydrogenaza alkoholowa, zawiera NAD. Przekształca alkohol w aldehyd a ten w kwas octowy

zawarte w wątrobie reduktazy redukują:

nitrozwiązki aminy

aldehydy i ketony alkohole

2. Hydroliza.

W tym procesie rozpadają się złożone substancje (glikozydy, alkaloidy) i tracą aktywność biol.

3. Sprzęganie

Katalizowane przez transferazy. Polega na przyłączeniu do mało polarnego związku bardziej polarnych substancji lub grup chem. Sprzężone mają mniejsze powinowactwo do lipidów, a większe do wody. Dlatego nie są zwrotnie resorbowane w kanalikach nerkowych i jelitach a wydalane z kałem i moczem

1. tworzenie glukuronidów.

Katalizuje transferaza UDP-glukuronidowa

UDP-glukuronid + R-OH R-O-glukuronid + UDP

R - reszta alkoholu, steroidu lub terpenu, np. metanolu

UDP-glukuronid + R-COOH R-CO-glukuronid + UDP

R - reszta kwasu organicznego, np. bilirubina

2. tworzenie estrów siarkowych

R-OH + AMP-siarczan R-O-SO₃^- + AMP

Np. fenol

3. acetylacja

aminy aromatyczne I alifatyczne reagują z acetyloCoA

np. sulfamidy

4. metylacja

grupa metylowa pochodzi z S-adenozylometioniny

np. amid kwasu nikotynowego

5. sprzęganie z aminokwasami

najczęściej zachodzi z Gly i Glu, rzadziej z Cys i glutationem.

Np. kwas fenylooctowy z Glu

Dzięki biotransformacji unieczynniane są silnie toksyczne substancjie. Produkty biotransformacji mają zazwyczaj słabsze działanie, są lepiej rozpuszczalne w wodzie. Niektóre leki dopiero po transformacji nabierają aktywności biologicznej. Enzymy biorące udział w biotransformacji są nieswoiste i podlegają indukcji. Ich aktywność jest często uwarunkowana genetycznie, stąd zróżnicowana wrażliwość na działanie leku, które może słabnąć z czasem podawania gdyż będzie on aktywniej metabolizowany.

PRODUKCJA, SKŁAD I ROLA ŻÓŁCI

• wątroba produkuje 500-1000 ml żółci na dobę

• produkcję pobudzają kwasy tłuszczowe i wysoka zawartość tłuszczu i mięsa w diecie

• żółć gromadzi się w pęcherzyku i jest wydalana do jelit, co jest pod kontrolą cholecystokininy

• w pęcherzyku następuje zwrotna resorpcja wody, dlatego żółć ciemnieje. Zmienia się też jej skład

• przy zmniejszonej ilości fosfolipidów i kwasów żółciowych w żółci pęcherzykowej następuje wytrącanie się złogów cholesterolu - kamieni żółciowych

• żółć emulguje lipidy, zmniejszając ich napięcie powierzchniowe

• żółć zawiera produkty przemiany porfiryn (biliwerdyna i bilirubina), które wydalają się do jelit gdzie przechodzą dalsze transformacje

• zawiera sole metali ciężkich, miedzi, cynku, rtęci, ołowiu

Skład żółci wątrobowej i pęcherzykowej

Składnik	Żółć wątrobowa %	Żółć pęcherzykowa %
Woda Cholesterol Kwasy żółciowe Bilirubina Białka pH	97 0,2 1 0,1 0,2 7,0-4,5	80-90 Do 5 Do 10 Do 15 Do 3 6-7

BIOCHEMIA WIDZENIA

Substancje chemiczne biorące udział w widzeniu to karotenowce. Absorbują światło w zakresie widzialnym (400-700nm), występują w wielu stanach elektronicznych, zawierają łańcuchy izoprenowi o sprzężonych wiązaniach podwójnych. Nie są produkowane przez organizm lecz pobierane z pożywienia roślinnego. Są trwałe.

Karoteny - roślinne prekursory witaminy A. są to: beta-karoten. Jest utlenianiu przez dioksygenazę beta-karotenową w cytoplazmie komórek jelita tworząc dwie cząsteczki retinalu. Główną postacią witaminy A występującą w diecie są estry retinolu. Są one hydrolizowane przez esterazę w jelicie. Wolny retinol jest wchłaniany z wydajnością 40-80%. Pozostałość wbudowuje się do chylomikronów, i dociera do wątroby, która akumuluje estry retinolu.

Karoteny alfa i gamma - też przekształcane przez dioksygenazę ale z mniejszą wydajnością.

Retinol jest transportowany z wątroby do tkanek w kompleksie z białkiem RBP, głównie do komórek nabłonka, które mogą utlenić retinol do retinalu a retinal do kwasu retinowego.

Retinal i kwas retinowy są najważniejszymi aktywnymi postaciami witaminy A. estry retinolu są formą zapasową, retinol - transportową a retinal - czynną.

Retinal - grupa prostetyczna rodopsyny, występującej w czopkach i pręcikach. Składa się z biłka opsyny i 11-cis-retinalu. Grupa aldehydowa wiąże się z grupą aminową reszty lizolowej opsyny tworząc zasadę Schaffa. Kwant świetlny powoduje fotoizomeryzację 11-cis-retinalu do całkowicie trans-retinalu. Izomeryzacja ta wywołuje zmianę konformacyjną w rodopsynie, co umożliwia powstanie impulsu elektrycznego.

Niedobór witaminy A powoduje zaburzenie widzenia - kurza ślepota

BIOCHEMIA WIDZENIA

Substancje chemiczne biorące udział w widzeniu to karotenowce. Absorbują światło w zakresie widzialnym (400-700nm), występują w wielu stanach elektronicznych, zawierają łańcuchy izoprenowi o sprzężonych wiązaniach podwójnych. Nie są produkowane przez organizm lecz pobierane z pożywienia roślinnego. Są trwałe.

Karoteny - roślinne prekursory witaminy A. są to: beta-karoten. Jest utlenianiu przez dioksygenazę beta-karotenową w cytoplazmie komórek jelita tworząc dwie cząsteczki retinalu. Główną postacią witaminy A występującą w diecie są estry retinolu. Są one hydrolizowane przez esterazę w jelicie. Wolny retinol jest wchłaniany z wydajnością 40-80%. Pozostałość wbudowuje się do chylomikronów, i dociera do wątroby, która akumuluje estry retinolu.

Karoteny alfa i gamma - też przekształcane przez dioksygenazę ale z mniejszą wydajnością.

Retinol jest transportowany z wątroby do tkanek w kompleksie z białkiem RBP, głównie do komórek nabłonka, które mogą utlenić retinol do retinalu a retinal do kwasu retinowego.

