Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE

Żywe komórki wytwarzają makrocząsteczki (białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), które służą jako składniki strukturalne, katalizatory, hormony, receptory lub magazyny informacji genetycznej. Te makrocząsteczki są biopolime-rami, utworzonymi z jednostek monomerycz-nych lub cegiełek budulcowych. Jednostkami monomerycznymi w kwasach nukleinowych są nukleotydy, w złożonych polisacharydach — po­chodne cukrowe, a w białkach — L-a-amino-kwasy.

Chociaż białka mogą także zawierać poza aminokwasami, dodatkowe substancje (np. hem, cukrowce, tłuszcze), ich trójwymiarową strukturę i właściwości biologiczne warunkuje w głównej mierze rodzaj aminokwasów, kolej­ność, w jakiej łączą się ze sobą w łańcuchu polipeptydowym oraz ich przestrzenne ułożenie,, względem siebie.

Aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje w komórkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektóre biologicznie ważne substancje, które wywodzą się z aminokwasów.

genne) muszą być dostarczane w pożywieniu, ponieważ nasz organizm nie może ich syn­tetyzować w ilościach niezbędnych do pod­trzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdro­wia (dorośli). Metabolizm aminokwasów przy­czynia się do powstania wielu biomedycznie ważnych związków. Na przykład dekarboksyla-cja pewnych aminokwasów prowadzi do po­wstania amin, wśród których cześć pełni ważne funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-a-minomasłowy [GABA]). Liczne choroby są spowodowane nieprawidłowościami transportu aminokwasów do komórek. W pewnych warun­kach może dojść do pojawienia się w moczu znacznej ilości jednego lub wielu aminokwasów — takie stany określa się jako aminoacydurie.

WSZYSTKIE AMINOKWASY ZAWIERAJĄ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE

Aminokwasy zawierają 2 grupy funkcyjne, tj. aminową i karboksylową. W a-aminokwasach obie te grupy połączone są z tym samym (a)

Ryc. 4-1.

kwasu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Niektóre aminokwasy wydają się być zaan­gażowane w przenoszeniu impulsów w układzie nerwowym, czego przykładem są glicyna i kwas glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo-

H

\a

OH

R-C-NHj I COOH

Dwie formy przedstawienia j.-amino-

36 / ROZDZIAŁ 4

atomem węgla (ryc. 4-1). Chociaż w przyrodzie występuje ok. 300 aminokwasów, tylko 20 z nich występuje w białkach (tab. 4-3). Cał­kowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-ami-nokwasów. Należy podkreślić, że białka wszyst­kich form życia — roślin, zwierząt, drobnoust­rojów — zawierają te same 20 aminokwasów. Przyczyną tego jest uniwersalność kodu genety­cznego, co stanie się oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia później (p. rozdz. 30). W skład niektórych białek wchodzą pochodne aminokwasów, utworzone po ich włączeniu w cząsteczkę białka (p. lab. 6-4).

Z wyjątkiem glicyny, dla której R (R — łań­cuch boczny aminokwasu) stanowi atom wodo­ru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki związane z atomem węgla et-aminokwasów są różne. Tetrąędryczne. ułożenie 4 różnych podstawni­ków wokół atomu węgla a (tzw. węgiel asymet­ryczny) nadaje aminokwasom właściwość op-.tyczna. (zdolnośćTjio_ _skręcania . płaszczyzny światła spolaryzowanego). Chociaż pewne ami­nokwasy występujące w białkach są prawo-skrętne, a niektóre lewoskrętne, w pH 7,0 wszystkie mają bezwzględną konfigurację po­równywalną z konfiguracją aldehydu L-glicery-nowego, stąd opisuje się je jako L-a-amino-kwasy.

Ogólne reakcje chemiczne aminokwasów można przewidzieć znając właściwości grup funkcyjnych

Grupy funkcyjne aminokwasów — karbok-sylowa i aminowa — wykazują typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikację, acyla-

RÓWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASÓW

W zależności od pH otaczającego środowiska aminokwas może mieć ładunek dodatni, ujemny lub nie mieć żadnego ładunku

Aminokwasy zawierają co najmniej 2 zjoni-zowanc, słabo kwaśne grupy: —COOH i —NHt- W roztworze obie formy tych grup.

jedna naładowana, a druga obojętna, występują w równowadze protonowej:

R—COOH « R—COO" + H+ H⁺

W równowadze tej R—COOH i R—NH^ re­prezentują związki protonowe lub kwaśne, na­tomiast R—COO~ i R—NH₂ — zasady sprzę­żone (protonobiorców) z odpowiednimi kwasa­mi. Chociaż zarówno R—COOH jak i R NH; są słabymi kwasami, R—COOH jest znacznie silniejszym kwasem niż R—NH_r W pH osocza krwi czy przestrzeni śródkomór-kowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy kar-boksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony karboksyjowe — R—COO~. Przy tych wartoś­ciach pH większość grup aminowych występuje w formie zasocjowanej (protonowej) — R—NH3. Ze względu na przeważającą po­stać zjonizowaną aminokwasów we krwi i więk­szości tkanek, należy przedstawić ich budowę tak, jak na ryc. 4-2A. Należy pamiętać, że struktura B (ryc. 4-2) nie może istnieć w żadnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w którym cofa się jonizacja grupy karboksylowej, znacz­nie słabsza kwaśna grupa aminowa będzie wy­stępować także w formie protonowej. Przy­bliżone wartości pK_a dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynoszą odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszącym 2 jednostki poniżej wartości pK_a, kwas w ok. 99% ma formę protonową. Jeżeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odłącza się zna­cznie wcześniej niż z grupy R—NH 3 • W każdym wystarczająco wysokim pH do utworzenia prze­wagi grupy aminowej R—NH₂ musi być rów­nież obecny jon karboksylowy (R—COO~). Jednakże w wielu reakcjach, poza równaniami równowagi protonowej, stosuje się wzory ami­nokwasów w formie B.

NHj

NH,⁺

II O

8

0-

* Hydroliza = rozerwanie wiązania kowalencyjne­go przy udziale cząsteczki wody.

Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego ami­nokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjo­logicznego (A). Postać B (niezjonizowana) nie występuje w żadnym pH, ale jest często' używana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwa­sów.

AMINOKWASY / 37

Tabela 4-1. Słabo kwaśne grupy aminokwasów występujących w białkach

	Sprzężony kwas	Sprzężona zasada	Przybliżona wartość pK
a-Karboksylowa	R—COOH	R—COO"	2.1 ±0,5
Nie a-kar boksy Iowa (aspara-ginian, glutaminian)	R—COOH	R—COO" f 1 R	4,0 + 0,3
Imidazolowa (histydyna)		r v	6,0
^-Aminowa	R-NH +	R—NH2	9,8 ±1,0
s-Aminowa (lizyna)	R-NH^	R—NHa	10,5
Fenolowa OH (tyrozyna)			10,1
Guanidynowa (arginina)	H NH2 1 11 + R—N—C—NH2	H NH j II R—N—C—NH2	12,5 ■
Sulf hydry Iowa (cystein3)	R—SH	R-S-	8,3

Względną moc słabych kwasów wyrażają wartości pK,

Względną moc słabych kwasów wyraża się przez ich stale dysocjacji K_a lub przez ich pK — ujemny logarytm ze stałej dysocjacji:

Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy którym nie jest on obdarzony żadnym ładunkiem i nie porusza się w polu elektrycznym

Strukturę aminokwasu alifatycznego, takie­go jak alanina, w pH odpowiadającym punk­towi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3.

NrV

W tabeli 4-1 przedstawiono wartości pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasów spotyka­nych w białkach.

Całkowity ładunek (algebraiczna suma wszys­tkich dodatnio i ujemnie naładowanych grup) aminokwasu zależy od pH lub stężenia protonów otaczającego środowiska. Możliwość zmiany ła­dunku aminokwasów i ich pochodnych, przez umiejętne sterowanie pH, ułatwia fizyczny roz­dział aminokwasów, peptydów i białek.

Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. Chociaż jon obojnaczy alani­ny ma grupy obdarzone ładunkiem elektrycznym, nie wędruje w polu elektrycznym.

♦ Dla wygody zapis K_a lub pK_tt będzie stosowany, ^w przypadku aminokwasu z tylko dwiema
lecz opuszczony później w przypisach dotyczących grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma
symboli. niejasności w wyliczeniu pl. Ponieważ wartość

38 / ROZDZIAŁ 4

W mocnym kwasie

(pH ponlżeji); całkowity ladunek= + l

O

B

pH ok. 3; całkowity ładunek = o

pH ok. 6 - ft całkowity ładunek = -1

D

W mocno) zasadzie

(pH powyżej 11);

całkowity ładunek = -2

Ryc. 4-4. Równowagi protonowe kwasu asparaginowego.

pK, (R—COOH) = 2,35 natomiast pK₂ (R—NH*) = 9,69, to punkt izoelektryczny (pl) alaniny wynosi:

2,35+9,69

= 6,02

Pl

Wyliczenie wartości pl dla aminokwasu z do­datkowymi grupami zjonizowanymi, poza tymi związanymi z węglem ot, jest bardziej skom­plikowane. Na rycinie 4-4 przedstawiono różne formy jonowe kwasu asparaginowego. Jakie będzie zatem pH odpowiadające punktowi izo-elektrycznemu dla tego aminokwasu? W po­szukiwaniu pl dla kwasu asparaginowego trze­ba napisać wszystkie możliwe formy jonowe tego związku w kolejności, w której pojawiają się w roztworach — od silnie kwaśnych, poprzez obojętne do zasadowych (porównaj przykład kwasu asparaginowego na ryc. 4-4). Następnie należy rozpoznać formę izojonową, jon oboj-naezy lub obojętny (jak na ryc. 4-4B). Punkt izoelektryczny (pl) jest to pH w środku pomię­dzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych. W omawianym przykładzie:

2,09+ 3,86

2,98

Pl =

Takie rozwiązanie jest również stosowane do obliczania wartości pl aminokwasów z innymi, dodatkowymi grupami dysocjującymi, np. lizy-ny lub histydyny. Po napisaniu wszystkich możliwych form elektrycznie naładowanych aminokwasów zasadowych — lizyny i argininy — należy zapisać, że:

pK₂+ pK₃
P'= «

Wartość pl dla lizyny wynosi 9,7; dla argininy 10,8. Czytelnik powinien umieć określić pl dla histydyny.

Określenie wartości pK po każdej stronie jonu obojnaczego przez sprawdzenie form nała­dowanych, nie ogranicza się do aminokwasów. Można ją stosować do obliczania ładunku cząs­teczki z każdą liczbą grup dysocjujących. Moż­liwość wykonywania takich obliczeń okazuje się bardzo przydatna w laboratorium klinicznym, gdyż pozwala przewidzieć ruchliwość elektro-foretyczną związków w polu elektrycznym i do­brać właściwe bufory do ich rozdziału. Na przykład, w buforze o pH 7,0 można rozdzielić 2 typy cząsteczek: z pl 6,0 i 8,0, ponieważ cząsteczka z pI = 6,0 będzie mieć większy cał­kowity ujemny ładunek przy pH 7,0 niż cząs­teczka z pI = 8,0. Podobne rozważania stosują się do rozdziałów na złożach jonowych zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych polime­rów (np. DEAE-celuloza, żywica Dowex 1),

Rozpuszczalność i temperatura topnienia aminokwasów odzwierciedlają ich charakter jonowy

Obecność elektrycznie naładowanych grup większości aminokwasów przyczynia się do ich rozpuszczalności. W formie jonowej rozpusz­czają się one łatwo w rozpuszczalnikach polar­nych, takich jak woda i etanol, ale nie rozpusz­czają się w rozpuszczalnikach niepolarnych, jak: benzen, heksan i eter. Wysoka temperatura topnienia (punkty topnienia powyżej 200^DC) odzwierciedla ilość energii potrzebnej do poko­nania sił jonowych stabilizujących strukturę sieci kryształów.

AMINOKWASY / 33

Tabela 4-2. Podział L-at-aminokwasów występu­jących w białkach na podstawie względnej polar-ności ich grup R. W grupie niepolarnej jest mała bądź nie ma wcale różnicy w ładunku elektrycznym między regionami, podczas gdy w grupie polarnej różnica ta jest względnie duża

Aminokwasy	Aminokwasy
niepolarne	polarne
Alanina	Arginina
Izoleucyna	Asparagina
Leucyna	Kwas asparaginowy
Metionina	Cysteina
Fenyloa Janina	Kwas glutaminowy
Prolina	Glutamina
Tryptolan	Glicyna
Walina	Histydyna
	Lizy na
	Sery na
	Treonina
	Tyrozyna

PODZIAŁ AMINOKWASÓW WYSTĘPUJĄCYCH W BIAŁKACH NA PODSTAWIE WZGLĘDNEJ POLARNOŚCI ICH GRUP R

Aminokwasy występujące w białkach można podzielić na 2 duże grupy na podstawie poiar-ności grup R. przyłączonych do atomu węgla a. W celu ułatwienia przedstawiania niezwykle długich sekwencji amin o kwasowych niektórych białek, praktykuje się stosowanie jednolitero­wych symboli aminokwasów (tab. 4-3).

Aminokwasy w stanie wolnym lub związa­nym (nie będące składnikami białek) odgrywają ważną rolę w procesach przemiany materii (tab. 4-4 i 4-5). Na przykład ornityna, cytrulina i kwas argininobursztynowy uczestniczą w biosyntezie mocznika, katanie naturalnym występuje po­nad 20 D-aminokwasów. Należą do nich D-alanina i kwas D-glutami nowy ścian komór­kowych niektórych bakterii oraz różne D-ami-nokwasy wchodzące w skład antybiotyków.

Tabela 4-3. L-s-aminokwasy występujące w białkach*

Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z. alifatycznymi łańcuchami bocznymi

Glicyna

Gly [G]

H—CH™COCT

Alanina

Ala [A]

CH₃

Walina

Vaf [V]

,CH—CH—COO"

t

Leucyna

Leu [L]

H,C

X

Izoleucyna

Ile [1]

7>

CH—CB—CGO"

40 / ROZDZSAŁ 4

cd. tab. 4-3

Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH)

Sery na	Ser [S]	CH^CH^rC&O- .---.Li ^łJLJf-
Treonina	Thr[T]	CH,-CH—OH—COCT
		OH *NHj
Tyrozyna	Tyr [Y]	patrz niżej

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki

SH fl^ CH_;—CH₃-CH—COO"

Cysterna*

Metionina

Cys [C]

Met [M]

CH SH

_;CH₃HCOO

O^~Cn3 rwij -^

Aminokwasy z łańcuchem	bocznym zawierającym		grupy kwaśne lub ich amidy •
Kwas asparaginowy	Asp[D]		"OOC—C Hs —CH—COO" t 1L 1 M flfTJ .$.
Asparagina	Asn [N]		HjN-C-CH,-CH—COO" 0 ^H,
Kwas glutaminowy	Glu ! El		"OOC—C H 2—C H3 —CH—COO"
Glutamina	Gin [Q]		H,N—C—CH 2—C H2 ~CH—COO-

Arg [R] Lys [K]

His |h|

Arginina

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe

H—N—CH₂—CH,—CH_?—CH—COO"

I

⁺NH₅

_r

Lizy na

NH,

Histydyna

H_s-CH,—CH,—C H _S-CM—COO"
H₃ ⁺NH,

j I C H,—GH—COO*

AMINOKWASY / 41

cd. tab. 4-3

Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny

-Histydyna	His [H]	patrz	wyżej
Fenyioaianina	Phe {F]	\—/	>—CHj—CH^COO"
Tyrozyna	Tyr[Yl
Tryptofan	Trp[W]		pCH;—ch—cocr
		H

Immokwasy		i 1
Ptoiina	Pro [P]

*. Z wyjątkiem hydroksyl i zyny (Hyl) thydroksyproliny (Hyp), które są włączane w wiązania peptydowe jako lizyna i proiina, a następnie hydroksylowane, swoiste tRNA istnieją dla wszystkich aminokwasów przedstawionych w tej t3be/i. Ich włączanie w białka pozostaje pod bezpośrednią kontrolą genetyczną. ** Cystyna składa się z 2 reszt cystetn połączonych wiązaniem disiarczkowym:

I

"OOC—CH—CH_Z—S—S—CH₂—CH—COO"

NH +

Tabela 4-4. Przykłady oc-aminokwasów nie występujących w białkach, ale spełniających istotną rolę w metabolizmie ssaków

Nazwa po tuczna i systematyczna

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Znaczenie

Homocysteina (kwas 2-amino--4-merkaptoma słowy)

Kwas cysteinosulfinowy {kwas 2-amtno-3-sulfi-nopropionowy)

Homoseryna

(kwas 2-amino-4-hydro-

ksymasłowy)

CH₂— CH_?—CH—COCf
SH ^łNH₃

H₂—CH—COO"

CH₂—C

so t^

CH_S—CH_S OH

Związek pośredni w bio­syntezie metiortiny

Związek pośredni w kata-botizmie cysteiny

Związek pośredni w meta­bolizmie treoniny, aspara-ginianu i metioniny

42 / ROZDZIAŁ 4

cd. tab. 4-4

Nazwa potoczna i systematyczna

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Znaczenie

Ornityna

(kwas 2,5-diaminoamy-

lowy)

C H₂—CH₂—CH₂—bi—COO"

Cytrulina

(kwas2-amtno-5-ureidoa-

mylowy)

I

NH,

Związek pośredni w bio­syntezie mocznika

Kwas argininobursztyno-wy

■NH CH2~™CHj¹¹ "CHj HN—C—NH-

JW.

"COO—CH₂—C—COO*

3—T V—CH,

CH,—

HO

Dopa {3,4-dihydroksyfe-nyloalanina)

3-Monojodotyrozyna

HO

I

Prekursor meianiny

Prekursor hormonów tar­czycy

3,5 - D i j od oty r ozy n a

HO

-CH,

3,5,3'-Trijodotyronina (T₃) .

jw.

Tyroksyna (3,5,3',5'-tetra-jodotyronina; T4}

HO

CH,

jw.

AMINOKWASY / 43

Tabela 4-5. Przykłady nie a-aminokwasów ważnych dla metabolizmu ssaków
Nazwa potoczna i systematyczna	Wzór strukturalny	Znaczenie
B-alanina	CH2—CH2—COO"	Składnik koenzymu A i witaminy
(kwas 3-aminoproprionowy)	[	pantoteiny
	^+ NH3
Tauryna	CH2—CH2—SO3"	Występuje w żółci w połączeniu
{kwas 2-amtnoerytosu)fonowy)	1 1	z kwasami żółciowymi
Kwas y-aminomasłowy (GA8A)	On2—v*r12—^rl2—UUU	Neuroprzekażnik powstający z
(kwas 4-aminomasłowy)		glutaminianu w tkance mózgo-
		wej
Kwas fi-aminuizumasłowy	H3N+—CH2—CH—COO"	Końcowy produkt katabolizmu
(kwas 2-metylo-3-aminopropio-		pirymidyny, występujący w mo-
nowy)	ĆH3	czu niektórych osób

WŁAŚCIWOŚCI POSZCZEGÓLNYCH AMINOKWASÓW ZALEZĄ ÓD ICH GRUP R PRZY ATOMIE WĘGLA a

Glicyna, najmniejszy aminokwas, może „do­pasować się" łatwo w obszary trójwymiarowej struktury białek, niedostępne dla innych amino­kwasów i występuje w obszarach, w których łańcuchy peptydowe ulegają silnemu zwinięciu.