Retinal i kwas retinowy są najważniejszymi aktywnymi postaciami witaminy A. estry retinolu są formą zapasową, retinol - transportową a retinal - czynną.

Retinal - grupa prostetyczna rodopsyny, występującej w czopkach i pręcikach. Składa się z biłka opsyny i 11-cis-retinalu. Grupa aldehydowa wiąże się z grupą aminową reszty lizolowej opsyny tworząc zasadę Schaffa. Kwant świetlny powoduje fotoizomeryzację 11-cis-retinalu do całkowicie trans-retinalu. Izomeryzacja ta wywołuje zmianę konformacyjną w rodopsynie, co umożliwia powstanie impulsu elektrycznego.

Niedobór witaminy A powoduje zaburzenie widzenia - kurza ślepota

ENZYMY STRATEGIE KATALITYCZNE

(?) Jakie jest źródło zdolności

katalitycznej i selektywności E ?

Podstawowymi klasami enzymów proteolitycznych są proteazy:

• serynowe,

• cynkowe,

• tiolowe,

• aspartylowe.

Strategie katalityczne E o dobrze poznanym mechanizmie działania;

• LIZOZYM

• RYBONUKLEAZA A

• KARBOKSYPEPTYDAZA

• CHYMOTRYPSYNA

• TRYPSYNA, ELASTAZA

Reakcje katalizowane przez w/w enzymy są proste - hydroliza wiązań:

• glikozydowych,

• fosfodiestrowych

• i peptydowych.

Dla tych E zostały określone szczegółowo na poziomie atomowym:

• struktura przestrzenna,

• wiązanie analogów S i I

(?) Cel - projektowanie silnych

i specyficznych inhibitorów (leki)

enzymatycznych

A.Fleming (Londyn)

(British Bacteriologist, 1922)

• odkrył E (łzy, śluz), który nazwał

• Lizozym (lizo-, ponieważ rozpuszczał bakterie, zym- bo był to enzym)

• siedem lat później odkrył antybiotyk

• penicylinę, która hamuje syntezę ściany komórkowej przez inaktywację transpeptydazy (katalizuje tworzenie wiązań poprzecznych między peptydami

Pasteur:”Przypadek sprzyja umysłom przygotowanym”

LIZOZYM

(zw.glikozydazą) rozkłada ściany komórkowe bakterii, odszczepiając ich składnik polisacharydowy, który jest polimerem(wyst.na przemian

- (NAG) N-Ac-glukozamina,

- (NAM) kw.N-Ac-muraminowy

Lizozym - 14.6kD, 129AA., 4.5x3.0x3.0 nm - zwarta elipsoida

S jest również chityna, polisacharyd (skorupiaki), wyłącznie NAG, poł.wiązaniem 1,4-B-glikozydowym.

Struktura przestrzenna- (D.Philips-pierwsza mapa gęstości elektronowej o dużej rozdzielczości uzyskana dla E )- nie można było ustalić położenie miejsca aktywnego (nie ma gr.prost.).

Wyjaśnienie mechanizmu działania -Rtg badania (techniką różnicową metodą Fouriera - krioenzymologia) oddziaływań lizozymu z silnym inhibitorem kompetycyjnym (tri-NAG).

(?) - w jaki sposób S wiąże się z E?

• które wiązanie ulega hydrolizie?

• które gr.E biorą udział w katalizie ( ozn. O 18)?

Mechanizm katalityczny lizozymu - dowody doświadczalne:

• produkty rozpadu,

analogi stanu przejściowego; zmiana konformacji pierścienia D natywnego S może przyśpieszyć kalalizowaną reakcję kilka tysięcy razy.

• zależność V katalizowanej reakcji od pH.(optimum pH=5)

• wybiórcza modyfikacja chemiczna (estryfikacja Asn 52-całkowita utrata akt.)

• dowód Rtg; - związany cukier ulega strukturalnemu przekształceniu, przyjmując konformację zbliżoną do konf. stanu przejściowego.

RYBONUKLEAZA 3

-enzym trawienny, wytwarzany przez trzustkę (13.7 kD, 124 AA)

rybonukleaza A subtylizyna rybonukleaza S

katalitycznie aktywny kompleks

(peptd S;1-20 i białko S;21-124)

Rybonukleaza A i S -własności kat.obydwu są w zasadzie identyczne

- kat.hydrolizę wiązań P-di-estrowych w łańcuchu RNA

- wiąże również jednoniciowy DNA (bez jego hydrolizy, brak grupy

2'-OH , DNA nie tworzy 2',3'- cyklicznego zw.przejściowego).

- w miejscu aktywnym, sąsiadujące His:12 i 119 , współdziałają

umożliwiając powstanie i hydrolizę cyklicznego zw.przejściowego.

- w stanie przejściowym reakcji hydrolizy RNA, atom P tworzy 5

wiązań kowalencyjnych (met.Rtg-dyfrakcja o dużej rozdzielczości).

W każdym etapie reakcji jeden wierzchołek ostrosłupa zajmowany jest przez atom prowadzący atak nukleofilowy, a drugi przez gr. uwalnianą podczas reakcji - tzw. układ przestrzenny naprzeciwległy

(ang.in-line) typowy dla wielu r.przeniesienia gr.fosforylowej.

np. podczas syntezy DNA lub RNA gr.atakującą jest 3'-O, a grupą

uwalnianą - pirofosforan.

KARBOKSYPEPTYDAZA A - proteaza cynkowa 4

- enzym proteolityczny (trawienny), pojedynczy łańcuch, 307 AA,

(5.0x4.2x3.8 nm), 38%-alfa, 17%-bata,,aktywuje cz.wody-kluczowe znaczenie dla akt.E.

- indukowane dopasowanie

(?)W jaki sposób karboksypeptydaza rozpoznaje resztę A na C-końcu

- wiązanie S wywołuje b.duże zmiany w miejscu aktywnym

- jon Zn w miejscu akt.E aktywuje cząsteczkę wody

W porównaniu z białkiem o sztywnej strukturze, białko elastyczne dysponuje znacznie szerszym zakresem potencjalnych konformacji,

które mogą być wykorzystane w katalizie.

CHYMOTRYPSYNA - proteaza serynowa 5

- 3 łańcuchy polipeptdydowe(poł.-S-S-), 25kD, 5.1x4.0x4.0 nm.

- syntetyzowana: pjedynczy łańcuch, nieaktywny chymotrypsynogen

- enzym trawienny ssaków (rodzina proteaz serynowych)

- funkcja biologiczna - hydroliza białek w jelicie cienkim

- fragmentacja: Tyr,Trp, Phe, Met

- mechanizm katalizy:

E + S = ES --------- E-P2 -------- E

P1 P2

P1 - aminowa lub alkoholowa część S

P2 - kwasowa część S

E-P2 - kowalencyjny zw.przejściowy,zw.pośredni, acylo-E.

gr.acylowa łączy się z niezwykle reaktywną resztą Ser

proteaz serynowych

- wykazanie katalitycznej roli His57 metodą znakowania

powinowactwa

- Ser 195, His57, Asn102 tworzą katalityczną triadę w Chtrp.

- w reakcji katalizowanej przez Chtrp. powstaje przejściowy

tetraedryczny zw. pośredni.

TRYPSYNA I ELASTAZA proteazy serynowe 6

-enzymy trawienne, podobne do chymotrypsyny:

Podobieństwa w strukturze i mechaniżmie działania:

- homologia sekwencjiAA tych trzech E wynosi 40%(we wnętrzu60%

- struktury przestrzenne b.podobne (Rtg)

- we wszystkich trzech E:

- wyst katalityczna triada: Ser, His, Asn.

- sekwencje AA sąsiadujące z Ser są jednakowe (G-A-S-G-G-P)

- wydzielane są przez trzustkę w formie nieaktywnego prekursora

- mechanizmy katalityczne są prawie identyczne

Różnice w specyficzności substratowej:

-wynikają z b.niewielkich zmian strukturalnych w miejscu wiązania.

Chtrp. - pierścień aromatyczny lub duży, niepolarny łańcuch boczny

po aminowej str. wiązania peptydowego

Trypsyna - Lys, Arg

Elastaza - małe, pozbawione ładunku łańcuchy boczne.

Różnice w specyficzności substratowej tych enzymów wynikają z bardzo niewielkich zmian strukturalnych w miejscu wiązania.

Kieszenie przestrzenne:

chymotrypsyna trypsyna elastaza

PROTEAZY TIOLOWE

( zw. SULFHYDRYLOWYMI

lub CYSTEINOWYMI )

np. papaina

• szeroko stosowana do zmiękczania mięsa

(w miejscu katalitycznym jest Cys -

odpowiednik Ser 195 w Chtr.)

katepsyna B

• katalizuje rozpad białka

w lizosomach .

PROTEAZY ASPARTYLOWE

( zw. KARBOKSYLOWYMI

lub KWASOWYMI )

PEPSYNA

enzym proteolityczny soku żołądkowego

• pojedynczy łańcuch polipeptydowy, 35kD, optimum pH 2-3,

• dwie części (N- i C-końcową) o podobnej strukturze;

(produkt duplikacji genu)

• między nimi głęboka bruzda,

to miejsce wiązania S.

• miejsce aktywne - 2 reszty Asn (32 i 215), leżące po dwóch stronach H₂O

• żeby E był aktywny, to jedna Asn-zjonizowana, druga-nie,

• pK=4.5 zmienia się na b.niską, wynosi 1.2, czyli b.silny kwas!

RENINA

Renine-Angiotensine-Aldosterone System (RAAS)

• przekształca angiotensynogen w angiotensynę I

• powoduje wzrost ciśnienia krwi

CHYMOZYNA (zw.renniną)

• w żołądku przeżuwaczy;

• stosowany od stuleci do wyrobu serów.

PROTEAZA HIV-1

- ma decydujące znaczenie dla replikacji wirusa HIV, wywołującego u ludzi niedobór odporności immunologicznej, będącego przyczyną

AIDS (ang. Acquired Human

Immunodeficiency Syndrome)

• warunkiem replikacji wirusa HIV-1 jest proteolityczne rozszczepienie poliproteiny, zawierającej kilka białek o kluczowym znaczeniu;

jednym z nich jest proteaza HIV1

(sama wycina się z poliproteiny!) i uwalnia inne białka, istotne dla wirusa.

• 11 kD, 99AA, zawiera pojedynczą sekwencję Asp-Thr-Gly

(2x mniejsza od eukariotcznych

proteaz aspartylowych!)

(?) W jaki sposób powstaje miejsce

aktywne?

Proteaza HIV-1 jest symetrycznym dimerem, zawiera dwie Asn w miejscu wzajemnych oddziaływań podjednostek (badania Rtg)

• mutacja Asn w miejscu aktywnym prowadzi do całkowitej inaktywacji E i zniesienia infekcyjności wirusa.

- decydujące znaczenie proteazy HIV-1 w procesie namnażania się wirusa sprawia, że badania dotyczące znalezienia skutecznego leku przeciwko AIDS skupiają się na tym enzymie.

Wykorzystanie proteazy HIV-1 w skutecznej terapii wymaga:

• wyjaśnienia sposobu wiązania analogów S,

• określenia układu przestrzennego stanu przejściowego.

Uzyskano inhibitory, analogi stanu przejściowego;

np. N-acetylopepstatyna i pochodne

( K_i ok. 1 nM)

wiążą się w konformacji rozwiniętej

(ang. extended conformation),

ich gr. -OH oddziaływują

z dwoma kluczowymi resztami Asn.

Problem:

- skuteczny środek przeciwko AIDS nie powinien hamować innych proteaz aspartylowych (np.renina)

(?) W jaki sposób można uzyskać taką

selektywność działania ?

Podstawową różnicą między proteazą wirusa i gospodarza jest dwustronna symetria E pochodzenia wirusowego.

Inhibitor będzie wysoce specyficzny, gdy jego symetria będzie taka sama, jak cząsteczki E wirusowego; dokładne dopasowanie I do miejsca akt.,wynikające z jego symetrii i układu przestrzennego sprawia, że hamuje on proteazę HIV-1

10 tys. razy skuteczniej, niż proteazy gospodarza.

Dzięki znajomości struktury przestrzennej i mechanizmu reakcji proteazy HIV-1 skonstruowano wiele obiecujących zw. farmakologicznych w terapii AIDS.

Badania dotyczące opracowania skutecznej terapii AIDS wkroczyły w nową fazę.

International Congres AIDS

Vancover -Canada (1996)

- chorych 22 mln; 5 osób/min.

• we wczesnych stadiach powstaje

10 mln cząsteczek wirusa,

w tym miliony mutantów,

• żaden lek stosowany pojedynczo

nie może ich pokonać;

• podawanie leków w zestawach spowalnia namnażnie wirusa i opóżnia powstawnie mutantów .

R.M.Gulick

(NY Univ.Medical Center,1996)

• kombinację 3 leków:

• AZT hamuje odwrotną transkryptazę, enzym wirusa HIV rozpoczynający proces jego replikacji w zakażonych komórkach 3TC,

• INDONAVIR - hamuje wirusową

Proteazę oraz AZT, 3TC.

• RITONAVIR - działanie j.w.