Alifatyczne grupy R jłaniny, waliny, leucyny jjzoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenylo-ajaniny, tyrozyny i tryptofanu są hydrofobowe i ta właściwość ma ważne znaczenie w uporząd­kowaniu cząsteczek wody w białkach, w bezpo­średnim sąsiedztwie tych grup. Te aminokwasy są charakterystyczne przede wszystkim dla wnę­trza łańcuchów białek cytozolowych.

Naładowane grupy R aminokwasów zasado­wych odgrywają kluczową rolę w utrzymywa­niu swoistej konformacji białka przez tworzenie wiązań typu soli. Przerwanie i odtworzenie wiązań typu soli towarzyszy utlenowaniu i od-tlenowaniu hemoglobiny {p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naładowa­nymi grupami R uczestniczą w układach „prze­kazywania ładunku" (ang, „charge relay"). które przesyłają ładunki na znaczne odległości podczas katalizy enzymatycznej. Histydyna po­nadto pełni wyjątkową i ważną funkcję w katali­zie enzymatycznej, gdyż wartość pK jej formy protonowej układu imidazolowego dopuszcza w pH 7,0 działanie jej jako katalizatora zasado­wego lub kwasowego.

Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny i pierwszo rzędowa grupa tioalkoholowa (—SH) cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofi-lowymi, których funkcja jest ważna dla katali­zy. Z kolei drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofiio-wym, aczkolwiek nie jest znany jej udział w ka­talizie. Dodatkowo, poza katalityczną rolą gru­py —OH w przypadku seryny i tyrozyny, odgrywa ona rolę w regulacji aktywności nie­których enzymów, których aktywność katality­czna zależy od stanu ufosforylowania reszt serylowych lub tyrozylowych.

6-1

⁵"

Tryptofan

L

u

I

<3

I |3H

1-

<H

Fenyioalanlna

"r- 1 ^ 1 1 r

240 260 280

DłusjoSć fali [nm|

Ryc. 4-5. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny
i fenyloalaniny.

44 / ROZDZIAŁ 4

Aminokwasy nie absorbują światła widzial­nego (tj. są one bezbarwne) i, z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych: tryptofanu, ty­rozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absor­bują światła nadfioletowego o długości powyżej 240 nm. Jak przedstawiono na ryc. 4-5 więk­szość światła nadfioletowego o długości fali po­wyżej 240 nm, absorbowanego przez białko, pochłania zawarty w nim tryptofan.

Ryc. 4-7. Fluorescamma.

REAKCJA Z NINHYDRYNĄ LUB FLUORESCAMINĄ SŁUŻY DO WYKRYWANIA AMINOKWASÓW

Ninhydryna (ryc. 4-6). Powoduje oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów, w wyniku cze­go powstają CO_Z, NH₃ i atdehyd uboższy o jeden atom węgla w porównaniu z macierzys­tym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, two­rząc niebieski kompleks, który absorbuje świat­ło o długości 570 nm. Natężenie barwy niebies­kiej powstałego kompleksu stanowi podstawę ilościowej metody oznaczania aminokwasów, za pomocą której można wykryć mikrogramowe ilości aminokwasów. Aminy, inne niż a-amino-kwasy, także reagują z ninhydryna, tworząc barwny niebieski kompleks, ale bez tworzenia CO₂.

Powstawanie CO? wskazuje zatem na obec­ność a-aminokwasów. Peptydy i NH$ reagują także z ninhydryna, lecz znacznie wolniej niż a-aminokwasy.

Pro lina i 4-hydroksyprolina tworzą z ninhyd­ryna kompleks o barwie żółtej.

RÓŻNORODNOŚĆ TECHNIK ROZDZIAŁU AMINOKWASÓW

Chromatografia

We wszystkich rodzajach chromatografii czą­steczki rozdzielają się między fazę stacjonarną a ruchomą (tab. 4-6). Rozdział zależy od względ­nej tendencji cząsteczek mieszaniny do ich silniej­szego wiązania się z jedną z tych faz. Chociaż przedstawione techniki rozdziału dotyczą głów­nie aminokwasów, ich zastosowanie nie ograni­cza się tylko do tych cząsteczek.

Tabela 4-6. Relacje zachodzące między fazami w chromatografii

Typ chromatografii	Faza stacjonarna	Faza ruchoma
Chromatografia po­działowa na stałych sorbentach; filtracja żelowa Chromatografia jo­nowymienna Chromatografia po­działowa między cienką warstwą cie­kłego złoża i prze­pływającym gazem	Ciekła Stała Ciekła	Ciekła Ciekła Gazowa

Ryc. 4-6. Ninhydryna.

Fluorescamina (ryc. 4-7). Jest czulszym związ­kiem, za pomocą którego można wykryć nano-gramowe ilości aminokwasów. Podobnie jak ninhydryna, fluorescamina tworzy kompleks z aminami innymi niż a-aminokwasy.

Chromatografia bibułowa

Chromatografia bibułowa, pomimo wypiera­nia jej przez bardziej wyrafinowane metody, wciąż znajduje zastosowanie w rozdziałach ami­nokwasów. Próbki aminokwasów nanosi się na pasek bibuły, w określonym punkcie, w odległo­ści 5 cm od jego końca. Następnie pasek zawie­sza się w szczelnym naczyniu (komorze) zawie­rającym rozpuszczalnik (ryc, 4-8).

AMINOKWASY / 45

TnT

Kierunek

Pasek iblbutyj

wędrówki

rozpuszczalnika

¹ Naczynia 2 rozpuszczalnikiem

Ryc. 4-8. Chromatografia bibułowa zstępująca (przekrój komory).

_ Start Cys

His Arg Ser

Glu

Ala'

Tvr

Met

Rozpuszczalniki stosowane do rozdzielania aminokwasów są mieszaninami wody, alkoholi, kwasów lub zasad. Bardziej polarne składniki rozpuszczalnika wiążą się z celulozą i stanowią fazę stacjonarną, zaś mniej polarne składniki — fazę ruchomą. Tak jest w klasycznej chroma­tografii podziałowej. W chromatografii podzia­łowej w odwróconej fazie polarności fazy rucho­mej i stacjonarnej są odwrócone (np. przez

Kierunek	*
wędrówki		■
rozpuszczalnika
Lys Asp Glv	•	1
Thr
		1
Pro
Val	i	i
Trp
Phe Leu		#

Ryc. 4-9. identyfikacja aminokwasów występują­
cych w białkach. Po rozdziale mieszaniny amino­
kwasów techniką chromatografii bibułowej zstępu­
jącej w układzie n- butanol -kwas octowy-woda
plamy aminokwasów wywołano za pomocą nin-
hydryny.

pierwotne zanurzenie bibuły w roztworze sili­konu). Chromatografię podziałową w odwró­conej fazie stosuje się do rozdziału niepolarnych peptydów lub lipidów, niepolarnych związków, takich jak niektóre aminokwasy. Wyróżnia się 2 typy technik stosowanych do rozwijania chro-mato gram u; chromatografię wstępującą i zstę­pującą, tj. odpowiednio gdy rozpuszczalnik wędruje przez bibułę z naniesioną próbą w górę lub w dół. Kiedy rozpuszczalnik zbliży się prawie do końca bibuły, wtedy wyjmuje się ją, suszy i przeprowadza reakcję identyfikacji ba­danych związków (w przypadku aminokwasów przeprowadza się reakcję z 0,5% roztworem ninhydryny w acetonie, po czym ogrzewa przez kilka minut w temp. 90—110°C. Aminokwasy z dużymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) wędrują dalej niż te z krótszymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Pro, Ala, Gly) lub z polarnymi łańcuchami bocznymi (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (p. ryc. 4-9). Odzwierciedla to większą względną rozpuszczalność cząsteczek polarnych w hydrofilowej fazie stacjonarnej, zaś cząsteczek niepolarnych w rozpuszczal­nikach organicznych. W grupie cząsteczek nie­polarnych (Gly. Ala, Val, Leu) zwiększeniu długości niepolarnego łańcucha bocznego to­warzyszy zwiększenie ruchliwości tych cząste­czek.

Stosunek odległości przebytej przez amino­kwas do odległości przebytej przez czoło roz­puszczalnika, mierzonych od miejsca naniesie­nia mieszaniny aminokwasów, opisuje się jako wartość R_f tego aminokwasu (względną ruch­liwość). Wartości R_f dla danego aminokwasu zmieniają się w zależności od warunków do­świadczalnych, np. od stosowanego rozpusz­czalnika. Chociaż możliwa jest próbna iden­tyfikacja aminokwasu za pomocą samej warto­ści Rf, bardziej wskazane jest rozdzielenie chro­matograficzne nieznanej mieszaniny amino­kwasów równocześnie ze znanymi aminokwa­sami wzorcowymi. Wobec tego ruchliwość mo­że być porównana do ruchliwości wzorców (np. jako R_Ai_a raczej niż jako R_f). Ruchliwości, przedstawione jako względne wobec standar­dowych, różnią się mniej niż wartości Rf z kolej­nych doświadczeń.

Zawartość aminokwasów można oznaczyć ilościowo, wycinając każdą plamę i eluując odpowiednim rozpuszczalnikiem, a następnie przeprowadzając analizę kolorymetryczną (z ninhydryną). W innym rozwiązaniu bibułę

46 / ROZDZIAŁ 4

spryskuje się ninhydryną, a natężenie barwy wyeluowanych plam mierzy się w fotometrze z zapisem natężenia światła przepuszczanego lub odbitego.

W innej technice — chromatografii bibułowej dwuwymiarowej, próbkę nanosi się w jednym rogu kwadratowego arkusza bibuły i rozdziela w odpowiednio dobranej mieszaninie rozpusz­czalników. Po wysuszeniu i usunięciu rozpusz­czalnika arkusz obraca się o 90°C i rozdziela w innej mieszaninie rozpuszczalników (ryc. 4-10).

Butanol-kwas octowy-woda (4:1:5).

Ryc. 4-10. Dwuwymiarowa chromatografia ami­nokwasów (przerysowano, nieznacznie zmodyfi­kowano z: Levy A. J. i Chung D.: Two-dimensional chi-omatographyof aminoacidsonbuffered papers. Aria!. Chem. 1953; Copyright ©1953 by American Chemical Society; zamieszczono za zgodą).

— ATLC), nie przypomina chromatografii bi­bułowej i opiera się na innych zasadach. W tej technice rozpuszczalnik (który nie musi być dwuskładnikowy lub bardziej złożony) eluuje składniki próby z zaadsorbowanych miejsc na aktywowanym sorbencie, takim jak prażony żel krzemionkowy. Metoda ATLC znajduje zasto­sowanie do rozdziału związków niepolarnych, takich jak lipidy, i stąd nie jest przydatna dla części aminokwasów i większości peptydów.

Chromatografia jonowymienna

Całkowita analiza reszt aminokwasowych po hydrolizie łańcucha peptydowego wymaga na ogół automatycznej chromatografii jonowymien­nej. Pełen rozdział, identyfikacja i oznaczenie ilościowe hydrolizatu białkowego nie trwa dłu­żej niż 3 h. W metodzie Moore'a i Steina stosuje się kolumny (krótką i długą) zawierające formę Na⁺ sulfonowanej żywicy polistyrenowej. Kie­dy kwaśny hydrolizat w pH 2,0 zostanie nanie­siony na kolumny, aminokwasy wiążą się z jo­nem Na+ wymieniacza kationowego. Następnie kolumny eluuje się cytrynianem sodu w zaprog­ramowanych warunkach pH i temperatury. Krótką kolumnę eluuje się jednym buforem, zaś długą — dwoma, W eluatach z kolumn wywołu­je się reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym, a odczyty natężenia barwy przeprowadza się w kolorymetrze przepływowym. Dane są rejest­rowane na katodowej lampie obrazowej ze sprzężonym komputerowym odczytem integ­racji powierzchni pól rozdzielonych aminokwa­sów (ryc. 4-11).

570 nm

Chromatografia cienkowarstwowa

Wyróżnia się 2 odrębne klasy chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin-layer chromato-graphy; skrót — TLC). Pierwsza — chromato­grafia cienkowarstwowa podziałowa (ang. par-tition thin-layer chromatography: skrót — PTLC), w pełni przypomina chromatografię bibułową podziałową. W metodzie PTLC wy­korzystuje się te same układy rozpuszczalników i sposoby identyfikacji badanych związków, co w chromatografii bibułowej. Natomiast bibułę zastępuje płytka pokryta cienką warstwą spro­szkowanej celulozy lub innego względnie obo­jętnego złoża. Możliwy jest również wariant PTLC w odwróconej fazie.

Z kolei druga klasa — adsorpcyjna TLC (adsorption thin-layer chromatography; skrót

Ryc. 4-11A

AMINOKWASY / 47

570 nm

-pH 3,25-

-pH 4,25-

55 °C

c. 4-11. Automatyczna analiza kwaśnego hydrolizatu białkowego na kolumnach Dowex 50 Moore'a iSteina (w temp. 55°C). A; Do rozdziału aminokwasów zasadowych użyto krótkiej kolumny (5,0x0,9 cm), stosując elucję roztworem o pH 5,28; potrzebny czas = 60 min. B: Do rozdziału aminokwasów obojętnych i kwaśnych użyto dłuższej kolumny (55 x 0,9 cm), stosując elucje najpierw buforem o pH 3,25, a potem buforem o pH 4,25. Norleucynę użyto jako substancję wzorcową {tzw. wzorzec wewnętrzny). Amino­kwasy zasadowe pozostają związane na kolumnie; potrzebny czas =180 min. Eluowane próbki reagują z odczynnikiem ninhydrynowym, a pomiar ich gęstości optycznej jest dokonywany przy długości fal światła 570 nm i 440 nm. Przy 440 nm wykrywa się jedynie prolinę i hydroksyprolinę. Oś rzędnych — gęstość optyczna w skali logarytmicznej: oś odciętych — czas w min (reprodukowano za zgodą: Prof. ET. Mert, Pardue University).

Elektroforeza wysokonapięciowa

Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high--voltage electrophoresis; skrót — HVE) roz­dzielająca aminokwasy, polipeptydy i inne am-folity (cząsteczki, których ładunek całkowity zależy od pH otaczającego środowiska) w polu prądu stałego ma wiele zastosowań w bioche­mii. W analizie aminokwasów najczęściej uży­wanymi nośnikami są arkusze bibuły albo cien­kowarstwowe płytki powleczone sproszkowaną celulozą. W rozdziałach wielkocząsteczkowych polipeptydów i białek używa się usieciowanego żelu poliakryloamidowego. W analizie oligo-merów nukleotydowych wykorzystuje się głów­nie 2 złoża — agarozę i żel poliakryloamidowy.

Rozdział amfolitów, umieszczonych w polu elektrycznym o napięciu 2000—5000 V w ciągu 0,5—2 h, zależy od ich ładunku elektrycznego i masy cząsteczkowej, W przypadku cząsteczek obdarzonych jednakowym ładunkiem elektry­cznym, szybciej będą wędrować cząsteczki o mniejszej masie. Ładunek elektryczny jest jednak ważniejszym czynnikiem w określeniu stopnia osiągniętego rozdziału. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie amino­kwasów, małocząsteczkowych polipeptydów,

niektórych białek, nukleotydów i fosfocukrów. Próbki nanosi się na nośnik zwilżony buforem o odpowiednim pH i łączy się ten nośnik ze zbiornikami buforu za pomocą bibułowych łączników, a cały układ z bibułą można przy­kryć płytą szklaną lub zanurzyć w chłodziwie węglowodorowym. Po podłączeniu prądu cząs­teczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują w roztworze o wybranym pH w kierunku kato­dy, a cząsteczki z ładunkiem ujemnym — w kie­runku anody. W celu zidentyfikowania roz­dzielonej próby elektroforegram wybarwia się odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, peptydy), bromkiem etydyny i ogląda w świetle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wy­bór pH „narzucają" wartości pK grup zjonizo-wanych cząsteczek w mieszaninie.

NAJWAŻNIEJSZĄ REAKCJĄ AMINOKWASÓW JEST TWORZENIE WIĄZANIA PEPTYDOWEGO

W zasadzie tworzeniu wiązania peptydowego towarzyszy odłączenie 1 mola wody, powstają­cego z grupy a-aminowej jednego aminokwasu

48 / ROZDZIAŁ 4

Alanina

— NH

OH + H

O

Walina

H_SO

hydrolizy wiązania peptydowego. Aby prze­prowadzić biosyntezę wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami, najpierw musi ulec aktywacji grupa karboksylowa. Chemicz­nie grupę karboksylowa można przekształcić w chlorek kwasowy. W przyrodzie, aktywację zapoczątkowuje kondensacja z ATP (p. rozdz. 30).

CHpeptyd; alanyiowaltna (Ala-Val)

Ryc. 4-12. Aminokwasy połączone wiązaniem peptydowym (obszar zaciemniony).

i grupy oc-karboksylowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-12). Reakcja ta nie przebiega jednak tak, jak przedstawiono na tej rycinie, gdyż stała równowagi reakcji jest przesunięta w kierunku

PIŚMIENNICTWO

Barrett GC: Chemistry and Biochemistry ofthe Amino

Acids. Chapman & Hal], 1985. Davies JS: Amino Acids and Peptides. Chapman

& Hali. 1985. Gehrke CW, Kuo KCT, Zumwalt RW, Kenneth CT:

Amino Acid Analysis by Gas Chromatography.

3 vols. CRC Press, 1987. Hancock WS: Handbook ofHPLCfor the Separation

of Amino Acids, Peptides. and Proteins. 2vols. CRC

Press, 1984. Hugli TE: Techniaues in Protein Chemistry. Academic

Press, 1989. Rattenbury JM: Amino Acid Analysis. Halstead Press,

1981.

Peptydy

5

Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE

Po połączeniu grup aminowych i karbo-ksylowych aminokwasów z utworzeniem wią­zań peptydowych, składowe ami no kwasowe określa się resztami aminokwasowymi. Peptyd składa się z dwóch lufo więcej reszt aminokwaso-wych połączonych wiązaniami peptydowymi. Pe­ptydy zawierające więcej niż 10 reszt amino-kwasowych nazywa się polipeptydarni,

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Peptydy są związkami budzącymi szerokie zainteresowanie, szczególnie w endokrynologii. Wiele hormonów jest peptydami i mogą być podawane chorym w celu korygowania ich niedoborów (np. wstrzyknięcia insuliny chorym na cukrzycę). Pewne antybiotyki są peptydami (np. walinomycyna i gramicydyna A), a nielicz­ne z nich substancjami przeciwnowotworowymi (np. bleomycyna). Szybka synteza chemiczna i technologia rekombinacji DNA ułatwiły pro­dukcję znacznych ilości hormonów peptydo­wych. Wiele z nich występuje w organizmie w stosunkowo małych stężeniach, co utrud­nia możliwość ich wydzielenia w ilościach wy­starczających do leczenia. Ta sama technolo­gia pozwala syntetyzować inne peptydy, dostęp­ne z naturalnych źródeł w niezwykle małych ilościach (np. niektóre peptydy i białka wiruso­we), wykorzystywane do produkcji szczepio­nek.