Y.J. Bryson

(Univ.California, Los Angeles)

- zestaw 3 leków:

AZT,

ddI,

NEWIRAPINA

wykazuje natychmiastowe działanie anty-HIVzmniejsza ryzyko przeniesienia wirusa z matki na dziecko do 2%!

• terapia ok.10tys. dolarów/rok.

- CHEMIOTERAPIA

- TERAPIA BIOLOGICZNA

β- chemokiny (peptydy) - IL-2, IL-10 - wstrzyknięcie obniża gwałtownie poziom HIV w surowicy na kilka godzin.

AZT - inhibitor HIV

• blokowanie replikacji DNA

• polimerazy zależnej od RNA; 100x wrażliwsze niż ten E gospodarza.

Monoterapia AZT zmniejsza ryzyko przeniesienia wirusa z matki na dziecko o ok.65%.

ACYLOVIR - inhibitor

dla specyficznej DNA polimerazy terminacji łańcucha DNA.

CZĄSTECZKI RNA JAKO ENZYMY

• odkrycie katalitycznych RNA (lata 80-te)

• przez ponad 50 lat uważano, że wszystkie E są białkami!

• aktywność enzymatyczną stwierdzono dla wielu tysięcy białek

• uważano, że tylko one są zdolne do katalizy E.

CZĄSTECZKI RNA MOGĄ BYĆ WYSOCE AKTYWNYMI ENZYMAMI

np. L19 RNA

skrócona forma intronu, samodzielnie wycinajęcego się (ang. self-splicing )

z prekursorowego rRNA pierwotniaka Tetrahymena thermophila

• specyficznie katalizuje rozpad i łączenie S (oligonukleotydy)

? Na jakiej podstawie stwierdzono, że

L19 RNA ( 395 nukleotydów)

jest równocześnie

rybonukleazą i polimerazą RNA?

• ponieważ w obecności L19 RNA pentanukleotyd cytydylowy (C5)

ulega równoczesnemu przekształceniu;

• w krótsze (C3,C4)

• i dłuższe oligomery.

• przekształca znacznie szybciej;

• C5 niż U5,

natomiast w ogóle nie przekształca

• A5 i G5.

L19 RNA wykazuje kilka właściwości typowych dla katalizy enzymatycznej:

• wysoki stopień specyficzności substratowej,

• kinetykę Michaelisa-Menten,

• podatność na inhibicję kompetycyjną

Dotychczas nie poznano struktury przestrzennej, ale wstępnie określono mechanizm katalizy L19 RNA;

• aktywność rybonukleazy

(reakcja transestryfikacji),

• aktywność polimerazy

RNA L19 jest prawdziwym enzymem:

zarazem NUKLEAZĄ i POLIMERAZĄ

? - Jak jest relacja między skutecznością

katalityczną L19 RNA

i enzymów białkowych?

W obecności katalitycznej cząsteczki RNA szybkość hydrolizy C5 jest 10¹⁰ razy wyższa niż w przypadku reakcji niekatalizowanej ( olbrzymia siła katalityczna tego rybozymu! )

może to sugerować, że RNA we wczesnym etapie ewolucji mógł replikować się samodzielnie ?!

Mechanizm katalityczny L19 RNA:

Wykrycie akt.enzymatycznej :

• L19 RNA

• RNAwchodzącego w skład rybonukleazyP uczestniczącej w dojrzewaniu prekursorów tRNA zmieniło nasze poglądy na temat ewolucji molekularnej i stworzyło nowe perspektywy badawcze.

Odkrycie, że RNA będąc przenośnikiem informacji jest równocześnie zdolny do katalizy sugeruje, że współczesne systemy biologiczne powstały w drodze ewolucji ze świata RNA, poprzedzającego pojawienie się

DNA i białka.

RNA L19 JEST PRAWDZIWYM ENZYMEM: ZARAZEM NUKLEAZĄ I POLIMERAZĄ

• szybkość hydrolizy C₅ jest 10¹⁰ razy większa od reakcji niekatalizowanej (olbrzymia siła katalityczna tego rybozymu!)

• może to sugerować, że RNA we wczesnym etapie ewolucji mógł replikować się samodzielnie.

(?) W jaki sposób rybozym rozcina S

I Z O E N Z Y M Y ( I Z O Z Y M Y )

def:

FORMY ENZYMÓW WYWODZĄCE SIĘ Z GENETYCZNIE UWARUNKO-WANYCH RÓŻNIC W BUDOWIE I - RZĘDOWEJ.

Katalizują ten sam proces, różnią się:

• ruchliwością elektroforetyczną,

• powinowactwem do substratu

i kofaktorów,

• lokalizacją w organiźmie,

• właściwościami immunologicznymi

• wpływem temp., pH, hormonów, etc.

PODZIAŁ IZOENZYMÓW

1. TKANKOWE

( narządowe)

2. KOMÓRKOWE

(w mitochondriach i cytoplaźmie)

3. ROZWOJOWE

(płód, osobnik dojrzały)

DEHYDROGENAZA MLECZANOWA

( LDH )

GLUKOZA K GLUKOZA

6-P GLUKONEOGENEZA R GLIKOLIZA 2P

Cykl

Corich PIROGRONIAN E PIROGRONIAN

MLECZAN W MLECZAN

W WĄTROBIE W MIĘŚNIACH

W MIĘŚNIU SERCA

LDH

• tertramer (4 monomery, 35kD)

2 rodzaje łańcuchów polipeptydowych:

H - (ang. heart - serce)

• duże powinowactwo do mleczanu

pH 7.0-7.3

M - (ang. muscle - mięśnie)

• małe powinowactwo do pirogro-

nianu, pH < 7 (kwaśne)

Tworzą 5 rodzajów tetramerów

Izoenzymy;

H₄ H₃M H₂M₂ HM₃ M₄

mięsień serca, mięśnie

wątroba hybrydy szkieletowe

Reakcja:

COO LDH COO

C=O + NADH + H H-C-OH + NAD

CH₃ CH₃

pirogronian mleczan

H₄

utlenianie mleczanu do pirogronianu; w

warunkach aerobowych wykorzystywany przez serce jako materiał energetyczny

M₄

przebieg GLIKOLIZY

w warunkach anaerobowych.

- KWAŚNE (FK)

FOSFATAZY:

- ALKALICZNE(FA)

1. FOSFATAZA ALKALICZNA (FA)

Formy w surowicy:

I. a. kostna

b. wątrobowo-żółciowa

II. c. jelitowa

III. d. łożyskowa

Diagnostyka (we krwi)

• kostna - choroby kości

• wątrobowa - żółtaczka zastoinowa

• jelitowa - nowotwory,

• choroby przewodu pokarmowego,

• marskość wątroby

• łożyskowa;

• wzrost akt. w 16-20 tyg. ciąży,

• po porodzie spadek aktywności

• w ciągu 3-6 dni.

2. FOSFATAZA KWAŚNA (FK)

a. z prostaty - winian

b. z erytrocytów - formaldehyd

Choroba nowotworowa

- kiedy wzrasta aktywność

nie jest hamowana przez

ww inhibitory.

A L D O L A Z A

IZOENZYMY - 3 typy:

ALDOLAZA A -

• MIĘŚNIE , krwinki czerwone,

nerki ( tam, gdzie przebiega

glikoliza)

ALDOLAZA B -

• WĄTROBA (aktywniejszy w

procesach anabolicznych, w

syntezie glukozy)

60x aktywniejszy od Aldolazy A

w rozkładzie F-1-P (przemiana

fruktozy)

Fruktozuria - nietolerancja fruktozy.

ALDOLAZA C -

• MÓZG, tkanka nerwowa,

soczewka oka.

W rozwoju ontogenetycznym;

• najwcześniejszą jest forma Aldolazy A,

• w miarę rozwoju pojawia się w jelicie i wątrobie forma B

• oraz w mózgu i soczewce oka forma C.

W płodzie:

wyłącznie aldolaza A(tetramer), - po 6 miesiącach A, B,

- po urodzeniu B i ślady B, A.

Nowotwory

• gen A w wątrobie jest represjonowany

• w nowotworach wątroby znika aldolaza B i jest tylko aldolaza A,

• czyli wraca do formy płodowej,

• odzywa się gen A.

IUB - SYSTEM MIĘDZYNARODOWEJ

UNII BIOCHEMICZNEJ

• nazewnictwo i klasyfikacja enzymów na podstawie typu i mechanizmu reakcji np: EC 1.2.1.12.

Główne zasady:

Enzymy - 6 klas; każda 4-13 podklas

• nazwa enzymu składa się z 2 części;

1. -aza określa typ reakcji

2. określa S (lub Substraty)

• każdy E ma nr.kodu (EC), charakteryzujący typ reakcji, czyli;

• klasę (pierwszy człon)

• podklasę (drugi człon)

• pod-podklasę (3 człon)

• i nazwę E (4 człon)

• dodatkowa informacja może być podawana w nawiasach

K L A S Y E N Z Y M Ó W

1. OKSYDOREDUKTAZY

(katalizują reakcje ox-red)

2. TRANSFERAZY (kat. przeniesienie C, N, P )

3. HYDROLAZY

(kat.rozbicie wiązań przez addycję wody)

4. LIAZY

(kat.rozbicie wiązań C-C, C-S, C-N)

5. IZOMERAZY

(kat. racemizację optycznych lub chemicznych izomerów)

6. LIGAZY

(kat. tworzenie wiązań pomiędzy

C, a O, S, N połączonych wysoko energetycznym wiązaniem P (ATP)

BIA Ł K A:

- FAŁDOWANIE

- PROJEKTOWANIE

to jedna z najbardziej fascynujących

i ważnych dziedzin biochemii.

(?) - Dlaczego ostatnio nastąpił tak ogromny postęp nad projektowaniem

i konstruowaniem białek?

- Jaki to ma cel?

1. zwiększenie zasobu białek oferowanych przez naturę,

2. wykorzystanie białek dla celów:

• medycznych,

• przemysłowych,

• farmaceutycznych,

• biotechnologicznych,

- rolniczych etc.

FAŁDOWANIE BIAŁEK

(?) - W jaki sposób

1. skład AA wpływa na strukturę

przestrzenną,

1. łańcuch polipeptydowy uzyskuje

strukturę natywnego białka.

Fałdowanie białek przebiega w procesie postępującej stabilizacji form pośrednich

( intermediatów ).

np.

białko poszukuje konformacji najbardziej stabilnej energetycznie;

• 100 AA - całkowita możliwa liczba

struktur wynosi 5x10⁴⁷

• czas potrzebny na optymalną

strukturę to 1.6x10²⁷ lat.

(?) - Dlaczego istnieje tak ogromna różnica pomiędzy czasem obliczonym,

a rzeczywistym?

Ponieważ - częściowo poprawne stany pośrednie zostają zachowane.

MOTYWY FAŁDOWANIA

(struktury naddrugorzędowe)

Motywy strukturalne

zw. motywami fałdowania

(ang.folding motifs)

lub strukturami naddrugorzędowymi,

• powstają wskutek asocjacji helis

lub innych struktur

• pełnią kluczową rolę w przestrzennym fałdowaniu się białka.

Bardzo ważne motywy typu;

• helix-skręt-helix,

• domeny homeotyczne,

• suwaki leucynowe, Moduły białkowe

• palce cynkowe wiążące DNA

PALCE CYNKOWE

• występują najczęściej

• przed kilkunastu laty nikt o nich nie słyszał!

• obecnie znaleziono je w ponad dwustu białkach,

• będących czynnikami transkrypcyjnymi,

• zawierającymi małe “wypustki” zw.palcami cynkowymi,

• znakomicie dostosowane do rozpoznawania DNA.

O.Rhodes, A.Klug - Nagroda Nobla(1982)

„Wkład w rozwój technik mikroskopii elektronowej do badania kompleksów cząsteczek biologicznych

oraz wyjaśnienie struktury kompleksów białkowo-nukleinowych w wirusach

i chromosomach”).

Klug (1985) stwierdził, że

• pewne odcinki łańcucha AA mogą się owijać wokół jonów Zn, tworząc

• moduły zw. palcami cynkowymi,

• z którymi współdziała 1-8% DNA w komórce.

Białka tego typu mają od 2-37 palców Zn ułożonych tandemowo.

R.Katein(1990r-Utrecht)-oznaczył strukturę domen w receptorze kortyzonu;

O.Rhodes - w receptorze estrogenu człowieka.

MEDYCYNA

- patologie, procesy chorobowe,

Rak nerki (zw.guzem Wilma)

• mutacja wpływająca na wiązanie DNA do palców Zn w białku.

Opóżnione dojrzewanie płciowe -

• niezdolność receptorów estrogenu i androgenu do właściwego sfałdowania, gdy brak Zn w diecie.

Istotą fałdowania się białek jest zachowanie częściowo poprawnych półproduktów

U = M = N

U - stan rozpleciony (ang. unfolded ),

N - stan natywny,

M - struktura częściowo statystycznego

kłębka

• kłębek-struktura zwarta,

• statystyczny - płynność oddziaływania między jednostkami I rzędowej struktury

Chaperony (ang.chaperones)

tzw. “molekularny opiekun”

• białka,

• zapobiegają nieprawidłowym wiązaniom,

• eliminują błędne połączenia

Rodzina hsp60 (chaperony 60) -

Białka szoku termicznego

Rodzina hsp70 (BiP)

• konserwatywna

(50% analogii pomiędzy E.coli

i człowiekiem

Rozplątujące działanie wielu czaperonów odbywa się kosztem ATP.