PEPTYDY TWORZĄ SIĘ Z L-k-AMINOKWASÓW POŁĄCZONYCH WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI

Na rycinie 5-1 przedstawiono tripeptyd utwo­rzony z reszt aminokwasowych alaniny, cys-teiny i waliny. Należy odnotować, że tripeptyd składa się z 3 reszt aminokwasów ych. ale nie zawiera 3 wiązań peptydowych. Umownie struk­turę peptydu zapisuje się rozpoczynając od lewej strony N-końcową resztą aminokwasów ą (z wol­ną grupą a-aminową), a kończąc po prawej stronie C-końcową resztą aminokwasową (z wol­ną grupą a-karboksylową). Przedstawiony pep­tyd ma jedną wolną grupę a-aminową oraz 1 wolną grupę a-karboksylową. Jednakże w nie­których pepiydach końcowe grupy aminowe lub karboksylowe mogą być podstawione (np. N-formyloamina lub amid grupy karboksylo-wej) i w ten sposób nie są wolne.

Alanyb- cysteinylo- walina

Ryc. 5-1. Wzór strukturalny tripeptydu {wiązania peptydowe zaciemniono).

4 — Biochemia

Prosta metoda przedstawiania wzorów strukturalnych peptydów

Aby w prosty sposóbzapisać wzór struktural­ny peptydu, w pierwszej kolejności rysuje się jego „szkielet" z połączonych grup oc-NHU

50 / ROZDZIAŁ 5

i a-COOH oraz atomów węgla a. Następnie wpisuje się w odpowiednie miejsca łańcucha atomy węgla a (patrz niżej). Należy więc:

1. Narysować szkielet (zyg-zag) i dodać N-końcową grupę aminokwasową:

2. Dopisać atomy węgla a, grupy a-karbok-sylowe i a-aminowe:

G!u-A!a-Lys-Gly-Tyr-Ala E A K G Y A

Ryc. 5-2. Przykład zapisu jednoliterowymi i trój-I(terowymi symbolami reszt aminokwasowych przedstawiający pierwszorzędową strukturę heksa-peptydu, zawierającego, jako N-końcowy amino­kwas, kwas glutaminowy (Glu, E) oraz jako C-końcowy — alaninę {Ala, A).

COO-

⁺H₃N

3. Dopisać właściwe grupy R i atomy wodo­ru a do atomów węgla a:

SH
0 H CH,

H

00

II V -

H \ H

O H

CH,

CH,

Kolejność aminokwasów określa strukturę pierwszorzędową peptydu

Pierwszorzędową strukturę peptydu określa liczba, budowa chemiczna i kolejność (sekwen-

Symboli trój- i jednoliterowych używa się w zapisie aminokwasów w peptydach

Ponieważ polipeptydy (białka) mogą zawie­rać 100 i więcej reszt aminokwasowych, w celu przedstawienia ich struktury pierwszorzędowej (ryc. 5-2) stosuje się symbole albo trój- albo jednoliterowe (tab. 4-3, kolumna 2).

Glu-Lys-(A!a,Gly,Tyr)-His-Ala

Ryc. 5-3. Przykład heptapeptydu, zawierającego fragment o niepewnej strukturze pierwszorzędowej (w nawiasie).

Zapis struktury pierwszorzędowej za pomocą trójliterowych symboli, połączonych kreskami reprezentującymi wiązania peptydowe, jest zro­zumiały i jednoznaczny. Kreski zwykle pomija się w zapisie sekwencji peptydów przy użyciu symboli jednoliterowych. W przypadku niepew­ności w ustaleniu kolejności fragmentu polipep-tydowego, wątpliwą sekwencję reszt aminokwa­sowych umieszcza się w nawiasie i oddziela przecinkami (ryc. 5-3).

Zmiana w pierwszorzędowej strukturze peptydu może zmieniać jego aktywność biologiczną

Podstawienie pojedynczego aminokwasu przez inny, w liniowej sekwencji polipeptydu o 100 lub więcej resztach aminokwasowych, może zmniejszyć lub znieść jego aktywność biologiczną oraz powodować potencjalnie po­ważne następstwa (np. niedokrwistość sierpo-wata). Wiele dziedzicznych wad metabolicz­nych wynika ze zmiany pojedynczego amino­kwasu w określonym białku. Wprowadzenie nowych metod badania struktury białek i DNA przyczyniło się do poszerzenia wiedzy o bio­chemicznych podstawach wielu dziedzicznych chorób metabolicznych.

Peptydy są potielektrolitami, których ładunek zależy od pH otaczającego środowiska

Wiązanie peptydowe (amidowe) nie ma ła­dunku w żadnym ważnym fizjologicznie pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów w pH

PEPTYDY / 51

7,4 towarzyszy utrata jednego ładunku dodat­niego i ujemnego przy utworzeniu jednego wiązania peptydowego. Jednakże peptydy są cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem elektry­cznym w pH fizjologicznym dzięki ładunkom ich grup C- i N-końcowych oraz grup funkcyj­nych występujących w polarnych resztach ami-nokwasowych przyłączonych do atomów węgla a (p. tab. 4-1).

Liczba możliwych konformacji peptydu jest wymuszona siłami niekowalencyjnymi

Polipeptydy mogą wykazywać różną konfor­mację (ułożenie przestrzenne), jednak w roz­tworze przeważa tendencja do niewielkich zmian konformacyjnych. Konformację pepty-dów utrwalają takie czynniki, jak zawada prze­strzenna, oddziaływania kulombowskie, wiąza­nia wodorowe i hydrofobowe (p. rozdz. 6). Tak jak w przypadku białek, do fizjologicznej ak­tywności polipeptydów jest nieodzowna specy­ficzna konformacja.

WIELE MAŁO CZĄSTECZKOWYCH PEPTYDÓW WYKAZUJE AKTYWNOŚĆ FIZJOLOGICZNĄ

Komórki zwierząt, roślin i bakterii zawierają różnorodne małocząs tęcz k owe polipeptydy (3—100 reszt aminokwasowych) o istotnej ak­tywności fizjologicznej. Niektóre z nich, łącznie z większością polipeptydowych hormonów ssa­ków, zawierają tylko wiązania peptydowe, utworzone między grupami a-aminowymi i 7-karboksylowymi, 20 L-a-arninokwasów wy­stępujących w białkach. Jednakże w polipep-tydach mogą również występować dodatkowe, ,,niebiałkowe" aminokwasy, lub też pochodne aminokwasów budujących białka.

Krótki polipeptyd — bradykinina, czy.anik zj32ui£^szaJ3«y.jłapica.e.inięśni^ła<ikicfe — uwal­nia się ze swoistych białek osocza przez proteoli­żę.

Arg-Pro-Pro-Giy-Phe-Ser Pro-Phe Arg Bradykinirta

Glutation (ryc, 5-4). Jest nietypowym tripep-tydem, w którym N-końcowy kwas glutamino­wy wiąże się z cysteiną wiązaniem nie-ot-pep-tydylowym. Jest związkiem niezbędnym do działania niektórych enzymów. Glutation i en-

0

SH CH₂

N I H

CHj I

coo-

CHj H-C-NH_S

coo-

Ryc. 5-4. Giutation (y-glutamylocysteinyloglicy-na).

zym — reduktaza glutationowa — uczestniczą w powstawaniu prawidłowych wiązań disiarcz-kowych w wielu białkach i hormonach polipep­tydowych (p. rozdz. 6).

Antybiotyki jolipeptydowe. Są wytwarzane przez grzyby i zawierają zarówno D- jak ...LLcaminokwasy, a także aminokwasy nie wy­stępujące w białkach. Zalicza się do nich np. tyrocydynę i gramicydynę S, cykliczne polipep­tydy zawierające D-fenyłoalaninę oraz niebiał-kowy aminokwas — ornitynę. Należy podkreś­lić, że wymienione polipeptydy nie są syntetyzo­wane na ry boso mach.

Hormon tyreotropowy (TRH). W tym warian­cie peptydowym N-końcowy kwas glutamino­wy- ulega, cyklizacji do kwasu piro glutamino we-.gOjjiatomiast N-końcowa grupa karboksylowa jjroliny występuje jako amid (ryc. 5-5).

Ryc. 5-5. Piroglutamylohistydyloprolinoamid (TRH).

W niektórych przypadkach polipeptydy ssa­ków w swojej cząsteczce mogą zawierać więcej niż 1 fizjologicznie czynny peptyd, np, (3-lipo-tropina. Ten hormon przysadki pobudza uwal­nianie kwasów tłuszczowych z tkanki tłusz­czowej. W strukturze pierwszorzędowej pMipo-tropiny występują fragmenty łańcucha wspólne dla innych hormonów peptydowych o odręb­nych właściwościach fizjologicznych (ryc. 5-6). Długi polipeptyd jest prekursorem krótszych polipeptydów.

52 / ROZDZIAŁ 5

«DLV»AEK K OrETSXPlTrftYMl €Y HTfYRYW G / S YPYP YKYDl K R

GL TSORLRNGDSPNAG ANOGEGPNALEH S L !_■»

0-Endorflna

...-

y-Endorfina

a-Endorflna

Enkefallna metloninowa

Byc. 5-6. Pierwszorzędowa struktura fMipotropiny. Reszty 41-58 reprezentują hormon pobudzający melanocyty (p-MSH). Reszty 61—91 zawierają sekwencje odpowiadające wskazanym endorfinom.

ZŁOŻONĄ MIESZANINĘ PEPTYDÓW MOŻNA ROZDZIELIĆ PODCZAS ELEKTROFOREZY LUB CHROMATOGRAFII

Chromatografia i elektroforeza wysokonapięciowa (HVE)

Techniki, które jako podstawę rozdziału wy­korzystują ładunek elektryczny, znajdują za­stosowanie zarówno w badaniach polipepty-dów, jak i aminokwasów (p. rozdz. 4). Wartość pK. C-końcowej grupy karboksylowej polipep­tydu jest większa niż grupy a-karboksylowej odpowiedniego aminokwasu (oznacza to, że grupa karboksylowa peptydu jest słabszym kwasem). Odwrotnie, N-końcowa grupa ami­nowa polipeptydu jest silniejszym kwasem (ma mniejszą wartość pK) niż grupa aminowa ami­nokwasu, od którego on pochodzi (tab. 5-1).

Tabela 5-1. Wartości pK glicyny i peptydów glicynowych

9.60 8,17 7,91

Gly

Gly-Gly Gly-Gty-Gly

Filtracja żelowa

W metodzie automatycznego sekwencjono-wania wykorzystuje się niewielką liczbę pep­tydów o długości 30—100 reszt aminokwaso-wych. Jednakże wiek wielkocząsteczkowych polipeptydów może być nierozpuszczalnych, z powodu odsłonięcia w procesie dcnaturacji uprzednio niedostępnych reszt hydrofobowych. Nierozpuszczalnośc polipeptydów można po­konać przez ich rozpuszczenie w moczniku, alkoholach, kwasach organicznych lub zasa­dach, ale czynniki te ograniczają stosowanie technik chromatografii jonowymiennej w ich oczyszczaniu. Okazuje się, że filtrację żelową dużych hydrofobowych peptydów można prze­prowadzić, używając roztworów kwasu mrów­kowego lub octowego w dużych stężeniach (1—4 mol/1).

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa w fazie odwróconej

Skuteczną techniką tv oczyszczaniu wielko­cząsteczkowych, niepolarnych peptydów jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography; skrót — HPLC) na niepolamych nośnikach, z wykorzystaniem polarnych rozpuszczalni­ków. Na rycinie 5-7 przedstawiono 'rozdział bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globi-ny płodowej za pomocą tej techniki. Połączenie

PEPTYDY / 53

o

sie lub solami srebra, natomiast polinukleo-lydów — bromkiem etydyny. Popularną od­mianą elektroforezy jest PAGE w warunkach denaturujących. Białka przed elektroforeza, pod­daje się gotowaniu w odpowiednim buforze, a następnie rozdziela w obecności czynników denaturujących — mocznika lub siarczanu do-decylu sodu (SDS). Ujemny ładunek cząsteczek \ CH₁ - (CH,), _L - SO3") pokrywa białka w stosun­ku 1 cząsteczka SDS na 2 wiązania pcptydowe. ["o „obładowanie" białek ładunkami czyni je silnie ujemnymi (anionami). Późniejszy rozdział białek jest oparty na wielkości ich masy cząs­teczkowej. Metoda SDS-PAGE jest szeroko stosowana do określania masy cząsteczkowej białek przez porównanie ich ruchliwości elekt-roforetycznej z ruchliwością białek wzorcowych o znanej masie cząsteczkowej.

Ryc. 5-7. Profil elucyjny rozdziału bromocyjano-wych fragmentów ludzkiej globiny pfodowej, uzys­kanej metodą HPLC w odwróconej fazie. Przed­stawiono oznaczenia dowolnie numerowanych fra­gmentów ol i 7 łańcuchów (reprodukowano dzięki uprzejmości: J.D. Pearson i wsp._r Deparrment of Biochemistry, Pardue Ur>iversity).

filtracji żelowej i HPLC w odwróconej fazie stosuje się do oczyszczania złożonych mieszanin peptydów, otrzymanych w wyniku częściowego trawienia białek.

Wysokonapięciowa elektroforeza (HVE) na sitach molekularnych

Sączenie molekularne, w połączeniu z roz­działem związków i wykorzystujące ładunek, ułatwia ich rozdział. Oprócz skrobi i agarozy, najczęściej używanym nośnikiem jest usiedowa-ny polimer akryloamidu (CH₂ = CHCONH,,). Podczas elektroforezy w żelu poliakryloamido-wym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis; skrót — PAGE) roztwór białka nanosi się na spolimeryzowany akryloamid, w odpowiednim buforze, uformowany w postaci płytki lub w ru-■rkach. Czynnikiem sieciującym złoże poliak-ryloamidu może być 2—10% roztwór metyłe-no-tó-akryloamidu (CH₂ = CONH)_? - CH₂ lub podobne związki sieciujące. Rozdział nanie­sionych prób, w odpowiednim buforze, doko­nuje się pod wpływem prądu elektrycznego. Identyfikację poiipeptydów po rozdziale elekt­ro foretycznym przeprowadza się za pomocą barwienia żeli błękitem brylantowym Coomas-

PIERWSZY ETAP W OKREŚLANIU STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ PEPTYDU TO POZNANIE JEGO SKŁADU AMIN0KWASOWEG0

W analizie struktury peptydów najpierw przeprowadza się hydrolizę wiązań peptydo-wych łączących aminokwasy. Ponieważ wiąza­nia te są trwałe w roztworach o obojętnym pH, przeprowadza się hydrolizę kwaśną lub zasado­wą. Kataliza enzymatyczna jest stosunkowo mało przydatna do przeprowadzenia pełnej hydrolizy wiązań peptydowych. Każdy typ hyd­rolizy białek przebiega z utratą pewnych reszt aminokwasowych. Metodą z wyboru jest hyd­roliza w zatopionych, odpowietrzonych pro­bówkach w 6 mol/l roztworze HC1 w temp. HO^C. Podczas takiej hydrolizy wszystkie re­szty tryptofanu i cysteiny oraz większość reszt cystynowych ulegają zniszczeniu. W obecności jonów metali dochodzi do częściowej utraty metioniny i tyrozyny. Glutamina i asparagina ulegają deamidacji do kwasów: glutaminowego i asparaginowego. Odzysk seryny i treoniny jest niepełny, a ilość tych aminokwasów zmniejsza się w miarę przedłużania czasu hydrolizy. Nie­które wiązania między resztami aminokwasów obojętnych (Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Iłe-Val) ulegają rozbiciu tylko w ok. 50% po 20 h hydro­lizy. Zwykle przeprowadza się hydrolizę próbek (w powtórzeniach) przez 24, 48, 72 i 96 h, ekstrapolując potem zawartość seryny i treoni­ny do czasu zerowego. Zawartość waliny i izo-ieucyny oznacza się po 96 h hydrolizy. Amino-

5* / ROZDZIAŁ 5

kwasy dikarboksylowe i ich amidy oznacza się razem i przedstawia łącznie jako „Glx" i „Asx". Cysteina i cystyna przechodzą w trwałą w śro­dowisku kwaśnym pochodną (np. kwas cys­ternowy) przed hydrolizą. Hydroliza zasadowa, w czasie której ulegają zniszczeniu seryna, treo-nina, arginina i cysteina, a wszystkie amino­kwasy ulegają racemizacji, jest stosowana do oznaczania tryptofanu. Po hydrolizie prób ich skład aminokwasowy może być oznaczony pod­czas automatycznej chromatografii jonowymien­nej (p. ryc. 4-11) lub HPLC.

Sekwencjonowanie pierwszego białka przeprowadził Fred Sanger, za pomocą odczynnika mającego od tej pory jego nazwisko

-N-CH -COOH

CH-COOH

Minęło już ponad 30 lat od określenia przez Sangera pełnej sekwencji aminokwasowej hor­monu polipeptydowego — insuliny. W meto­dzie Sangera najpierw rozdzielono insulinę na 2 łańcuchy polipeptydowe A i B, po czym poddano swoistemu trawieniu enzymatyczne­mu do krótkich peptydów, zawierających od­cinki sekwencji zachodzących. Następnie za­stosowano związek — i-fluoro-2,4-dinitroben-zen (ryc. 5-8), tworzący pochodne tylko

Ryc. 5-8. Reakcja aminokwasu z 1 -fluoro-2,4--dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera). Od­czynniki nazwano od nazwiska laureata nagrody Nobla (1958), biochemika Fryderyka Sangera, któ­ry zastnsowal go w celu oznaczenia pierwszo-rzędowej struktury insuliny. Odczynnik ilościowo aryluje wszystkie wolne grupy aminowe, dając intensywnie żółto zabarwione 2,4-dinitrofenyloa-minokwasy. Pochodne te łatwo się oznacza iloś­ciowo za pomocą spektrototometru. Oprócz reszt N-końcowych, fluorod(nitrobenzen reaguje także 'z grupami; e-aminową lizyny, imidazolową his-tydyny, hydroksyl ową tyrozyny i grupą SH cysteiny. Ponieważ grupa dinitrofenylowa nie jesi usuwana podczas kwaśnej hydrolizy, stosuje sieją do analizy N-końcowego aminokwasu polipeptydów.

z N-końcowymi resztami aminokwasowymi pe­ptydów, które po hydrolizie usuwano i iden­tyfikowano. Porównanie sekwencji zachodzą­cych pozwoliło Sartgerowi jednoznacznie wyde-dukować sekwencje obydwu łańcuchów insuli­ny. Pomimo że metoda Sangera jest wciąż stosowana, 2 inne techniki zrewolucjonizowały oznaczanie struktury pierwszorzędowej polipe­ptydów (białek). Pierwsza z nich, wprowadzona w 1967 r., to metoda automatycznego usuwania i identyfikowania N-końcowych reszt aminokwa-sowych peptydów, jako ich pochodnych fenylotio-hydantoinowych (degradacja Edmana). Druga — wprowadzona niezależnie przez Sangera oraz Maxama i Gilberta — polega na szybkim sekwencjonowaniu DNA genów kodujących po­szukiwane białko. Obecnie optymalną strategią jest stosowanie obydwu równocześnie. Tech­nika automatycznej degradacji Edmana, choć szybsza w analizie sekwencji peptydów od me­tod Sangera, napotyka trudności i dostarcza wolniej wyników niż metoda sekwencjonowa-nia DNA. Technika sekwencjo no wania DNA nie dostarcza jednak nieomylnych, jednoznacz­nych wyników dotyczących pierwszorzędowej struktury białek. Najpoważniejsze trudności w sekwencjonowaniu genów eukariotycznych są związane z obecnością w ich obrębie in-tronów — sekwencji nukleotydowych nie ule­gających ekspresji w dojrzałym białku. Pomimo to, główna przewaga tej metody polega na stosunkowo łatwej detekcji i sekwencjonowaniu regionów prekursorowych cząsteczek, które mogą „umknąć" wykryciu w technice degrada­cji Edmana (wskutek dojrzewania przed jego wydzieleniem). Metody sekwencjonowania DNA i degradacji Edmana należy traktować jako uzupełniające się. Zrewolucjonizowały one i daleko posunęły naszą wiedzę o pierwszo­rzędowej strukturze białek.

Oznaczanie pierwszorzędowej struktury polipeptydów za pomocą techniki automatycznej degradacji Edmana

Ze względu na fakt, że wiele białek składa się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego, połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki disiarczkowe, pierwszy etap stanowi dysocjacja i rozdzielenie indywidual­nych łańcuchów poiipeptydowych. Czynniki denaturujące (mocznik, chlorowodorek guani-dyny) rozbijają wiązania wodorowe i dysoc-jują niekowalencyjnie połączone polipeptydy,

PEPTYDY / 55

a czynniki utleniające i redukujące rozrywają mostki disiarczkowe (ryc. 5-9). Następnie pep-tydy rozdziela się metodami chromatograficz­nymi.

Wielkocząsteczkowe polipeptydy muszą ulec rozszczepieniu do peptydów o długości nadającej się do automatycznego sekwencjonowania

Aparaty służące do automatycznego sekwen­cjonowania (sekwentatory) analizują skutecz­nie polipeptydy o długości 20—60 reszt amino-kwasowych. Ten fakt wpływa na wybór techniki rozcinania polipeptydów oraz oczyszczania otrzymanych fragmentów. Zmierza się więc do uzyskania niewielkiej liczby dłuższych fragmen­tów (o długości 30—100 reszt aminokwaso-wych). Korzystne jest zatem bardzo swoiste i pełne rozszczepienie łańcucha polipeptydowe-go w określonych miejscach. Takie wymagania spełnia rozszczepienie za pomocą bromocyjanu (CNBr), trypsyny lub o-jodozobenzenu.

=O

O =

CNBr. Reszty cysteiny są najpierw modyfi­kowane przez kwas jodooctowy. CNBr rozcina

Ryc, 5-9. Rozszczepienie łańcuchów poiipepty-dowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomocą czynników utlenia­jących (kwas nadmrówkowy, strona lewa) bądź redukujących (2-merkaptoetanol; strona prawa) prowadzące do utworzenia 2 peptydów — od­powiednio z resztą kwasu cysteinowego lub resztą cysteiny Iową.

wówczas łańcuch polipeptydowy (w większości ilościowo) tylko w miejscach występowania reszt metioninowych, po ich stronie karbok-sylowej. Ponieważ metionina występuje rzadko w polipeptydach, takie rozszczepienie powodu­je powstawanie fragmentów peptyd owych o właściwej długości.

Trypsyna. Trypsyna nacina łańcuchy poh-peptydowe po karboksylowej stronie reszt lizy-ny i argininy. Jeśli reszty lizyny najpierw prze­prowadzi się w pochodne za pomocą bezwod­nika kwasu cytrakonowego (reakcja odwracal­na), w celu zmiany ładunku reszt hzynowych z dodatniego na ujemny, to trypsyna rozszcze­pia tylko reszty argininowe. Wykorzystanie pochodnych reszt argininowych jest mało uży­teczne z powodu stosunkowo dużego „nad­miaru" reszt hzynowych w białkach. Jednakże jest przydatne do kolejnego rozszczepiania CNBr fragmentów.

o- Jodozobenzen. Związek len rozszczepia swoiście i ilościowo miejsca względnie rzadko występujących reszt: Trp-X. Nie wymaga wcześ­niejszej osłony innych reszt aminokwasowych.

Hydroksyloamina. Hydroksyloamina roz­rywa względnie rzadko wiązania: Asn-Gly, cho­ciaż nie w sposób ilościowy.

Proteaza V8. Enzym ze Staphylococcus aureus rozcina peptyd przy resztach Glu-X, z wyraźną wybiórczością w stosunku do reszty X o charakterze hydrofobowym. Wiązanie Glu--Lys nie ulega rozszczepieniu przez tę proteazę. Ta reakcja jest wykorzystywana do kolejnej degradacji CNBr fragmentów.

Łagodna kwaśna hydroliza. W toku takiej hydrolizy ulega rozerwaniu rzadko spoty­kane wiązanie Asp-Pro. 2 lub 3 procesy trawie­nia pierwotnego polipeptydu, przy resztach Met, Trp, Arg i Asn-Gly, połączone z od­powiednio nadtrawionymi powstałymi frag­mentami, zazwyczaj pozwalają określić pełną sekwencję polipeptydu. Oprócz wyjątkowych trudności w oczyszczaniu fragmentów peptydo-wych, oznaczenie pierwszorzędowej struktury polipeptydu można wykonać, dysponując zale­dwie kilkoma jego mikromolami.

Mieszanina peptydów, otrzymana z rozszczepienia polipeptydu, musi być rozdzielona do homogennych peptydów przed ich sek we ncjo no wan i em

Oczyszczanie fragmentów peptydowych przeprowadza się głównie przez ich filtrację

56 / ROZDZIAŁ 5

żelową w kwasie octowym lub mrówkowym, wykorzystując technikę HPLC w odwróconej fazie (ryc. 5-7), albo w toku chromatografii jonowymiennej na fosfocelulozie lub na złożu sulfofenyło-Sephadex w roztworach kwasu or­tofosforowego.

Sekwencjonowanie z zastosowaniem odczynnika i reakcji Edmana

Automatyczna analiza sekwencji aminokwa­sów wykorzystuje fenyloizotiocyjanian (od­czynnik Edmana) i reakcje, w wyniku których usuwana jest N-końcowa grupa aminowa pep-tydu, jako pochodna fenylotiohydantoinowa (reakcja Edmana, ryc. 5-10). Metoda tzw. de­gradacji Edmana polega na kolejnym odłącza­niu reszt am i no kwasowych od aminowego koń­ca peptydu. Główną część reaktora stanowi obracające się naczynie szklane, zapewniające przebieg reakcji na ścianie naczynia w postaci cienkiej warstwy. To ułatwia ekstrakcję i kolej­ne usuwanie rozpuszczalników. W pełni zauto­matyzowanym aparacie można zsekwencjono-wać do 30—40 reszt aminokwasowych w 1 ciągu operacyjnym (w wyjątkowych przypadkach do 60 lub nawet 80 reszt). Aparat jest zaprog­ramowany do wykonywania kolejnych degra­dacji reszt aminokwasowych od N-końca poli-peptydu. Po usunięciu pierwszego N-końcowe-go aminokwasu, wydzieleniu i identyfikacji po­wstaje następna w kolejności N-końcowa po­chodna Edmana, itd. (ryc. 5-10). Pochodne fenylotiohydantoinowe rozdziela się techniką HPLC i identyfikuje na podstawie ich kolejno­ści i miejsca elucji.

Wnioskowanie o pełnej strukturze pier wszo rzędowej po I i peptydu wymaga sekwencjonowania nakładających się peptydów

W przypadku oznaczenia sekwencji reszt aminokwasowych wszystkich uzyskanych CNBr peptydów wciąż nie znana jest informa­cja, dotycząca kolejności ułożenia tych pep­tydów w łańcuchu białkowym. W celu uzys­kania jednoznacznych danych o pierwszorzędo­wej strukturze białka, należy otrzymać i zsek-wencjonować dodatkowe CNBr peptydy, któ­rych N-i i C-końcowe reszty nakładają się. Te dodatkowe peptydy otrzymuje się technikami, które rozrywają białko w miejscach innych niż reszta metioninowa (np. przez trawienie chymo-trypsyną). Jednoznaczne określenie struktury pierwszo rzędowej, przez porównanie sekwencji

NH₃

R'

R' O

Kwas fenylotlohydanloinowy

H⁺, nitro-metan

Fsnylolzotlocyjanlan (odczynnik Edrnana) I peptyd

Fenylotiohydantnina I peptyd krótszą o jedną resztę aminokwasową

Ryc. 5-10. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza resztę aminokwasową (lub N-końcową resztę poli-peptydu) do fenylotiohydantoiny. Fenyloizotiocy-janian reaguje z grupami aminowymi aminokwa­sów i peptydów, co prowadzi do powstania kwa­sów fenylotiohydantoinowych, które po dodaniu kwasu, w rozpuszczalnikach niehydroksytowych, cyklizują do pochodnych fenylotiohydantoino­wych. Reakcję tę wykorzystuje się głównie w celu identyfikacji N-końcowych reszt peptydu w meto­dzie automatycznego sekwencjonowania polipep-tydów.

PEPTYDY / 57

peptydowych, przypomina sposób analogiczny do budowy układanki (ryc. 5-11). W celu umiej­scowienia wiązań disiarczkowych peptydy. z kontrolnych oraz zredukowanych lub utlenio­nych białek, rozdziela się metodą dwuwymiaro­wej chromatografii lub elektroforezy i chroma­tografii (tzw. finger-printing). Identyfikacja za pomocą ninhydryny ujawnia w produkcie tra­wienia białka kontrolnego 2 mniejsze peptydy, zaś w białku, na które działano wymienionymi powyżej czynnikami, 1 nowy peptyd. Mając informację dotyczącą sekwencji tych peptydow, można wyznaczyć w nich położenie wiązań disiarczkowych.

Peptyd Y

Paptyd X

Paptyd Z 1

C —końcowy	N —końcowy
fragment	fragmenl
peptydu X	peptyd u Y

Ryc. 5-11. Nakładające się sekwencje peptydu Z stosuje się w celu stwierdzenia, że peptydy X i Y występują w pierwotnym białku w kolejności X-*Y, a nie Y-»Z.

N

C

SYNTEZA PEPTYDOW METODAMI AUTOMATYCZNYMI

Ryc. 5-12. Schematyczne przedstawienie synte­zy powstającego dipeptydu za pomocą techniki wprowadznnej przez IWerrifielda. Wyjaśnienie sym­boli znajdzie Czytelnik w towarzyszącym tekście.

Rycina 5-12 ilustruje procedurę syntezy dipe­ptydu A -B za pomocą automatycznej, stałofa-zowej techniki Merrifielda, podsumowującej wszystkie reakcje wymagane do zsyntetyzowa-nia peptydu o dowolnej długości. Te etapy syntezy obejmują:

1. Zablokowanie N-końcowego aminokwa­su A (otwarty prostokąt) i aminokwasu B (za­ciemniony prostokąt) za pomocą grupy /-buty-looksykarbonylowej (t-BOC) (■):

O

II (CH₃)—C—O—C—

co prowadzi do utworzenia pochodnych /-BOC-aminokwas A i /-BOC-aminokwas B.

2. Aktywację grupy karboksylowej (-BOC--aminokwas B za pomocą dicykloheksylokar-boimidu(DCC) (A):

N

C = N-C₆H₍

3. Reakcje grupy karboksylowej aminokwa­
   su A (który staje się C-końcową resztą peptydu)
   z zaktywowaną, nierozpuszczalny żywicą poli­
   styrenową ($).

4. Usunięcie grup blokujących z połączeń
   f-BOC-aminokwas A, za pomocą kwasu tri-
   fluorooctowego w temperaturze pokojowej
   (TFA, FjC—COOH).

Uwaga. W praktyce etapy 3 i 4 można pominąć, gdyż żywica z danym ż-BOC-amino-kwasem, połączone wiązaniem estrowym z fe-

58 / ROZDZIAŁ 5

nyloacetamidometylowym (PAM) „łączni­kiem" zakotwiczonym w żywicy polistyreno­wej, są dostępne w sprzedaży.

5. Kondensacje zaktywowanej grupy karbo-
   ksylowej połączenia t-BOC-aminokwas B z
   wolną grupą aminową unieruchomionego ami­
   nokwasu A.

6. Usunięcie blokującej grupy f-BOC za po­
   mocą TFA (p. etap 4).

7. Uwolnienie dipeptydu A—B od cząste­
   czek żywicy przez działanie fluorowodoru (HF)
   w dichlorometanie w temp, — 2°C,

Pierwsze osiągnięcia techniki Merrifielda do­tyczyły syntezy łańcucha A (21 reszt) i łańcucha B (30 reszt) insuliny w ciągu 11 dni oraz enzymu — rybonukkazy trzustkowej z wydajnością 18%. Kolejne jej udoskonalenia skróciły czas syntezy wiązania peptydowego do ok. 1 h i zna­cznie zwiększyły wydajność. Technika Merrifie­lda otworzyła nowe nadzieje nie tylko w bada­niach de novo syntezy białek o określonej struk­turze pierwszorzędowej, lecz także w immuno­logii, do produkcji szczepionek i hormonów polipeptydowych i być może także w leczeniu wybranych wrodzonych wad metabolicznych.

PIŚMIENNICTWO

Allen G: Sequencing of Proteins and Peptides. North

Holland, 1981. Bhwon AS: Protein/Peptide Sequence Analysis: Cur-

rent Methodologies. CRC Press, 1988.

Cantor CR, Schimmel PR: Biophyskal Chemistry, Part I: The Conformation of Macromolecules. Freeman, 1980.

Dayhoff M {editor): Atlas of Protein Seąuence and Structure. Vol 5. National Biomedicai Research Foundation, Washington, DC.

Doolittle RF: Ol" uris and orfs: a Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Seąuences. Univer-sity Science Books. 1987.

Hewick RM, Hunkapiiler MW. Hood LE, Dryer WJ: A gasliquid solid phase peplide and protein seque-nator. J Biol Chem 1981; 256: 7990.

Hunkapiiler MW, Hood LE: Protein sequence analy­sis: automated microseąuencing. Science 1983; 219: 650.

LipmanDJ, PearsonWR: Similar amino acid seąuen­ces: chance or common ancestry?/Mo/Bw/19Sl; 16:9.

Mahoney WC, Smith PK, Hermodson MA: Frag-mentation of proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mechanism and identification of o-iodo-sobenzoic acid as a reactive contaminant that modifies tyrosyl residues. Biochemistry 1981; 20: 443; Methods Enzymol. Vols. 47_; 48, 49, 91 (published continuously).

Meriifield RB: Solid phase synthesis. Science 1986; 232: 341.

Pearson JD et al: Reversed-phase supports fó"r thc resolution of iarge denatured protein fragments. / Chromatogr 1981; 207: 325.

Regnier FE. Gooding K.M: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980; 103: 1.

Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Ulility of the gasphase sequencer for both liąuid- and solid-*phase degradation of proteins and peptides at Iow picomole levels. Anal Biochem 1984; 140: 553.

Białka: struktura i właściwości

6

Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE

Białka to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Granica oddzielająca duże polipeptydy od ma­łych białek przebiega zazwyczaj między masami cząsteczkowymi 8000 — 10 000. Białka proste są zbudowane tylko z aminokwasów. Białka złożo-ee^awierąją dodatkowe związki nieamino-kwasowe, takie jak hern, pochodne witamin, lipidy lub węglowodany. Ten rozdział dotyczy białek prostych. W innych rozdziałach zostaną omówione typowe białka złożone, jak hemowe, glikoproteiny i lipoproteiny, a także właści­wości białek prostych o szczególnie odrębnej strukturze, takich jak kolagen i białka kurcz­liwe.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Białka odgrywają wiodącą rolę w czynności i budowie komórki. W celach diagnostycznych szeroko stosuje się analizę niektórych białek i enzymów krwi. Dobrym przykładem jest ozna­czenie elektroforetyczne stosunku zawartości albumin do globulin osocza, które stanowi integralną część rozpracowania diagnostyczne­go w chorobach wątroby. Analiza lipoprotein oraz immunoglobulin osocza, za pomocą elekt­roforezy oraz innych metod, jest powszechnie stosowana w diagnostyce odpowiednio swois­tych typów hiperlipoproteinemii i zaburzeń od­porności. Prawidłowy ludzki mocz zwykle jest wolny od białek, a więc stwierdzenie znaczącej proteinurii stanowi zazwyczaj ważny sygnał chorób nerek, takich jak różne postacie ich stanów zapalnych.

BIAŁKA SĄ KLASYFIKOWANE W RÓŻNE SPOSOBY W CELU ZILUSTROWANIA RÓŻNORODNYCH WŁAŚCIWOŚCI ICH FUNKCJI STRUKTURALNYCH

Ze względu na brak uniwersalnego, wszech­stronnie zadowalającego systemu klasyfikacji białek, powszechnie stosuje się kilka wzajemnie przeciwstawnych sposobów ich podziału. Wszy­stkie one mają raczej ograniczoną wartość jako pomoc w zrozumieniu wielu kluczowych właś­ciwości białek. Utrzymywanie się w użyciu tych klasyfikacji i terminów — zwłaszcza w labora­toriach klinicznych — zmusza do krótkiej re­fleksji. Poniżej zostaną przedstawione podsta­wowe cechy systemów klasyfikacji, opartych na rozpuszczalności białek, ich kształcie, funkcji, właściwościach fizycznych oraz trójwymiarowej strukturze.

Klasyfikacja na podstawie rozpuszczalności

System klasyfikacji białek oparty na ich roz­puszczalności i rozwinięty w latach 1907—1908 jest nadal stosowany w zawężonym stopniu, zwłaszcza w biochemii klinicznej (tab. 6-1). Rozgraniczenia między klasami nie są przeko­nywające. Wyraźne rozróżnienie, np. miedzy albuminami i globulinami, nie może być prze­prowadzone jedynie na podstawie ich rozpusz­czalności w wodzie lub roztworach soli.