Fałdowanie się większości białek w komórce jest wspomagane przez enzymy,

np.

• disulfidoizomeraza

(izomeraza dwusiarczkowa)

• izomeraza peptydyloprolilowa (przyśpiesza izomeryzację cis-,trans- wiązań tworzonych przez Pro).

Obecnie znamy ponad 100 różnych motywów fałdowania się (splotów) białek.

PROJEKTOWANIE BIAŁEK

Wyrafinowane programy komputerowe umożliwiają szerokie wykorzystanie szybko wzrastającej ilości danych na temat sekwencji i struktury, zebranych w odpowiednich bazach danych.

MODUŁY BIAŁKOWE WIĄŻĄCE DNA

SUWAKI LEUCYNOWE

• zwinięty łańcuch o strukturze superhelisy

• 2 domeny wiążące DNA

Istotna cecha;

• obecność Leu (co siódma pozycja)

w obrębie 35 reszt AA

Rola;

Połączenie dwóch elementów wiążących DNA tak, żeby mogły wiązać się z dwoma przyległymi sekwencjami DNA

Suwaki leucynowe - główna klasa eukariotycznych regulatorów transkrypcji

E N Z Y M Y

biokatalizatory

katalizatory układów biologicznych

• w układach biologicznych niemal wszystkie reakcje są katalizowane przez białka zw. enzymami.

• odkryto katalitycznie czynne RNA.

Aktywność katalityczna białek wynika z ich zdolności do;

• wiązania cząsteczek substratów

w ściśle określonym ułożeniu

• stabilizacji stanów przejściowych w procesie tworzenia i zrywania wiązań chemicznych.

np. enzymatyczna kataliza reakcji:

H₂O + CO₂ dehydrataza węglanowa HCO₃ + H⁺

(anhydraza)

przeniesienia CO₂ z tkanek do krwi

Anhydraza jest jednym z najszybszych znanych enzymów; każda cząsteczka E może uwolnić 10⁵ CO ₂/sek.

(?) - W jaki sposób dehydrataza przyśpiesza tę reakcję milionkrotnie ?

Enzymy mogą funkcjonować jako molekularne przełączniki;

• przyjmujące,

• integrujące

• przekazujące sygnały.

Konformacyjne zmiany spowodowane

• przyłączeniem cząsteczki do jednego miejsca,

• mogą wywoływać zmiany w innych, odległych o ponad 2 nm miejscach.

Zmiany te przekazywane między oddalonymi od siebie miejscami decydują o zdolności enzymu do ;

• przemiany energii

• przekazywania informacji.

Wiele enzymów zawiera

miejsca regulatorowe, zw.allosterycznymi

które kontrolują wiązanie innych cząsteczek i zmieniają V katalizy

Allosteryczna kontrola za pośrednictwem zmian konformacyjnych stanowi główny sposób regulacji metabolizmu.

MECHANIZM DZIAŁANIA ENZYMÓW

1. Kataliza enzymatyczna

E nie mają wpływu na równowagę reakcji;

• osiągnięcie stanu równowagi - kilka godz.,

• w obecności E - msek)

Enzym nie przesuwa stanu równowagi, tylko przyśpiesza jego osiągnięcie.

? w jaki sposób E przyśpieszają reakcję?

- przez stabilizację stanu przejściowego

Istotą katalizy jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego.

E przyśpieszają reakcje przez obniżenie bariery aktywacji, Δ G

Pierwszy etap katalizy enzymatycznej to utworzenie kompleksu E-S

(?) - W jaki sposób wykazano tworzenie

tego kompleksu ?

• ogólny dowód istnienia kompleksu E-S (nie bezpośredni!) L.Michaelis - Vmax. reakcji katalizowanej enzymatycznie.

założenie:

Istnienie E-S; przy odp.dużych stęż.S wszystkie miejsca katalityczne są obsadzone i dlatego V r.osiąga max.

• bezpośrednie uwidocznienie komplexu E-S przy pomocy:

• mikroskopii elektronowej

np. mikrografia kompleksu polimerazy I DNA z jej niciową syntetyczną matrycą

• charakterystyka spektralna

np. widmo absorpcji

Hb (utl.) i Hb (nieutl.)

HEM barwna gr.prostetyczna

np. syntaza Trp;

(synteza L-Trp z L-Ser i indolu)

gr.prost. fosforan pirydoksalu

• spektrofotometria fluorescencyjna

• spektroskopie:

- rezonansu magnetycznego;

• jądrowego

• elektronowego

ENZYMY-MIEJSCA AKTYWNE

(Aktywne centrum katalityczne)

• obszar, który wiąże S

• ( i gr.prostetyczną - jeżeli występuje)

• reszty AA(zw. grupami katalitycznymi) biorące bezpośredni udział

• w tworzeniu

• i zrywaniu wiązań.

Miejsca aktywne E mają wspólne cechy:

1. zajmują stosunkowo małą część

całkowitej objętości E.

(?) Dlaczego E są tak duże ?

(ok. 100AA, 10 kD, ∅ = 2.5 nm)

2. są układami przestrzennymi ( gr.AA leżą w różnych pozycjach liniowej sekwencji), np. lizozym (reszty AA w poz. 35, 52,62, 63,101 w sekw.129AA)

3. w połączeniu S z E biorą udział stosunkowo słabe wiązania

np.stała równowagi ES (10^-2-10^-6 M),

co odp. energii swobodnej wiązania

od -12 do -50 kJ/mol.,

(wiązania kowalencyjne;

od -290 do -460 kJ/mol).

4. miejsca aktywne są zagłębieniami

lub szczelinami.

5. specyficzność wiązania zależy od

precyzyjnie określonego ułożenia

atomów w miejscu aktywnym.

1. E.Fisher

układ E-S „klucz-zamek”

2. D.E.Koshland,Jr.- model

wymuszonego dopasowania

(ang. induced fit).

KINETYKA

REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

• Model Michaelisa - Menten

E + S = ES = E + P

Podstawowe założenie:

„ kompleks ES jest koniecznym etapem pośrednim”

• charakterystyka kinetyczna:

- V zmienia się ze stężeniem S

• V (def.) - liczba moli P/1sek.

przy:

• stałym [E],V prawie liniowo zależy od [S], gdy[S] małe,

• dużych [S],V jest prawie niezależne od [S].

I. MODEL SEKWENCYJNY

II. MODEL JEDNOPRZEJŚCIOWY

I, II - PORÓWNANIE MODELI

ALLOSTERYCZNYCH

Szybkość katalizy w warunkach stacjonarnych - w warunkach

stanu ustalonego, ang. steady state)

Równanie Michaelisa-Menten

K_M jest równa takiemu [S], dla którego szybkość reakcji osiąga połowę swojej wartości maksymalnej (V_max).

• zmieniając [S] można określić

V_max oraz K_M

Wartości K_M dla większości E wynoszą 10^-1 - 10 ^-7 M.

Stała Michaelisa K_M ma dwa znaczenia:

1. K_M oznacza takie [S], w którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona

2. K_M wiąże się ze stałymi szybkości, charakterystycznymi dla poszczególnych etapów katalizy.

E N Z Y M K_M (μM)

anhydraza węglanowa 8000

chymotrypsyna 5000

penicylinaza 50

syntetaza arginylo-tRNA 3

Liczba obrotów (l.o.) enzymu - liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkt reakcji na jednostkę czasu, w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem.

Liczba obrotów większości enzymów, pracujących ze swoimi fizjologicznymi substratami, wynosi 1- 10⁴/sek.

Enzym l.o./sek

anhydraza węglanowa 600 000

penicylinaza 2 000

syntetaza Trp 2

lizozym 0.5

I N H I B I C J A

Główny mechanizm kontroli

w układach biologicznych

Enzymy mogą ulegać inhibicji przez specyficzne cząsteczki

W MEDYCYNIE

- działanie wielu leków i czynników toksycznych opiera się na inhibicji enzymów, która może być:

• inhibicją nieodwracalną,

np.

działanie gazów paraliżujących układ nerwowy DIPF (di-izo-propylo-fluoro-fosforan) - trucizna, reaguje z Ser w

miejscu aktywnym acetylocholinesterazy

• inhibicją odwracalną

(szybka dysocjacja kompleksu [E-I])

a) - inhibicja kompetycyjna:

założenia:

E może wiązać S lub I, ale nie oba na raz

Inhibitor kompetycyjny zmniejsza

V katalizy przez zmniejszanie liczby cząsteczek E wiążących S

np.

fizjologicznie ważna inhibicja komp.

• tworzenie BPG (2,3-bis-P-glicerynianu)

(z 1,3..)

• fosfogliceromutaza hamowana przez produkt.

Inhibicję kompetycyjną można przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu.

b) - inhibicja niekompetycyjna

I i S mogą wiązać się równocześnie z E

Działanie inhibitora niekompetycyjnego

polega na

• zmniejszeniu liczby obrotów E

• a nie na zmniejszaniu liczby cząsteczek E wiążących S

c)- inhibicja mieszana

• I wpływa jednocześnie na wiązanie S

• na liczbę obrotu E

Istotą katalizy jest selektywna stabilizacja stanu przejściowego

Analogi stanu przejściowego

• stabilne związki naśladujące S

w stanie przejściowym;

• silne i specyficzne inhibitory E.

- immunogeny

używając analogów stanu przejściowego jako immunogenów można otrzymać przeciwciała katalityczne.

np.

otrzymanie przeciwciał, które katalizują wbudowanie jonu metalu do porfiryny.

Wyprodukowano katalizator używając

N-alkiloporfirynę jako immunogen (2500x

Znaczenie analogów stanu przejściowego:

1. pozwalają na wgląd w mechanizmy katalityczne,

2. mogą służyć jako silne i specyficzne inhibitory enzymów,

3. mogą być użyte jako immunogeny

do wytwarzania wielu nowych

katalizatorów.

MEDYCYNA

Penicylina

- inaktywuje nieodwracalnie kluczowy enzym przy syntezie komórkowych ścian bakterii.

(?) - W jaki sposób penicylina hamuje

wzrost bakterii?

Penicylina hamuje sieciującą transpeptydazę glikopeptydową, stosując strategię konia trojańskiego.

Wyjątkowość ścian komórek bakteryjnych polega na tym, że ;

• zawierają one D-aminkwasy,

• które tworzą wiązania poprzeczne odmiennym mechanizmem od używanego w syntezie białek.

• transpeptydaza tworzy acylowe intermediaty z przedostatnimi resztami Ala peptydu; D-Ala-D-Ala-peptyd

• intermediaty te reagują z grupami aminowymi końcowej Gly w innym peptydzie, tworząc wiązania poprzeczne.

• penicylina łatwo przyłącza się do aktywnego miejsca transpeptydazy, ponieważ przypomina układ

D-Ala-D-Ala natywnego S.

• powstały penicyloiloenzym już dalej nie działa, a transpeptydaza zostaje nieowracalnie zahamowana.

WYMIANA DOMEN STRUKTURALNYCH

JAKO MECHANIZM

OLIGOMERYZACJI BIAŁEK

• ang. Domain Swapping (DS)

• odkrył Eisenberg (1994) w strukturze toksyny błonicy.

• def.„ DS - zastąpienie elementu struktury białkowej(„domeny”) identyczną domeną innej cząsteczki i odtworzenia pierwotnej struktury przestrzennej”.

• Jeżeli wymiana domen jest wzajemna, to powstaje dimer lub oligomer przeplecionych cząsteczek białka.

Lin et al., Nature Struct.Biol. 8,211(2001)

Celem odróżnienia zwojów białkowych

• forma monomeryczna

zw. zwój zamknięty

• forma dimeryczna

zw. zwój otwarty

Otwarty obszar kontaktu

tj. obszar oligomeru, dla którego nie ma odpowiednika w natywnych strukturach jego komponentów.

Zamknięty obszar kontaktu

tj. miejsce styku cząsteczek, które jest takie samo jak w monomerach.

RYBONUKLEAZA A

• monomeryczna,

może dimeryzować na 2 sposoby

przez wymainę domeny;

1. N- końcowej,

2. C- końcowej.

Wymiana domen może być nie tylko mechanizmem powstawania

• niewielkich „zamkniętych”oligomerów, ale też

• liniowej, „otwartej” agregacji

np. powstawanie włókien amyloidowych.

AMYLOID (łac. Amylum, gr.Amylon)

• białko ( nie polisacharyd !! )

(?) - z jakich białek można utworzyć

amyloid ?

PATOLOGIE

„KONFORMACYJNE BIAŁEK”

(?) - jaki jest związek wymiany DS

z procesem amyloidogenezy ?

• Ludzka cystatyna C,

• małe monomeryczne białko

• ogromne znaczenie jako inhibitor

proteaz cysteinowych,

istotny składnik

• złogów amyloidowych

tworzących się w mózgu

w podeszłym wieku.