Klasyfikacja na podstawie kształtu

Dwie obszerne klasy białek mogą być wy­odrębnione za pomocą ich stosunku osiowego (długości do szerokości). Białka globularnc, dla których wartość tego stosunku jest mniejsza od 10 i na ogół nie przekracza 3—4, mają łańcuchy polipeptydowe ściśle pofałdowane i zwinięte.

60 / ROZDZIAŁ 6

Albuminy Globuliny

Prolaminy

Histony Skleroprotetny

Tabela 6-1. Klasyfikacja białek oparta na ich rozpuszczalności

Rozpuszczalne w wodzie i roz­tworach soli. Żadnych szcze­gólnych aminokwasów

Słabo rozpuszczalne w wo­dzie, ale dobrze w roztworach soli. Żadnych szczególnych aminokwasów

Rozpuszczalne w 70 80% etanolu, ale nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolut­nym. Wzbogacone w arginine

Rozpuszczalne w roztworach soli (i kwasów nieorganicz­nych*)

Nierozpuszczalne w wodzie ani w roztworach soli. Wzbo­gacone w Gly, Aia, Pro

* Przyp. tłum.

Należą do nich m.in. insulina, albuminy i globu­liny osocza oraz wiele enzymów. Białka włó-kienkowe, dla których wartości stosunków osio­wych są większe niż 10, zawierają odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubo­wo lub w heliks i połączone krzyżowo wiązania­mi kowalencyjnymi lub wodorowymi. Przykła­dami białek włókienkowych są: kerą.tyna, mio-zyna, kolagen i włóknik.

Tabela 6-2. Główne funkcje biafek

Funkcja	Białka (przykłady)
Katalityczna	Enzymy
Strukturalna	Kolagen, elastynar keratyny
Ochronna	Włóknik, immunogiobuliny, interferon
Regulatorowa	Kalmoduiina
Regulacja genowa	Histony, białka represorowe
Regulacja hormonalna	Insulina
Skurcz	Aktyna, miozyna
Transport	Albumina (bilirubina, kwasy tłuszczowe itp.), hemoglobi­na (tlen)Jipoproieiny (różne lipidy), transferyna (żelazo)

Klasyfikacja na podstawie czynności

Zgodnie z ich funkcjami biologicznymi, biał­ka mogą być sklasyfikowane np. jako struk­turalne, katalityczne lub transportowe (tab. 6-2). Białka katalityczne (enzymy), stanowiące większość tych związków, są ujmowane w klasy według typu reakcji, którą katalizują.

Klasyfikacja na podstawie właściwości

fizycznych

Dla białek budzących zainteresowanie medy­czne, wyspecjalizowane systemy klasyfikacji po­zwalają rozróżnić ściśle spokrewnione białka. W powszechnym użyciu są np. 2 układy nazew­nictwa lipoprotein osocza, a 3. jest rozważany. Pierwszy z nich wyodrębnia ot]-, ot₂-, P- i Y-lipo-proteiny na podstawie ich ruchliwości elektro-foretycznej w środowisku o pH 8,6. Lipoprotei-ny są także klasyfikowane pod względem ich zachowania się podczas sedymentacji jako: chy-lomikrony, VLDL, LDL, HDL i VHDL. Po­nadto 6 obszernych klas lipoprotein osocza może być rozpoznanych w zależności od wy­stępowania w nich apoprotein A, B, C, D, E lub F, które z kolei różnicuje się za pomocą kryte­riów immunologicznych.

Klasyfikacja na podstawie struktury trój wy m ia ro wej

Białka mogą być zróżnicowane na podstawie występującej w nich struktury czwartorzędowej lub jej braku (patrz niżej). Ponadto podobieńst­wa w strukturze, wykryte głównie przez krys­talografię promieniami X, dostarczają cennej podstawy do klasyfikacji białek. Na przykład białka łączące się z nukleotydami mają w struk­turze trzeciorzędowej wspólną „domenę wiążą­cą nukleotyd" i mogą być ewolucyjnie spokrew­nione. W miarę rozszyfrowywania dalszych struktur krystalicznych możliwe będzie rozpoz­nanie i ustalenie dodatkowych wspólnych do­men.

PIERWSZORZĘDOWA STRUKTURA

BIAŁEK WYWODZI SIĘ

Z KOWALENCYJNEGO POŁĄCZENIA

L-a-AMINOKWASÓW WIĄZANIAMI

PEPTYDOWYMI

Wprawdzie wiodącą rolę wiązań peptydo-wych w białkach wydedukowano dawno temu, na podstawie wielorakich faktów, to jednak najbardziej przekonywającym dowodem nie-

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 61

zbędności jedynie tych wiązań stalą się pełna synteza chemiczna insuliny i rybonukleazy, wy­łącznie w wyniku połączenia aminokwasów za pomocą wiązań amidowych.

Wiązanie łączące atomy węgla grupy karbonyiowej i azotu w wiązaniu peptydowym ma częściowo charakter wiązania podwójnego

Chociaż peptydy zapisuje się z pojedynczym wiązaniem łączącym atomy a-karboksylu i a-a-zotu, wiązanie węgiel—azot w rzeczywistości ma częściowo charakter wiązania podwójnego (ryc. 6-!). Nie ma tu żadnego swobodnego

O

O

H

C

H H

Ryc. 6-1. Stabilizacja rezonansowa wiązania pe-ptydowego nadaje mu częściowo charakter wiąza­nia podwójnego i stąd sztywność połączenia C-N.

Ryc. 6-2. Wymiary calkowiciewyciągniętegotań-cucha polipeptydowego. 4 atomy w zacienionych obszarach są wspó! płaszczyzn owe (kop la na me) i tworzą wiązanie peptydowe. Niezacienionymi są: atom węgla a, atom wodoru a i grupa a-R danego aminokwasu. Swobodna rotacja zachodzi wokół wiązań łączących węgiel a z azotem a i węglem cc-karbonylowym (białe strzałki). Rozciągnięty łań­cuch poiipeptydowy stanowi więc strukturę pół­sztywną, w której ²/³ atomów jego szkieletu jest utrzymywanych w stałych wzajemnych powiąza­niach płaszczyznowych. Odległość pomiędzy są­siednimi atomami węgla (/wynosi 0,36 nm. Podano również odległości międzyatomowe i kąty pomię­dzy wiązaniami, które nie są równoważne. (Przery­sowano i reprodukowano za zgodą z: L Pauiing, L. P. Corey, H. R. Branson: Proc. Nałl. Acad. Sci. USA 1951:37:205).

obrotu wokół wiązania łączącego atomy C i N, a wszystkie 4 atomy' przedstawione na ryc. 6-1, leżą w tej samej płaszczyźnie (tj. są koplanarne). Przeciwnie, rozległa swobodna rotacja zachodzi wokół pozostałych wiązań szkieletu polipep-tydowego. Te koncepcje są przedstawione na ryc. 6-2, gdzie wiązania obdarzone swobodnym obrotem są okółkowane strzałkami, a współ-płaszczyznowe (koplanarne) atomy znajdują się w obszarach zacienionych. Ta półsztywność ma ważne konsekwencje w uporządkowaniu struk­tury białek powyżej poziomu pierwszego rzędu. W uzupełnieniu do wiązań peptydowych, które tworzą „szkielet" łańcucha polipeptydowego, dodatkowe wiązania kowalencyjne i niekowa-lencyjne przyczyniają się do stabilności polipep-tydów.

Mostki disiarczkowe uformowane przez reszty cysterny tworzą kowalencyjne wiązania w obrębie oraz pomiędzy polipeptydatni niektórych białek

Wiązanie disiarczkowe, utworzone między 2 resztami cysteiny, łączy 2 części łańcucha polipeptydowego za pomocą reszty cystyny. Wiązanie cystynowe jest oporne na warunki powodujące denaturację białka. Kwas nad-mrówkowy (utleniający wiązanie S-S) lub fS-mer-kaptoetanol (redukujący mostki S-S z utworze­niem 2 reszt cysteiny) rozdziela łańcuchy poli-peptydowe połączone wiązaniami disiarczko-wymi bez wpływu na ich strukturę pierwszo-rzędową (ryc. 5-9).

NIEKOWALENCYJNE WIĄZANIA RÓWNIEŻ STABILIZUJĄ CZĄSTECZKĘ BIAŁKA

Trzy główne typy wiązań niekowalencyjnych szczególnie się przyczyniają do utrwalenia stru­ktur białkowych.

Wielokrotne wiązania wodorowe stabilizują ogólną strukturę białek

Wiązania wodorowe. utworzone pomiędzy: resztami w łańcuchach bocznych peptydowo związanych aminokwusówj-iłtomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz między resztami polarnymi na powierzchni bia­łek i cząsteczkami wody, odgrywają ważną rolę w utrzymaniu struktury białek powyżej pierw­szego rzędu (p. niżej: heliks a i struktura P).

62 / ROZDZIAŁ 6

Interakcje hydrofobowe przyczyniają się do stabilizacji wnętrza cząsteczek białkowych

Niepolarne łańcuchy boczne aminokwasów obojętnych w białkach dążą do zasocjowania. Powiązanie nie jest stechiometryczne, wobec tego nie istnieje prawdziwe wiązanie. Tyra nie­mniej ich duża liczba powoduje, że te od­działywania odgrywają znaczącą rolę w utrzy­maniu struktury białek.

Elektrostatyczne oddziaływania wiążą reszty powierzchniowe

w białkach

Wiązania typu soli, czyli elektrostatyczne, tworzą się albo między przeciwstawnie nałado­wanymi grupami w łańcuchach bocznych ami­nokwasów, albo pomiędzy resztami N-i C-końcowymi a innymi ugrupowaniami o przeciwnym ładunku. Na przykład w pH fizjologicznym s-aminowa grupa lizyny dźwiga ładunek netto + 1, zaś nie-a-karboksyl aspara-ginianu i glutamianu — czysty ładunek — 1. Mogą więc one nawzajem oddziaływać elektro-statycznie, stabilizując cząsteczki białka.

Związki denaturujące białka rozrywają w nich wiązania niekowafencyjne, powodując utratę aktywności biologicznej

Denaturacja białka za pomocą takich od­czynników, jak: mocznik, siarczan dodecylu sodu (SDS), umiarkowane stężenie jonów H⁴ lub OH~ rozrywa wiązania wodorowe, hydro­fobowe i elektrostatyczne, z wyjątkiem wiązań kowalencyjnych: peptydowych lub disiarczko-wych.

HELIKS a JEST JEDNYM

Z MOTYWÓW STRUKTURALNYCH

UTRZYMUJĄCYCH

UPORZĄDKOWANE KONFORMACJE

W BIAŁKACH

Odkrycie, że łańcuchy polipeptydowe chara­kteryzują się bardzo uporządkowanymi konfor­macjami, utrzymywanymi przez wiązania wo­dorowe, stało się głównym postępem pojęcio­wym. Wprawdzie istnienie tych bardzo upo­rządkowanych struktur zostało potwierdzone przez krystalografię rentgenowską, jednak było ono najpierw zaproponowane w wyniku roz­ważań teoretycznych.

Skok 0,54 nm (3.6 reszt)

Dane rentgenograficzne wykazały obecność powtarzających się jednostek o długości 0,5—0,55 nm wzdłuż długiej osi a-keratyn wło­sa i wełny. Niestety, żaden wymiar rozciąg­niętego łańcucha poiipeptydowego nie wynosił 0,5—0,55 nm (ryc. 6-2). Tę oczywistą anomalię rozstrzygnęli Pauling i Corey, którzy za­proponowali ukształtowanie łańcucha polipep-tydowego a-keratyny w formie a-heliksu (ryc. 6-3). W strukturze tej grupy R wystają na zewnątrz od centrum heliksu (ryc. 6-4). Na jedenjJsok śruby (zwój a-heliksu) przyj>adajL&-reszt aminokwasowych, a odległość "przebyta przez jeden skręt (inaczej: odległość między

Ryc. 6-3. Przedstawienie helikalnej konfiguracji głównego łańcucha polipeptydowego wokół osi a-heiiksu.

BiAŁKA: STRUKTURA i WŁAŚCIWOŚCI / 63

0,5 r

Ryc. 6-4. Przekrój poprzeczny heltksu a. Łańcu­chy boczne (R) wystają na zewnątrz heiiksu. Pro­mienie van der Waalsa są większe niż wykazano na rycinie, stąd wewnątrz heiiksu prawie nie ma wol­nej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i re­produkowano za zgodą z: Stryer L; Biochemistry, wyd.2, Freeman, 1981, Copyright© 1981 by W. H. Freeman and Co).

zwojami*) wynosi 0,54 nm. Odstęp przypadają­cy na Jedną resztę aminokwasem a wzdłuż osi ct-heliksu wynosi 0,15 nm. Właściwości a-helik-su są następujące:

1. Strukturę cc-heliksu stabilizują miedzy-
   aminokwasowe wiązania wodorowe. Każde
   z nich jest utworzone przez atom H połączony
   z azotem jednego ugrupowania peptydowego
   (NH) i znajdujący się między silnie elektroujem-
   nymi atomami (układami*), tj. wymienionym
   azotem peptydowym oraz tlenem grupy kar-
   bonylowej (ĆO) 4. z kolei reszty aminokwaso-
   wej w strukturze pierwszorzędowej.

2. Każde wiązanie peptydowe uczestniczy
   w wytworzeniu wiązania wodorowego, co za­
   pewnia maksymalną stabilność.

3. Wszystkie atomy azotu peptydowego i tle­
   nu karbonylowego reszt aminokwas owych w
   łańcuchu głównym są zaangażowane w wiąza­
   nia wodorowe, co znacznie zmniejsza hulro-
   filowy (zwiększając hydrofobowy) charakter
   regionu a-helikalnego.

4. Heliks ot formuje się spontanicznie, ponie­
   waż — przy najmniejszym zużyciu energii
   — stanowi najbardziej stabilną konformację
   łańcucha polipeptydowego.

* Przyp. tłum.

Ryc. 6-5. Wiązania wodorowe (kropki} uformo­wane między atomami H i O stabilizują polipeptyd w konformacji a-heltkalnej. (Przedrukowano za zgodą z; Haggis G. H. i wsp. tntroduetion to Motecular Biology. Witey, 1964).

Tabela 6-3. Wpływ różnycfi reszt aminokwaso-wych na formowanie heiiksu a

Heliks a

stabilizują (utrwalają)	destabilizują	kończą (przerywają)
Ala	Arg	Pro
Asn	Asp	Hyp
Cys	Glu
Gin	Gly
His	Lys
Leu	Ile
Met	Ser
Phe	Thr
Trp
Tyr
Val

64 / ROZDZIAŁ 6

5. 
   Prawozwojowy heliks występujący w biał­
   kach jest znacznie bardziej trwały niż lewoskręt-
   ny, gdy resztami są L-aminokwasy.

6. Resztami destabilizującymi heliks są: pro-
   .liną_(w której atom N jest częścią sztywnego
   pierścienia, co uniemożliwia rotację wokół wią­
   zania N C) oraz aminokwasy z naładowanymi
   elektrycznie lub masywnymi grupami R, które
   elektrostatycznie lub fizycznie przeszkadzają
   w uformowaniu heliksu (tab. 6-3).

RÓWNOLEGŁE

I PRZE CiW RÓWNO LEGŁE

POFAŁDOWANE ŁAŃCUCHY

STANOWIĄ DRUGI TYP

ROZPOZNAWALNIE

UPORZĄDKOWANEJ STRUKTURY

Pauling i Corey zaproponowali również dru­gie uporządkowanie struktury białka, tj^jtruk-tury p, czyli pofałdowanej kartki (inaczej: pofał­dowanego łańcucha, pofałdowanego lub „spli-sowanego" arkusza*) (ang. f3-pleated sheet; p — ponieważ to była druga struktura po opisanym najpierw a-heliksie). W heliksie j. łań­cuch polipeptydowy jest zwarty, natomiast w_. strukturze p (inaczej: fałdowej, „harmonij­kowej" lub „dywanowej"*) pozostaje on niemal całkowicie rozciągnięty (ryc. 6-6). Struktura P noslnazwę przeciwrównoległej, gdy sąsiadują­ce łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciw­nych kierunkach (N-koniec jednego łańcucha do C-końca drugiego) (ryc. 6-6); luedy łańcuchy podążają w tym samym kierunku jest ona nazywana równoległą (nie wykazano).

W wielu białkach występują współbieżne i przeciwbieżne regiony struktury p. Może ją formować 2—5 przylegających łańcuchów poli-peptydowych. Na rycinie 6-7 przedstawiono region rybonukleazy, w której 3 odcinki łań­cucha polipeptydowego tworzą strukturę p.

Heliks a jest stabilizowany mostkami wodo­rowymi między wiązaniami peptydowymi, od­dzielonymi od siebie 4 resztami w sensie struk­tury pierwszorzędowej, podczas gdy struktu­rę fS utrwalają wiązania wodorowe między segmentami peptydowymi oddalonymi od siebie w sensie struktury pierwszorzędowej (ryc. 6-7).

Ryc. 6-6. W przeciwrównoległej fałdowej struk­turze p sąsiednie łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach. Wiązania wodorowe między grupami NH i CO sąsiednich łańcuchów stabilizują tę strukturę. Łańcuchy boczne (R) ami­nokwasów znajdują się powyżej i poniżej płasz­czyzny kartki. O atomy węgla; © atomy azotu; O atomy wodoru. (Zmodyfikowano i reproduko­wano za zgodą z: Siryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, Copyright © 1981 by W. H. Freeman and Co.).

ZAKRĘTY p UMOŻLIWIAJĄ POLIPEPTYDOM PRZYJMOWANIE KSZTAŁTÓW GLOBULARNYCH

Polipeptydy z reguły formują zbite masy globularne, muszą więc istnieć możliwości zmiany kierunku łańcucha polipeptydowego. Jednym z nich jest utworzenie ciasnej pętli zakrętu P (inaczej: skrętu p, zwrotu p¹ lub zwrotu typu spinki do włosów*), w której tlen grupy karbonylowej jednej reszty łączy sie wiązaniem wodorowym z wodorem amidowym amino­kwasu oddalonego o 3 reszty do przodu.

Często w zakrętach p występują prolina i gli-cyna. Część struktury przestrzennej (geometrii) zakrętu p jest ukształtowana w prolinie, która bardziej niż inne aminokwasy podlega konfor-

Przyp. tłum.

* Przyp. tłum.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 65

Ryc. 6-7. Cząsteczka rybonukleazy trzustki wołu jest zbudowana z pojedynczego łańcucha 124 reszt połączonego poprzecznie w 4 miejscach za pomocą wiązań disiarczkowych. Region a-heliksu ujęto w kropkowany owal, a region struktury fałdowej zacienione Pozostałe części cząsteczki występują giównie w postaci przypadkowego zwoju. Centrum aktywne enzymu znajduje się w miejscu związania jonu fosforanowego (PO^~). (Zaadoptowano z: Kartha G., Bello J._r Harker D.: Tertiary structure of nbonuclease. Naturę 1967; 213:862) Białko zo-stato w całości z syntetyzowane chemicznie.

macyjnym ograniczeniom. Dla kontrastu mała grupa R. pozwala glicynie działać jako giętki „zawias" między regionami polipeptydu, które­go ugrupowania R sprzyjałyby inaczej bardziej rozciągniętej konformacji.

REGIONY BIAŁEK, KTÓRE NIE SĄ UFORMOWANE W HELIKSY, STRUKTURY p LUB ZAKRĘTY % WYSTĘPUJĄ WTZW. KONFORMACJI „PRZYPADKOWEGO" (NIEPLANOWANEGO) ZWOJU

Znaczne części cząsteczki białkowej mogą występować w konformacji przypadkowego (nieplanowanego) zwoju (ang. random-coil; kłębek statystyczny) (ryc. 6-7), Termin „przy­padkowy" jest niefortunny, ponieważ może bardziej implikować mniejsze biologiczne zna­czenie niż regionów o dużej powtarzalności. Dla funkcji biologicznej regiony przypadkowego zwoju są równie ważne, jak heliks a lub konfor­macja p.

5 — Biochemia

ASPEKTY STRUKTURY BIAŁEK

ROZWAŻA SIĘ POD KĄTEM

4 POZIOMÓW UPORZĄDKOWANIA

Struktura pierwszorzędowa

Strukturę pierwszego rzędu stanowi, jak w przypadku peptydów, kolejność aminokwa­sów w łańcuchu lub łańcuchach polipeptydo-wych oraz umiejscowienie wiązań disiarczko­wych, jeżeli one w tych łańcuchach występują.

Struktura drugorzędowa

Struktury drugiego rzędu, czyli przestrzenne współzależności między aminokwasami zwar­tymi w pierwszorzędowym strukturalnym za­kresie, mogą być regularne (np. heliks a, struk­tura f>) lub przejawiać niewiele tej regularności (np. przypadkowy zwój).

Struktura trzeciorzędowa

Ogólne rozmieszczenie i wzajemne powiąza­nie rożnych regionów lub domen oraz poszcze­gólnych reszt amin o kwas owych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym stanowi trzeciorzę­dową strukturę białka. Wprawdzie rozgranicze­nie pomiędzy strukturą drugo- i trzeciorzędową nie jest wyraźne, struktura trzeciorzędowa wy­raża wzajemne przestrzenne usytuowanie reszt aminokwasowych, które — generalnie — są daleko od siebie w- sensie budowy pierwszego rzędu.

Struktura czwartorzędowa

Białka wykazują strukturę czwartego rzędu, jeżeli składają się z 2 lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami innymi niż kowalencyjne (tj. niepeptydowymi lub disiar-czkowymi*). Siłami stabilizującymi te agregaty są wiązania wodorowe i elektrostatyczne (typu soli) utworzone miedzy resztami aminokwaso-wymi na powierzchniach łańcuchów polipep­tydowych. Takie białka noszą nazwę oltgome-rów, a pojedyncze łańcuchy polipeptydowe je

* Cząsteczka białka nie dająca się, przynajmniej potencjalnie, rozdzielić na podjednostki (związane wiązaniami mekowalencyjnymi) nie ma struktury czwartorzędowej. Przykładami białek bez struktury czwartorzędowej są: rybonukleaza (1 łańcuch) i chy-motrypsyna (3 łańcuchy). Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Morawiecki A. (red.): Nowe polskie słownictwo bio­chemiczne. PWN, 1983, s. 113.

66 / ROZDZIAŁ 6

tworzące określa się jako protomery, monomery lub podjednostki.

Wiele białek oligomerycznych zawiera 2 lub 4 protomery, nosząc odpowiednio nazwy di-merów lub tetramerów. Oligomery zbudowane z więcej niż 4 protomerów są również rozpow­szechnione, zwłaszcza wśród enzymów regula­torowych (przykładem — karbamoilotransfera-za asparaginianowa). Białka oligomeryczne od­grywają szczególną role w regulacji wewnątrz­komórkowej, ponieważ protomery mogą przyj­mować względem siebie różne ułożenia prze­strzenne, co powoduje zmiany we właściwoś­ciach oligomeru.

Niektóre białka tworzą kompleksy wielkocząsteczkowe

Asocjację różnorodnych białek czynnościo­wych, z których każde ma 4 poziomy struktury, w wielofunkcjonalne makromolekularne kom­pleksy spotyka się w transporcie elektronów, biosyntezie kwasów tłuszczowych i metaboliz­mie pirogronianu.

DRUGORZĘDOWĄ

I TRZECIORZĘDOWĄ STRUKTURĘ

BIAŁEK WYZNACZA SEKWENCJA

AMINOKWASÓW W ŁAŃCUCHU

POLIPEPTYDOWYM

Skoro tylko utworzy się łańcuch polipep-tydowy, grupy R aminokwasów kierują swois­tym zwijaniem się poszczególnych jego regio­nów (struktura drugo rzędowa), jak również zasocjowaniem tych regionów (struktura trze­ciorzędowa). Dowodzi tego klasyczne doświad­czenie. Zadziałanie na rybonukleazę łagodnym związkiem redukującym (P-merkaptoetanolem) i czynnikiem denaturującym (mocznikiem lub guanidyną; p. niżej) inaktywuje ją tak, że przyj­muje konformację przypadkowego zwoju. Po­wolne usunięcie czynnika denaturującego i ła­godne ponowne utlenienie, w celu rekonstrukcji wiązań S—S, prowadzi do niemal kompletnego odtworzenia aktywności enzymatycznej. Nie jest więc niezbędne postulowanie niezależnej ge­netycznej kontroli uporządkowania struktury białka powyżej poziomu pierwszego, ponieważ budowa pierwszorzędowa wyznacza drugorzędo-wą, trzeciorzędową oraz (kiedy jest obecna) czwartorzędową strukturę (tj. konformację) cząs­teczki białkowej. Rodzimą konformacją białka, takiego jak rybonukleaza, wydaje się być ta,

która jest term o dynamicznie najbardziej stabil­na w danym otoczeniu, np. w hydrofilowym w przeciwieństwie do hydrofobowego.

Struktura białka może być modyfikowana podczas po trans! acyjnego dojrzewania, takiego jak konwersja prcproenzyirm w postać katality­cznie aktywną lub usunięcie peptydowego „lide­ra" (peptydu sygnałowego), który przeprowa­dza poprzez błonę białka przeznaczone „na eksport'⁷.

Stosunkowo słabe oddziaływania odpowiedzialne za utrzymanie drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury białek ulegają łatwo rozerwaniu, powodując utratę ich aktywności biologicznej

Naruszenie rodzimej struktury nosi nazwę denaturacji. Fizycznie denaturacja może być rozpatrywana jako zaburzenia konformacji łań­cucha polipeptydowego, nie wpływające aa jego strukturę pierwszorzędowa. Dla protomeru proces ten może być przedstawiony tak, jak na ryc. 6-8. Dla białka oligomerycznego denatura­cja może obejmować rozdysocjowanie proto­merów, czemu towarzyszą zmiany wich konfor­macji.

Enzym aktywny (natywny)

Dsnaturacja

Enzym nieaktywny (z denaturowany)

Ryc. 6-8. Zobrazowanie denaturacji protomeru.

Biologiczną aktywność niszczą mocne kwasy lub zasady, wysoka temperatura, detergenty jonowe (amfipatyczne), związki chaotropowe (mocznik, guanidyną), ciężkie metale (Ag, Pb, Hg) lub rozpuszczalniki organiczne. Zdenatu-rowane białka są na ogół gorzej rozpuszczalne i ulegają wytrąceniu. Znajduje to zastosowanie w laboratorium klinicznym. Do krwi lub suro­wicy, w której oznacza się zawartość małych cząsteczek (np. glukozy, kwasu moczowego, leków), generalnie najpierw dodaje się kwasu trichlorooctowego, fo sforo wolframowego lub fosforomolindenowcgo w celu strącenia białek.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 67

Po usunięciu ich, przez wirowanie, analizuje się wolny od białek supernatant.

Wrażliwość większości enzymów na ogrzewa­nie, kwasy oraz proteazy, stanowi podstawę wstępnego badania, stwierdzającego czy daną reakcję katalizuje enzym. Ekstrakt komórek, obdarzony aktywnością enzymatyczną, który traci tę właściwość w wyniku zagotowania, zakwaszenia i ponownego zobojętnienia lub zadziałania proteazą, zapewne zawiera jakiś enzym w charakterze katalizatora. Często na denaturację jakiegoś enzymu wpływa obecność jego substratu. Pojawienie się zmiany konfor-macyjnej podczas związania substratu dowodzi, że nowa konformacja może być trwalsza lub mniej trwała niż poprzednia.

PIERWSZORZĘDOWE STRUKTURY BIAŁEK SĄ OZNACZANE METODAMI STOSOWANYMI DO SEKWENCJONOWANIA PEPTYDOW

Z białek złożonych usuwa się najpierw grupy prostetyczne (np. hem), a wiązanie disiarczkowe utlenia się w celu uzyskania liniowych polipep-tydów (p. ryc. 5-9). Techniki stosowane do

Tabela 6-4. Modyfikacja grup a-COOH i a-NH₂ w białkach*

Grupy modyfikowane

a-COOH
Amidowa	N-formylowa	N-ace tyłowa	N -metylowa
		Ala	Ala
Asp		Asp	Asp
Glu
Gly	Gly	Gly	Gly
His
Met	Met	Met	Met
Phe
Pro
		Ser	Ser
		Thr	Thr
Tyr
Val		Val

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational co-valent modification of proteins, Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów cyto­wanej pracy.

Tabela6-5. Zmodyfikowane nie-a-funkcyjne gru­py w białkach*

Grupy modyfikowane

—OH	Mto-et-N
PO3H2	N- metylowa	N dimetylowa	N-trimetylowa
Ser Thr Tyr	Arg His Lys	Arg Lys	Lys

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational co-valent modification of proteins. Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 by the American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów tej pracy.

sekwencjonowania tych polipeptydów przed­stawiono w rozdz. 5. Wprawdzie większość białek 2awiera tylko aminokwasy wymienione w tab, 4-3, pochodne tych reszt również wy­stępują w niektórych białkach (tab. 6-4 i 6-5). Jakkolwiek omówienie metod używanych do zidentyfikowania owych pochodnych amino-kwasowych nie wchodzi w zakres tego roz­działu, jednak ich obecność może komplikować określenie struktury pierwszorzedowej.

Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura białek jest analizowana za pomocą krystalografii rentgenowskiej

Techniki poprzednio stosowane, pozwalające wnioskować o występowaniu w białkach struk­tur helikalnych (np. optyczna dyspersja rotacyj­na, wymiana protonów trytu) zostały wyparte przez rentgenowską analizę krystalograficzną. Promienie X są kierowane na kryształ białka oraz na jedną z jego pochodnych, zawierającą dodatkowo jon ciężkiego metalu. Promienie ulegają rozproszeniu w sposób zależny od gęs­tości elektronów w różnych częściach cząsteczki białkowej. Obrazy zbioru plamek dyfrakcyj­nych, uzyskane na błonie fotograficznej (po jej wywołaniu), są tłumaczone na tzw. mapy roz­kładu gęstości elektronowej, które po ułożeniu jednej na drugiej pozwalają krystalografo­wi skonstruować wiarogodny model dane­go białka. Krystalografia rentgen o graficzna, chociaż czasochłonna, kosztowna i wymagająca specjalistycznego przeszkolenia, ujawniła szcze-

68 / ROZDZIAŁ 6

gólowe i precyzyjne obrazy z usytuowaniem wszystkich aminokwasów w wielu biał­kach. Nie można nie docenić jej ogromnego wkładu do naszego dzisiejszego pojmowania struktury białek.

Wyłoniona technika zobrazowania magnety­cznego rezonansu (ang. magnetic resonance imaging; skrót — MRI) została ostatnio wyko­rzystana do zanalizowania trójwymiarowej struktury małego białka. Technika MRI wydaje się mieć szansę zastosowania do większych białek.

Metody fizyczne stosowane do zbadania czwartorzędowej struktury białek

Badanie czwartorzędowej struktury białka oligomerycznego obejmuje określenie liczby i rodzaju obecnych w nich protomerów, ich położenia względem siebie oraz łączących je oddziaływań.

Zakładając, że oJigomery nie ulegają denatu-racji podczas procedury stosowanej do oznacze­nia masy cząsteczkowej, wiele metod może dostarczyć o niej danych. Te same techniki mogą być wykorzystane do określenia masy cząsteczkowej protomeru po wcześniejszym zdenaturowaniu oligomeru.

Ultrawirowanie, filtracja żelowa i elektroforeza w żelu pozwalają oznaczyć masę cząsteczkową białek

oi izomerycznych

Rozwinięta przez Svedberga technika ultra-wirowania mierzy szybkość sedymentacji* w polu siły odśrodkowej ok. 10⁵ x g. W ostat­nich latach istnieje tendencja, aby zastąpić ją mniej złożonymi metodami.

W pokrewnej technice, tj. ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy, nawarstwia się

białka wzorcowe i badane na gradient stężeń roztworów sacharozy (5—20%), przygotowany w probówce plastikowej. Po ultrawirowaniu przy 10⁵ x g przez kilkanaście godzin (np. w ciągu nocy) przekłuwa się mały otworek w dnie probówki, zbiera jej zawartość w postaci kropel w serii kolejnych małych probówek i oblicza ruchliwości na podstawie względnego położenia białek w gradiencie.

Masę cząsteczkową białka

globu larnego można określić z jego

ruchliwości w sicie molekularnym

Kolumny z żelu Sephadex lub podobne mat­ryce, mające „pory" o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Poszukiwaną masę cząsteczko­wą nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości elucyjnej z objętościami elucyj-nymi białek wzorcowych. Można popełnić duże błędy, jeżeli cząsteczka białka jest bardzo asy­metryczna albo oddziałuje silnie ze związkami, z których zostały wyprodukowane molekularne sita.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) to jeszcze jedna metoda oznaczania masy cząsteczkowej

Białka wzorcowe rozdziela się elektroforety-cznie w 5—15% żelach poliakrylamidowych o zmiennej porowatości, wybarwia się je na obecność białek, generalnie błękitem Coomas-sie lub tzw. srebrem, i masę cząsteczkową oznacza względem ruchliwości elektroibretycz-nej wzorców. Najbardziej powszechne zastoso­wanie tej techniki, PAGE-SDS, pozwala ozna­czyć masę cząsteczkową protomeru w wyniku wcześniejszego zdenaturowania oligomeru (np. przez zagotowanie w roztworze detergentu w obecności p-merkaptoetanolu) i rozdzielenie w żelach zawierających detergent jonowy — siar­czan dodecylu sodu (SDS).

* Matematycznym wyrazem tej szybkości jest tzw. stała sedymentacji S₂₀, tj. szybkość opadania warstwy roztworu białka pod działaniem jednostki siły od­środkowej, wyrażona w jednostkach układu cgs, spro­wadzona do gęstości i lepkości wody w temp. 20°C. Dla większości białek wartości liczbowe stałej sedymentacji wahają się w granicach l,510~¹³ — 2010~"; dla cząsteczki białka o kształcie kulistym jednostka stałej sedymentacji (1I0""¹³) odpowiada masie cząstecz­kowej ok. 16 000. (Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Skar-żytiski B.: Chemia fizjologiczna, t. I, PWRiL, 3956, s. 85).

KOMPLEKSY BIAŁKOWE MOGĄ BYĆ UWIDOCZNIONE PRZEZ ELEKTRONOWĄ MIKROFOTOGRAFIĘ

Uzyskane w mikroskopie elektronowym po­większenia rozmiarów średnicy nawef 100000 razy pozwalają uwidocznić białka o bardzo dużej masie cząsteczkowej, takie jak cząstki

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 69

Tabela 6-6. Czwartorzędowe struktury wybranych	enzymów*
Enzym (oligomer)		Liczba protomerów	Masa cząsteczkowa protomeru
Aminotransferaza asparaginianowa serca kury Syn ta za kwasów tłuszczowych wątroby goiębia Fruktozobisfosfataza wątroby królika		2 2 2" 2**	50 000 230 000 29 000 37 000
Aminotransferaza ornitynowa wątroby szczura Karboksylaza propionylo-CoA serca świni LDH serca, wątroby lub mięśni wołu		4 4 4**	33 000 175 000 35 000
ATPaza mitocriondrrów serca wołu		10	26 0O0
Syntetaza glutaminowa Escherichia coli Karboksylaza acetylo-CoA wątroby kury		12 2** 10**	48 500 4 100 000 409 000

* Zaadaptowano z: Klotz I. M., Langerman N. R., Darnall D. W.: Cłuaternary structure of enzymes, Annu Rev Biochem 1970; 39:25.

** Niezidentyfikowane podjednostek.

wirusów, kompleksy enzymatyczne i białka oligomeryczne.

W tabeli 6-6 podano przykłady liczby oraz mas cząsteczkowych protomerów stanowiących czwartorzędowe struktury wybranych enzy­mów.

PIŚMIENNICTWO

Advances in Protein Chemistry. Academic Press, 1944

to datę, [Annual publicalion.] Celis JE. Bravo R: Two-dimensional Gel Electro-

phoresis of Proteins. Methoiłs and Applications.

Academic Press, 1984. Chothia C. Principles that determine the structure of

proteins. Annu Rev Biochem 1984; 53:537. Dunn MJ: Gel Electrophoresis of Proteins. Wright,

1986.

Franks F: Characterization of Proteins. Wright, 1986 One AD, Braun W, Wuthrich K. Studies by

^lH NMR and distanoe geometry of the solution

conformation of the a-amylase inhibitor tendami-

stat. / Mol Biol 1986; 189:377. Lennarz WJ (editor): The Biochemistry of Glyco-

proteins and Proteoglycarrs. Plenum Press, 1980. L'Italien JJ: Proteins: Structure and Function. Ple­num Press, 1987. Rosę CD, Geselowitz AR, Lesser GJ, Lee RM, Zehfus

MH. Hydrophobiciiy of amino acid residues in

globular proteins. Science 1985; 229:834, Schlessinger DH: Macromolecular Seąuencing and

Analysis: Selected Methods and Applications. AR

Liss, 1988. Schott H: Affinity Chrotnatography. Template Chro-

matography of Nucleic Acids and Proteins. Marcel

Dekker, 1984. Wittmann-Liebold B, Solnikow J, Erdmann VA:

Advancetl Methods in Protein Microseąuence

Analysis. Springer Verlag, 1986.