Jeszcze groźniejszy wariant to występująca endemicznie na Islandii

• angiopatia mózgowa,

wiążąca się z dziedziczną mutacją

punktową L68Q w sekwencji tego

białka.

• choroba objawia się;

1. masową amyloidozą naczyń

krwionośnych mózgu,

2. gwałtownymi wylewami krwi do

mózgu,

3. i śmiercią w młodym wieku.

np.

• β- amyloid (ch. Alzhaimera)

• lizozym,

• fibrynogen,

• insulina,

• apolipoproteina,

• białka prionowe

Mutacje powodują tworzenie agregatów

i choroby związane z patologiami konformacyjnymi białek.

GENOMIKA - cel; GENOM

PROTEOMIKA-poznanie białek

Nobel (2002)

• Kurt Wuthrich (Szwajcaria-USA)

NMR do badania struktury białek

• John B.Fenn (USA)

• Koichi Tanaka(Japonia)

MS -spektroskopia masowa

BIAŁKO-„nie ma białka, nie ma życia”

Scripps Researche Institute, California

Cel:

„opisanie struktury wszystkich aktywnych białek w ludzkim organizmie”

BIAŁKA OPIEKUŃCZE, CZAPERONY (ang. chaperones)

• niezbędne w każdym żywym organizmie,

• funkcja:

1. pomoc w poprawnym zwijaniu białek,

2. w ochronie białek przed czynnikami stresowymi

3. uczestniczą w:

• transporcie białek między organellami komórkowymi,

• w degradacji niepożądanych białek.

Wynikiem działania chaperonów nie jest przeprowadzenie określonej reakcji, a jedynie zmiana struktury przestrzennej substratu.

RODZINY BIAŁEK OPIEKUŃCZYCH

(CZAPERONÓW), tzw. Hsp - BIAŁKA SZOKU TERMICZNEGO

(ang. heat shock protein)

Wiele groźnych chorób ma swoją przyczynę w źle zwiniętych cząsteczkach białkowych;

• syndrom Marfana punktowa mutacja (R1137P) w fibrylynie.

• Encefalopatia gąbczasta,

tzw. „choroba szalonych krów”-zmiany

strukturalne białka prionowego.

• ch.Alzheimera- tworzenie amyloidowych

płytek przez β-amyloidowy peptyd.

Do tej samej grupy chorób, których przyczyna jest chorobotwórcza struktura

(ang. toxic folds) należą choroby;

• Hantingtona

• Parkinsona

BUDOWA I FUNKCJE

BIAŁKA CD36

Białko CD36 płytek krwi, znane też jako: GPIV, GPIIIb i GP88.

FUNKCJE;

• Receptor kolagenu,

• Trombosporyny (TSP),

• fosfilipidów anionowych,

• LDL,

• Erytrocytów zakażonych malarią

(Infected Red Blood Cells, IRBC )

i erytrocytów sierpowatych,

Bierze udział w rozpoznawaniu i fagocytozie apoptycznych neutrofili,

Fagocytozie zużytych części nabłonka siatkówki,

„wybuchu” tlenowym monocytów

transportowaniu kwasów tłuszczowych długołańcuchowych,

przesyłaniu informacji do wnętrza komórki,

CD36 - białko przekaźnikowe,

reaguje z białkiem p37 aglutynującym płytki krwi, wywołując agregację płytek.

BUDOWA I ROLA BIAŁKA tau

• białko cytoplazmatyczne,

• funkcja;

polimeryzacja tubuliny,

stabilizacja mikrotubul.

TAUOPATIE

• zespoły otępienne związane z nieprawidłową przemianą białka tau

ch. Alzheimera (AD),

otępienie czołowo-skroniowe (FTP),

zespół Downa,

ch.Parkinsona (FTPD-17),

porażenie ponadjądrowe (PSP),

zwyrodnienie korowo-podstawne (CBD)

Tauopatie te mogą mieć podłoże w nieprawidłowej fosforylacji tau w komórkach nerwowych mózgu.

BIAŁKA REGULATOROWE CYKLU KOMÓRKOWEGO

Nobel (2002)

L.Hartwell, P.Nurse, T.Hunt

za odkrycia:

„ głównych regulatorów

cyklu komórkowego”

Proteoliza białek regulatorowych cyklu komórkowego;

UBIKWITYNACJA

białek i ich degradacja w proteasomie.

W komórkach eukariotycznych;

• wiele białek nieprawidłowych,

• b.regulatorowych o krótkim τ_1/2,

ulega degradacji w proteasomie 26S (duży kompleks białkowy o szerokim spektrum aktywności proteolitycznej).

Degradowane białka i peptydy są uprzednio znakowane

UBIKWITYNĄ,

małym (76AA) białkiem globularnym, powszechnie występującym w kaskadowym, zachodzącym przy udziale ATP procesie

UBIKWITYNACJI BIAŁEK

Nobel (2004) w dziedzinie chemii

dla badaczy cyklu komórkowego:

Avram Hershko (Izrael)

Aaron Ciechanover

Irwin A. Rose (USA)

odkryli mechanizm niszczenia białek w

latach 80-tych,

codziennie 5-10% białek naszego organizmu ulega wymianie APOPTOZA

(?) - a co ze „śmieciami”

Degradowane białka znakowane są

UBIKWITYNĄ (76AA),

która przyłącza się ( nawet do 100 cząsteczek) do białka i wędruje do

PROTEASOMU - kompleks E (26S)

(„komórkowa maszyna do utylizacji śmieci”)

uruchamiany przez UBIKWITYNĘ,

która „pasuje jak klucz do zamka”)

powstające peptydy, AA są wykorzystywane do budowy nowych białek,

a UBIKWITYNA przechodzi do cytoplazmy.

MEDYCYNA

brak UBIKWITYNY lub zaburzenia

w jej funkcjonowaniu ma związek

z wieloma chorobami

• stany zapalne,

• nowotwory,

• schorzenia układu nerwowego;

1. ch. Alzheimera,

2. ch. Parkinsona

• mózg - tworzenie złogów w komórkach nerwowych

Degradacja białek bez naznaczenia UBIKWITYNĄ prowadziłaby do całkowitego chaosu i śmierci komórek oraz całego organizmu.

PERSPEKTYWY dalszych badań:

(?) - czego nie wiemy

jak ubikwityna rozpoznaje „chore” białka ?

dlaczego jednak czasem białko naznaczone ubikwityną przeżywa?

68

WĄTROBA

Kwasy tłuszczowe

Acetylo-S-CoA

Ciała ketonowe

CO₂ + H₂O

pirogronian

mleczan

Glukozo-6-fosforan

glikogen

glukoza

---