7

Białka: mioglobina i hemoglobina

Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE

W rozdziale tym omówiono zależność struk­tury i funkcji na przykładzie mioglobiny i hemo­globiny, białek nie tylko bardzo istotnych fizjo­logicznie, lecz także obrazujących, w jaki spo­sób struktura białek decyduje o ich funkcji biologicznej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Białka hemowe biorą udział w transporcie i magazynowaniu tlenu, transporcie elektronów oraz fotosyntezie. Badania mioglobiny i hemo­globiny ujawniły istnienie cech struktury wspól­nych dla wielu białek, jak również istnienie zależności między strukturą a funkcją. Ponadto umożliwiły one poznanie molekularnych pod­staw chorób genetycznych, takich jak niedo-krwistośc sierpowata (wynik zmienionych właś­ciwości powierzchniowych podjednostki p he­moglobiny) i taJasemie (przewlekłe dziedziczne choroby hemolityczne, charakteryzujące się upośledzeniem syntezy hemoglobiny). Badania wykazały, że cyjanek i tlenek węgla stanowią śmiertelne zagrożenie, ponieważ uniemożliwia­ją fizjologiczną funkcję odpowiednio oksydazjŁ cytocJLrpmowei-J^hemoglobiny, a stabilizacja struktury czwartorzędowefnieutJenowanej he­moglobiny przez 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) stanowi podstawę mechanizmów choroby górs­kiej i adaptacji do dużych wysokości.

ZDOLNOŚĆ MIOGLOBINY

I HEMOGLOBINY

DO MAGAZYNOWANIA

I TRANSPORTU TLENU WIĄŻE SIĘ

Z OBECNOŚCIĄ PROSTETYCZNEJ

GRUPY HEMOWEJ

I JONU ŻELAZAWEGO

Grupą proste ty czną mioglobiny i hemoglobi­ny jest hem, cykliczny tetrapirol nadający tym białkom zabarwienie czerwone. W tetrapirolu 4 pierścienie pirolowe są połączone mostkami tt-metinowytni, tworząc płaski układ cykliczny (ryc. 7-1). Podstawniki w pozycjach P pierścieni

n

Ryc. 7-1. Pirol. Węgle a fączą się za pomocą mostków metinowych tworrac cykliczny tetrapirol. Przy węglach p występują podstawniki charak­terystyczne dta swoistych tetrapiroli, np. hemu.

pirolowych określają rodzaj pochodnej tetrapi­rolu. W hemie w pozycjach p znajdują się grupy metylowe (M), winylowe (V) i pfbpionianpwe (P) ułożone w następującej kolejności: M, V, M, V, M, P, P, M (ryc. 7-2). W centrum tego układu znajduje się atom żelaza w formie jonu żelaza­wego (Fe²⁺), Innymi białkami, w których gru­pą prostetyczną jest tetrapirol zasocjowany z jo­nem metalu są cytochromy (Fe²⁺ i Feⁱ⁺), katalaza, 2,3-dioksygenaza tryptofanowa oraz chlorofil (Mg²⁺). Funkcja biologiczna cyto-

BIAŁKA: MJOGLOBtNA f HEMOGLOBINA / 71

Ryc. 7-2. Hem. Pierścienie pirolowe, węgle most­ków metinowych i atom żelaza Fe'^{4 +} leżą praktycz­nie w jednej płaszczyźnie. Piąte i szóste wiązanie koordynacyjne Fe²⁺ są usytuowane prostopadle, znajdując się nad i pod płaszczyzną hemu. Na uwagę zasługuje rodzaj podstawników przy węg­lach P pierścieni piroiowych, centralnie położony atom zela2a oraz polarne łańcuchy boczne, które są zwrócone na zewnątrz cząsteczki mioglobiny.

chromów wynika z utlenienia i redukcji atomu żelaza. W przeciwieństwie, w przypadku mio­globiny i hemoglobiny utlenienie Fe²⁺ wiąże się z utrat -a przez te białka ich aktywności biologicz-nej.

Utlenowana mioglobina mięśni stanowi rezerwę tlenu

Fnnk^pt iTiinplrthiTiy jftst ma^Tynnwfinie t1f»-

nu w mięśniach. W warunkach niedoboru tlenu (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń fizycz­nych) tlen utlenowanej miogiobiny jest wyko­rzystywany w mitochondriach mięśni do syn­tezy ATP na drodze fosfcrylacji oksydacyjnej.

Poza dwoma wyjątkami reszty polarne znajdują się na zewnątrz, a niepolarne wewnątrz cząsteczki mioglobiny

Mioglobina jest to pojedynczy łańcuch poli-pęptydowy o masie cząsteczkowej 17 000 zbu­dowany zejj_5J)reszt aminokwasowych roz­mieszczonych w "cKaraktery styczny dla białek globularnych sposób. Zewnętrzna cześć cząste­czki białka jest polarna, ^a wnętrze — niepolar­ne. Reszty aminokwasowe, zawierające zarów­no grupę polarną, jak i niepolarną (np. Thr, Trp i Tyr), są skierowane swoją niepolarną częścią do wnętrza częsteczki. Poza 2 resztami his-tydynowymi, biorącymi udział w wiązaniu tle-

nu, wewnątrz cząsteczki mioglobiny znajdują się wyłącznie aminokwasy niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met).

Mioglobina, pierwsze białko, którego strukturę rozszyfrowano rentgenograficznie, jest bogata w ot-heliks

Mioglobina jest silnie upakowaną, w przy­bliżeniu kulistą cząsteczką o wymiarach 4,5x3,5 x2,5 nm(ryc. 7-3). Niemniej jednak jej

Ryc. 7-3. Model mioglobiny opracowany na podstawie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wyłącznie węgle s, (Reprodukcja za zgodą z: Dickerson R. E._r w: The Proteins, wyd. 2, t. 2, Neurath H, [red], Academic Press, 1964).

struktura jest nieregularna i wykazuje brak symetrii. Okojo 75% ^"^nyfia wy^t^ry^\yfga­rnie R prąwnslfi-^tiiyrh a-heiiksów o długości

7—20 aminokwasów. Licząc od N-końca od­cinki helikalne oznacza się kolejnymi literami od A do H, natomiast fragmenty między helikal­ne literami 2 odcinków helikalnych, które one łączą. Poszczególne aminokwasy określa się za pomocą litery oznaczającej hełiks, w którym dana reszta występuje, oraz liczby wskazującej jej pozycję od końca N w tym heliksie. Na przykład „His F8" odpowiada 8, reszcie w heli­ksie F zidentyfikowanej jako histydyna. Odległe w rozumieniu struktury pierwszorzędowej re­szty aminokwasowe (np. w różnych heliksach) ze względu na ułożenie przestrzenne łańcucha polipeptydowego mogą znajdować się blisko

72 / ROZDZIAŁ 7

His praksymalna (F8)

siebie, jak na przykład histydyna F8 (proksyma-lna) i histydyna E7 (dystalna) {ryc. 7-3).

Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura mioglobiny w roztworze ściśle odpowiada stru­kturze mioglobiny krystalicznej. Wykazują one identyczne widma absorpcji, obie wiążą tlen. a zawartość cc-heliksów w strukturze mioglobi­ny w roztworze (oznaczona za pomocą dyspersji skręcalności optycznej i dichroizmu kołowego) jest porównywalna z zawartością ujawniony przez analizę rentgenograficzną.

Pierwszorzędowa struktura a po mioglobiny zapewnia prawidłowe upakowanie białka w obecności hetnu Przekształceniu mioglobiny w pozbawioną hemu apomioglobine, wskutek obniżenia pH do 3,5, towarzyszy zmniejszenie zawartości struk­tury a-helikalnej, a w obecności mocznika cał­kowity jej zanik. Usunięcie mocznika poprzez dializę i dodanie hemu przywraca całkowicie strukturę helikalną, a w obecności Fe²⁺ aktyw­ność biologiczną (wiązanie tlenu). Wskazuje to, że informacja zawarta w strukturze pierwszo-rzędowej apomioglobiny jest odpowiedzialna za swoiste upakowanie białka w obecności hemu. Stwierdzenie, że struktura pierwszorzędowa biał­ka determinuje jego strukturę drugo- i trzeciorzę­dową okazało się być uniwersalne.

Histydyny F8 i E7 odgrywają unikatową rolę w wiązaniu tlenu przez mioglobinę

W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między heliksem E i F (ryc. 7-3). Polarne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki mio­globiny, a jego pozostała część znajduje się we wnętrzu białka, gdzie, z wyjątkiem His_F_8 j.His Ę7, otaczają go reszty niępolarne. Atom żelaza piąj^mwiąza niemkoordvnacvjnvm wiążesie z pierścieniem imidazoTowym His F8 określanej mianem histydyny proksymalnej (ryc. 7-4). Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określaną mianem histydyny dystalnej, która jednak nie zajmuje szóstej pozycji koordynacyjnej żelaza (ryc. 7-4).

Atom żelaza umiejscowiony nieco poza płaszczyzną hemu przesuwa się w jej kierunku po związaniu tlenu

W mioglobinie pozbawionej tlenu atom żela­za jest wysunięty o ok. 0,03 nm (0,3 A) poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8. W przy-

His dystalna (B7)

Ryc. 7-4. Wiązanie tlenu z żelazem hemowym
podczas reakcji utlenowania. W reakcji tej istotną
rolę odgrywają pierścienie imidazolowe 2 reszt
histydynowych globiny, łączące się z żelazem he­
mowym. (Reprodukcja za zgodą z: Harper H. A.
i wsp., Physiologische Chemie, Springer-Verlarg,
1975).

padku utlenowanej mioglobiny, w którejjjm, zajmuje szósta, pozycje koordynacyjną, żelazo jeśT~ wy sunięte poza płaszczyznę hemu tylko ook. 0,01 nm(0,l A). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch atomu żelaza, a w konsek­wencji His F8 i reszt kowalencyjnie połączonych z His F8, w stronę płaszczyzny grupy pro-stetycznej. Skutkiem tego zjawiska jest zmiana konformacji części białka.

Apomioglobina zmniejsza powinowactwo żelaza hemowego do tlenku węgla

W utlenowanej mioglobinie wiązanie między atomem tlenu i Feⁱ⁺ jest prostopadłe~db płasz­czyzny nemu. Drugi atom tlenUj w stosunku do płaszczyzny hemu, jest przyłączony natomiast pod kątem 121 stopni z dala od histydyny dystalnej (ryc. 7-5).

Około 25 000 razy silniej niż tlen do wyizolo­wanego hemu wiąże się tlenek węgla (CO). Chociaż CO znajduje się w atmosferze w ii oś-

BIAŁKA: MLOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 73

O III

O I

c

I

Ryc. 7-5. Preferowane kąty wiązania tlenu i tlen­ku węgla do atomu żelaza w hemie.

ciach śladowych, a podczas prawidłowego kata-bótizmu hemu powstają jedynie niewielkie jego ilości, nasuwa się pytanie, jak to się dzieje, że O2, a nie CO zajmuje szóste miejsce koordynacyjne w żelazie hemu mioglobiny. Przyczyną jest przestrzenna zawada, jaką stanowi otoczenie "Fiemu w mioglobinie. Preferowane ułożenie CO przyłączonego do żelaza hemowego jest dla wszystkich 3 atomów (Fe, C. O) prostopadłe w stosunku do płaszczyzny hemu (ryc. 7-5). Podczas gdy taka orientacja jest możliwa w^przypadku wyizolowanego hemu, w mio-globinie histydy na dystalna stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod tym kątem (ryc. 7-6). Powoduje to, że CO wiąże się w mniej korzystriejTcbnfiguracji, co zmniejsza siłę wiąza­nia hem-CO o ponad 2 rzędy wielkości, do wartości ok. 200 razy przewyższającej wiązanie hem-O₂. Pomimo tego w warunkach fizjologi­cznych niewieika część mioglobiny (ok. 1%) występuje w formie karboksymioglobiny.

KRZYWE DYSOCJACJI TLENOWEJ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE

Mioglobina jest białkiem magazynującym, a nie"transportującym"tlen.llość_przyłączonego do mioglobiny tlenu (wyrażona w „procentach nasycenia") zakżv od jego stężenia (wyrażone­go jako pO₂, czyli stężenie cząstkowe tlenu) w nąjbliższyjn_gtoczeniu żelaza hemowe^o. Za­leżność międzypbi i ilością związanego tlenu obrazują graficznie krzywe dysocjacji tlenowej. Dla mioglobiny krzywa dysocjacji tlenowej w. wa­runkach izotermicznych ma kształt hiperboli (ryc. 7-7). W naczyniach włosowatych płuc,

Ryc. 7-7. Krzywa dysocjacji tlenowej mioglobi­
ny. Na uwagę zasługuje zależność stopnia utleno-
wanra i ciśnienia cząstkowego tlenu w płucach
(100 mm Hg), tkankach (20 mm Hg) i pracujących
mięśniach (5 mm Hg).

Ryc. 7-6. Kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu żelaza hemu w mioglobinie, Histydyna dys­talna E7 stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płaszczyzny hemu kalem (180°),

w których pOj wynosi 100 mm Hg, mioglobina mogłaby skutecznie wiązać tlen. Ponieważ jed­nak wartość pO₂ w żyłach i mięśniach wynosi odpowiednio 40 i 20 mrn_Hgj a mioglobina nie oddaje znacznej części związanego tlenu nawet przy ciśnieniu 20 mm Hg nie może ona służyć jako przenośnik tlenu z płuc do tkanek. Dopiero w warunkach niedoboru tlenu, towarzyszącego dużej aktywności fizycznej, kiedy pO, w mięś­niach spada do 5 mm Hg, mioglobina uwalnia związany tlen, który w mitochondriach mięśni jest wykorzystywany do biosyntezy ATP w wy­niku fosforylacji oksydacyjnej.

74 / ROZDZIAŁ 7

HEMOGLOBINA TRANSPORTUJE TLEN, DWUTLENEK WĘGLA I PROTONY MIĘDZY PŁUCAMI I TKANKAMI

Hemoglobina, zawarta w erytrocytach kręgo­wców, spełnia dwie główne funkcje biologiczne; 1) przenosi O₂ z płuc do tkanek i 2) przenosi CO₂ i protony z tkanek do phic w celu wydale­nia. Mimo że biochemia porównawcza hemo­globin kręgowców jest bardzo interesująca, przedmiotem dalszych rozważań są hemoglobi­ny ludzkie.

KONSEKWENCJĄ

CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY HEMOGLOBINY SĄ JEJ WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE

Właściwości poszczególnych hemoglobin są prawidłowością wynikającą z ich struktury czwartorzędowej (jak również drugo- i trze­ciorzędowej). Czwartorzędowa struktura he­moglobiny jest odpowiedzialna za nowe, dodat­kowe w stosunku do mioglobiny, właściwości, które warunkują jej unikatową funkcję bio­logiczną i pozwalają na jej precyzyjną regulację. Właściwości allosteryczne (gr. allos — inna, steros — przestrzeń) hemoglobiny stanowią ponadto model do zrozumienia innych białek allosterycznych.

W przeciwieństwie do mioglobiny, hemogtobina jest tetramerem

Hemoglobina w odróżnieniu od jednołańcu-chowej mioglobiny nie mającej struktury czwar­torzędowej, jest tetramerem składającym się z 2 par identycznych łańcuchów polipeptydo-wych, czyli podjednostek (określanych jako a, p, 7,8, S itd.). Podobne pod względem długości polipeptydy a (14l) reszt aminokwas owych) i P (146 jeszt aminokwasowych) hemoglobiny A (HftA) są kodowane przez różne geny i mają odmienną strukturę pierwszorzedową. W prze­ciwieństwie, łańcuchy p, y i 5 hemoglobin ludzkich charakteryzuje duża konserwatyw-ność ich sekwencji. Najczęściej występujące hemoglobiny mają następujący skład tetrame-ru: HbA j (podstawowa hemoglobina prawid­łowa u ludzi dorosłych) = ąj^, ^^(hemo­globina płodowa) = a₂Y₂, HBS ^hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) = <x₂S₂, HbA₂ (hemoglobina prawidłowa u ludzi doros-

łych stanowiąca ok. 2,5%* Hb całkowitej) =

Mioglobina i podjednostki

P hemoglobiny mają praktycznie

identyczną strukturę drugorzędową

1 trzeciorzędową

Pomimo różnic w rodzaju i liczbie amino­kwasów, mioglobina i łańcuchy polipeptydowe P HbA wykazują praktycznie identyczną struk­turę drugorzędową i trzeciorzędową. To ścisłe podobieństwo, dotyczące również umiejscowie­nia hem u i odcinków helikalnych, jest przynaj­mniej w części wynikiem substytucji amino­kwasów o podobnych właściwościach i równo­znacznych pozycjach w strukturze pierwszo-rzędowej mioglobiny i podjednostki P HbA. Nawet występowanie 7 a nie 8 odcinków helika­lnych w łańcuchu P nie zmienia zasadniczego podobieństwa strukturalnego tych polipepty-dów. Podobnie jak w przypadku mioglobiny, zarówno podjednostki ot, jak i p HbA charak­teryzuje obecność hydrofobowych reszt amino­kwasowych wewnątrz cząsteczki (z wyjątkiem

2 reszt His w każdej podjednostce), a hydro-
filowych na zewnątrz cząsteczki.

Uttenowaniu hemoglobiny towarzyszy wsunięcie żelaza w płaszczyznę hemu oraz zmiana konformacji sprzężonej apoproteiny wywołana przemieszczeniem histydyny proksymalnej

Tetramcryczna hemoglobina wiąże 4 cząste-czkftlenu (hem każdej podjednostki wiąże jedną cząsteczkę tlenu), a jej krzywa dysocjacji tleno­wej ma kształt sigmoidalny (ryc. 7-8). Przyłącze­nie O₂ przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych O₂ przez pozostałe grupy hemowe. To kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną jest właściwością pozwalającą na wiązanie mak­symalnej ilości O₂ w płucach i uwalnianie maksymalnej ilości O₃ w tkankach (ryc. 7-8).

Miarą powinowactwa hemoglobiny do tlenu jest wielkość P_so, odpowiadająca ciśnieniu cząstkowemu tlenu, przy którym występuje 50% nasycenia O_a

Wartość P_;o jest różna dla różnych orga­nizmów, przy czym jest ona zawsze większa od wartości pO₂ w tkankach badanych organiz-

* Przyp. tłum.

BIAŁKA; MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 75

Utlenowana krew

opuszczająca płuca

Odtlenowana krew powracająca z tkanek

Hemoglobina 1,1

140

20 40 60 80 100 120

Ciśnienie cząstkowe tlenu (mm Hg)

Ryc. 7-8. Krzywedysociacjitlenowej hemoglobi­ny i mioglobiny. Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej wynosi ok. 100 mm Hg; wkrwiżylnej—40 mm Hg; w naczyniach włosowatych — 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funkcji cytochromów — 5 mm Hg. Połączenie łańcuchów polipeptydo-wych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedyn­czymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu. (Zmodyfikowana i reprodukowane za zgodą z: StanburyJ, B,,Wyngaarden J. B., Fredrickson D.S. [red.], The Metabolic Bas/s of Inherited Disease, wyd.4, McGraw-Hill, 1978).

Ryc. 7-9. Wiązania poprzeczne międ2y podjed-
nostkarni oraz w obrębie podjednostek nieutleno-
wanej hemoglobiny. Podczas utlenowania te nie-
kowalencyjne, elektrostatyczne wiązania zostają
rozerwane, {Zmodyfikowana i reprodukowana za
zgodą z: Stryer L: Biochemistry. wyd. 2, Freeman,
1981).

go-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze biał­ka. Jedna para podjednostek a/P obraca się w stosunku do drugiej pary a/&\ w wyniku czego następuje zbliżenie podjednostek tetramem i zwiększenie powinowactwa hemów do tlenu (ryc, 7-10 i 7-11).

15°

Postać R

mów, czego dobrym przykładem jest ludzka hemoglobina płodowa (HbF). Wartość P₅₀ dla HbA = 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF = 2(1 mm Hg. Ta różnica w powinowactwie Hbl i HbA do tlenu umożliwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrębie łożyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie spełniać swoją funkcję po­nieważ jej duże powinowactwo do O₂ utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach.

Najwcześniej w rozwoju osobniczym człowie­ka są syntetyzowane łańcuchy £ i e. Pod koniec pierwszego trymestru ciąży łańcuch £ zastępuje podjednostka et, a łańcuch e — podjednostka7. Hemoglobina F, pojawiająca się więc w tym okresie życia płodowego, jest zbudowana wed­ług wzoru d₂ y . Podjednostka % której synteza rozpoczyna się w trzecim trymestrze ciąży, całkowicie zastępuje łańcuch y dopiero kilka tygodni po porodzie.

Utlenowamu hemoglobiny towarzyszą zmiany konformacji białka

PrzyJaszernu O₂ towarzyszy rozerwanie wią­zań poprzecznych pomiędzy końcami karbo-ksylowymi wszystkich 4 podjednostek hemo­globiny (ryc. 7-9), co powoduje zmiany w dru-

cc, S	\^8
^1 /	\
i	V '
i	1
	1
. \	/
	/ 6
	/
	s ■~~- -■

Postać T

Rvc. 7-10. W czasie przejścia postaci T w postać R hemoglobiny jedna para podjednostek (a₂/f>₂) obraca się o 15° w stosunku do drugiej pary (a₁/fl_]). Ponieważ oś obrotu jest niewspółśrodkowa, para at₂/P₂ przesuwa się również nieco w kierunku osi. Na diagramie para a,/^ utrzymująca się w stałej pozycji jest niezaciemniona, a para a₂/P_: dokonują­ca obrotu i przesunięcia jest zaciemniona.

Czwartorzędową strukturę częściowo utleno-wanej hemoglobiny określa się jak o stanT(ang. taut — naprężony), a całkowicie utlenowanej hemoglobiny (HbOj) jako stan R (ang. relaxed

76 / ROZDZIAŁ 7

Odtlenowanie (posiać T)

— rozluźniony) (ryc. 7-12). Symbole R i T są również używane w celu określenia czwartorzę­dowej struktury enzymów allosterycznych, gdzie forma T wykazuje mniejsze powinowact­wo do stibstratu.

Utlenowanie hemoglobiny prowadzi

do zmian konformacyjnych

w bezpośrednim otoczeniu grupy

hemowej

Podczas utlenowania hemoglobiny atomy że­laza (Mace ok. 0,06 nm poza płaszczyzną hemów w nieutlenowanej hemoglobinie) wsu­wają się w płaszczyznę hemów, pociągając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połączone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 7-13).

Pod jednostka /)_t

Podjednostka a.

TyrC7|«)

Ryc. 7-11. Zmiany oddziaływań w obrębie ot,/p,
podczas utlenowania. Przesunięcie zazębiających
się obszarów powoduje zmianę miejsc oddziały­
wań i „przełączanie" jednych wiązań wodorowych
na inne. Pozostałe wiązania mają charakter niepolar-
ny. (Reprodukcja za zgodą z: Perutz M. F.: Molecu-
lar pathology of human hemoglobin: stereochemi-
cal interpretation of abnormal oxygen affinities,
Naturę 1971; 232:408).

AspG1(94!

Podjednostka f)₂

Utlenowanie (postać R)

Postać T

Postać R

Ryc. 7-12. Przejście postaci T w postać R zwiększa prawdopodobieństwo utlenowania każdego
z 4 hemów. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząsteczek tlenu, lecz
dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych hemów. Stopniowe przyłączanie tlenu powoduje pękanie
(linie cienkie) i osłabianie (linie wężykowate) wiązań poprzecznych łączących podjednostki w postaci T.
Przejście między tymi dwoma postaciami pozostaje pod wpływem różnych czynników, takich jak: protony,
dwutlenek węgla, chlorki, BPG. Im większe stężenie tych czynników, tym więcej tlenu musi zostać
związane, aby zapoczątkować przekształcenie. Schemat nie zawiera całkowicie utłenowanej cząsteczki
w postaci T oraz całkowicie nieutlenowanej cząsteczki w postaci R, ponieważ są one zbyt nietrw'ałe, aby
istnieć w znaczącej liczbie. (Zmodyfikowana i przerysowana za zgodą z: Perutz M. F,: Hemoglobin
structure and respiratory transport, Sci. Am. [Dec], 1978; 239:92),

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 77

Hlslydyna FB

HeliKs F

Odpychania ' przestrzenne I

Płaszczyzna nam u

Ryc. 7-13. Podczas utlenowania atom żelaza wsu­wa się w płaszczyznę hemu. Razem z atomem źeiaza przemieszcza się histydyna F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. (Zmodyfikowana i reprodu­kowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2. Freeman, 1981).

Po uwolnieniu tlenu w tkankach hemoglobina transportuje dwutlenek węgla i protony do płuc

Oprócz transportu tlenu z płuc do tkanek, hemoglobina bierze udział w przenoszeniu COj

z tkanek do płuc, skąd jest on usuwany podczas oddychania. Bezpośrednio po odłączeniu tlenu, cząsteczka hemoglobinjL.^dąiŁ_CQ_s_ w ilości stanowiącej~oJć7l5% CO₂ transportowanego . Ponadto z chwilą za"SBsorbtyw"ania

pj

COj przez Ićrew dehydrataza węglanowa eryt­rocytów katalizuje utworzenie kwasu węgiowe-go, który dysocjuje do wodorowęglanu i proto­nu na skutek przesunięcia równowagi reakcji w kierunku dysocjacji (ryc. 7-14). Funkcję ukła­du buforowego, zabezpieczającego organizm

HCO.-+ H+

co,+

Ryc. 7-14. Tworzenie kwasu węglowego pod wpływem dehydratazy węglanowej i jego dysocja-cja do jonu wodorowęglanowego i protonu.

przed szkodliwym wpływem zwiększenia kwa­sowości krwi, pełni m.in. hemoglobina._QjL-, łączeniu 4 cząsteczek tlenu z hemoglobiny towa­rzyszy wiązanie 2 protonów. W płucach nato­miast zachodzi zjawisko odwrotne, tj. przyłą­czenie tlenu do hemoglobiny powoduje uwolnienie protonów. Uwolnione-prolony łączą się z wodo­rowęglanem, tworząc kwas węglowy, który pod wpływem dehydratazy węglanowej przekształca się w CO₂, usuwany w procesie oddychania. Stad wiązanie tlenu zwiększa wydychanie CO₂. To odwracalne zjawisko nosf nazwę efektu Bohra (ryc. 7-l5)7EfekTBohTa jest właściwością

Wydychania

2HCO,"

JD.2H

(Buforujące działania

— hemoglobiny)

Płuca

40

Tkanki

Cykl kwasów

trlkarboksylowych

(Krebsa)

Ryc. 7-15. Efekt Bohra. Powstający w tkankach dwutlenek węgla laczy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do protonu i jonu wodo­rowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobina wiąże protony i transportuje je do płuc. W płucach, w wyniku przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc się z jonem wodorowęg-lanowym tworzą kwas węglowy, przekształcany przez dehydrataze węglanową do dwutlenku węgla usuwanego w procesie oddychania.

charakterystyczną dla tetramerycznej hemo­globiny, ^7al1?iB[l ffl jnterakcji hem-hem, czyli kooperatywności wiązania tlenu. Efektu Boh­ra nie obserwuje się w przypadku mioglobi-ny.

78 / ROZDZIAŁ 7

Rozerwanie wiązań poprzecznych

podczas przyłączania tlenu

do hemoglobiny w postaci T dostarcza

protonów odpowiedzialnych za efekt

Bohra

Protonv_odpowiedzialne za elekt Bohra po­wstają w wyniku rozerwania \\ i a&łjl „poprze­cznych podczas przyłączania tlenu do postaci T, Sa one głównie uwalniane z atomów N pierś­cieni imidazolowych C-końcowych reszt his-tydyny łańcuchów P HC3 (146). Uwolnione pmtnny pye kształcą ją wodorowęglan w kwaś" węglowy, usuwany pkn m, w naczyniacF

)

węglowy, usuway p

włosowatych pęcherzyków nłucnych fryc. 7-15). Natomiast podczas odłączania tlenu tworzenie wiązań poprzeczaych, pjaslaci T hemoglobiny wymaga przyłączenia protonów do reszt HC3 łańcuchów p. oiwnrrer protonów w tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych na skjJteYprotonacji końcowych/reszt Hisw pod-jednostkach p. Odtworzenie wiązań poprze­cznych sprzyja wiec uwalnianiu łferm z, ufleno'-wanej (postajLKLJiamo.globiny. Uogólniając, /większenic stężeniajworpntm; powoduje odjacze-nSjttnu.JJOticS^gdy zwiększenie stężenia tlenu powoduje odłączenie protonów. Zależność tęorj-razuje przesunięcie krzywej dysocjacji tlenu na prawo w wyniku zwiększenia zawartości jonów wodorowych (protonów).

W centralnej wnęce cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny 2,3-bisfosfoglicery niań (BPG) tworzy wiązanie poprzeczne, stabilizujące strukturę T

W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiększa się zawartość 2,3-bisfosfogIicerynianu (BPG) (ryc. 7-16). Związek ten tworzy się

z 1,3-bisfosfoglicerynianu, będącego metaboli­tem pośrednim glikolizy. BPG wiąże się z hemo­globiną w stosunku 1 cząsteczka BPG na tet-rameryczną cząsteczkę hemoglobiny, a miejs­cem wiązania jest przestrzeń między 4 podjed-nostkami, znajdująca się w centrum cząsteczki hemoglobiny. Rozmiar tej wnęki jest odpowie­dni dla BPG tylko w przypadku postaci T, tj. wtedy, kiedy przestrzeń między heliksami H łańcuchów p jest wystarczająco duża. BPG przyłącza się za pomocą wiązań poprzecznych, twofzą-ćycn się pomiędzy atomami tlenu BPG i dodatnio naładowanymi resztami Val NA1 (grupy aminowe N-koricowe), Lys EF6 oraz His H21 łańcuchów p (ryc. 7-17). BPG stabilizuje

Ryc. 7-17. Sposób wiązania 2,3-bisfosfogltcery-nianu z nieutlenowaną hemoglobiną człowieka. BPG oddziałuje z 3 dodatnio naładowanymi grupa­mi każdego z łańcuchów fi. (Reprodukcja za zgodą z: Arnone A,: X-ray diffraction siudy of binding 2,3-diphosphoglycerate to human deoxyhemoglo-bin. Naturę 1972; 237:146).

Ryc. 7-16.

(BPG).

o-o-

p

\\

o

Struktura 2,3-bisfosfoglicerynianu

więc postać T lub nieutlenowaną postać hemo­globiny przez tworzenie wiązań poprzecznych

w obrębie łańcuchów p oraz dostarcza dodat­kowe wiązania poprzeczne, które muszą ulec zerwaniu przy przechodzeniu postaci T w po­stać R.

Wiązanie BPG z hemoglobiną płodową jest znacznie słabsze niż z hemoglobiną Judzi doros­łych, ponieważ zamiast His resztą H2T w łań­cuchu y hemoglobiny płodowej jest seryna, która nie tworzy wiązań poprzecznych z BPG.

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 79

wactwa do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). Dostarczanie wskutek tego zbyt małej ilości tlenu do tkanek powoduje hipoksje, która pro­wadzi do policytemii (zwiększenie liczby eryt­rocytów).

BPG ma więc mniejszy wpływ na stabilizację formy T w przypadku hemoglobiny płodowej, co

powoduje jej większe w porównaniu z hemo­globiną ludzi dorosłych, powinowactwo do tle­nu.

Przejście postaci T w postać R hemoglobiny i odwrotnie jest wyzwalane przez ruch żelaza do wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny układu por-firynowego. Przejście to jest uruchamiane przez czynniki oddziałujące przestrzennie i elektro-statycznie przy nakładzie energii ok. 12 560 J/mol (3000 cal/mol). Niewielka zmiana pozycji Fe²⁺ w stosunku do płaszczyzny układu po-rfirynowego indukuje więc znaczne zmiany w konformacji hemoglobiny, wpływając decy­dująco na jej funkcje biologiczną w odpowiedzi na sygnały środowiska.

ZIDENTYFIKOWANO KILKASET MUTANTÓW HEMOGLOBINY WWIĘKSZOŚCI NIE OBJAWIAJĄCYCH ZABURZEŃ FUNKCJI

Mutacje genów kodujących łańcuchy ot lub P mogą wpływać na biologiczną funkcje hemo­globin. Poniżej opisano kilka, spośród kilkuset znanych (w większości łagodnych), mutantów hemoglobin Judzkich o zmienionej funkcji bio­logicznej, Stan, w którym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funkcji biologicznej he­moglobiny określa się mianem hemoglobino-pata.

W hemoglobinach typu M proksymalna lub dystalna reszta histydyny w podjednostkach ot lub ji jest zastąpiona resztą tyrozyny

Zastąpienie proksymalnej lub dystalnej his­tydyny resztą tyrozyny przyczynia się do stabili­zacji żelaza hemowego w formie Fe³⁺, na skutek tworzenia przez niego trwałego połącze­nia z anionem fenolanowym Tyr. Obecność hemu w formie żelazowej nie wiążącej 0₂ powo­duje met hemoglobinemię. W przypadku warian­tów hemoglobin M dotyczących łańcuchów a obserwuje się przesunięcie równowagi przejś­cia R-T w kierunku formy T, zmniejszenie powniowaćTwa do tlemi i zniesienie efektu Boh-raTNatomiast w przypadku wariantów dotyczą­cych łańcuchów P efekt Bohra jest zachowany, ponieważ nie ulega zakłóceniu przejście R-T.

Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się po­staci R charakteryzują się zwiększeniem powino-

W hemoglobinie Sj^ęsztŁ l

gl j^ęs

glutaminowego w pozycji 6 łańcucha

{> jest zastąpiona resztą waliny

Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpie-uiśLCjju A2 (ó)p\ tj, reszty 6 w łańcuchu (3 przez ^al. Reszta A2 (Glu lub Val) znajduje się na powierzchni cząsteczki, odpowiadając za jej kontakty z wodą. Zastąpienie polarnego kwasu glutaminowego niepolarną waliną powoduje powstanie na powierzchni łańcucha P „lepkich miejsc". „Lepkie miejsca" występują zarówno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej postaci hemoglobiny S_; nie ma ich n^ bT

glojbinic: AJJ koTei na powierzchni hemoglobiny nieutlenowanej występują miejsca komplemen­tarne do „lepkich miejsc". Są one niedostępne w hemoglobinie utlenowanej (ryc. 7-18).

IMieutlenowana hemoglobina S

może tworzyć włókna,

które zniekształcają erytrocyty

„Lepkie miejsca" nieutlenowanej hemoglobi­nySmogą łączyć się z miejscami komplemen­tarnymi innej cząsteczki nieutlenowanej hemo­globiny. Oddziaływania te powodują polimery­zację nieutlenowanej hemoglobiny S, w wyniku czego powstają długie, wytrącające się agregaty zniekształcające erytrocyty (erytrocyty przybie­rają kształt sierpowaty), odpowiedzialne za ich liżę i inne objawy kliniczne. Utrzymanie hemo­globiny S w postaci utlenowanej lub zmniejszenie do minimum jej stężenia w postaci nie­utlenowanej zapobiegałoby tworzeniu się poli­merów, a tym samym sierpowatości krwinek. Jest bowiem wiadomo, że polimeryzacji ulega postać T hemoglobiny S. Interesujący, chociaż nie do zastosowania terapeutycznego, jest fakt, że forma żelazowa hemoglobiny S (methemoglobi-na S) nie tworzy polimerów. Podobnie bowiem jak w przypadku methemoglobiny A, jon żelazo­wy pozostaje w płaszczyźnie układu porfiryno-wego, stabilizując strukturę R hemoglobiny.

Chociaż nieutlenowana hemoglobina A za­wiera miejsca komplementarne do „lepkich miejsc" występujących w utlenowanej i nieu­tlenowanej hemoglobinie S, to jej przyłączenie do hemoglobiny S uniemożliwia dalsze wy-dhiżanie polimerów na skutek braku na jej

80 / ROZDZIAŁ 7

Utleń owa na A

Nieutlenowana A

U tlen owa na S

Nieutlenowana S

lllllllllll

	a.
a	e

Nieutlenowana A Nieutlenowana S

Ryc. 7-18. Schemat przedstawiający „lepkie miejsca" (A) w hemoglobinie S i ich „receptory" wnieutlenowanej hemoglobinie A i S. Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje faczenie się n te utleń owa n ej hemoglobiny S w polimery. Wydłużanie polimerów przerywa nieuttenowana hemo­globina A nie zawierająca „iepkich miejsc". (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981).

6,2 nm

powierzchni „iepkich miejsc" sprzyjających dal­szemu wiązaniu (ryc. 7-18). Przyłączenie nieu-tlenowanej hemoglobiny A do hemoglobiny S za­równo w formie R, jak i T stanowi barierę do dalszej polimeryzacji.

W,_wyniku agregacji nieutlenowanej hemo­globiny S tworzą się włókna o helikalnej struk­turze, w których każda cząsteczka hemoglobiny oddziałuje z 4 przylegającymi cząsteczkami (ryc. 7-19). Włókna te deformują erytrocyty tak, że przybierają ońlTEsżtałt sieTpowaty (ryc. 7-20). Krwinki te wykazują zwiększoną podat­ność do hemolizy w czasie przechodzenia przez zatoki śledzionowe.

Talasernie są niedokrwistościamj charakteryzującymi się upośledzeniem syntezy łańcuchów cc lub p hemoglobiny

W talasemiach zmniejsza się synteza łań­cuchów a (a-talasemie) lub łańcuchów p (fi-ta-lasemie) hemoglobiny. Wywołuje to często gro­źną w skutkach niedokrwistość. Wyniki badań ostatnich lat wniosły duży wkład do naszej wiedzy o molekularnych mechanizmach odpo­wiedzialnych za talasernie.

RyC-7-19, Proponowana helikaIna struktura włók­na utworzonego w wyniku agregacji nieutlenowa-nej hemoglobiny S, (Reprodukcja za zgodą z: Maugh T. II: A new understanding of sickle celi emerges. Science 1981; 211:265, Copyright © 1981 by the American Associatiort for the Advancement of Science).

BIAŁKA: MI0GL0B1NA I HEMOGLOBINA / 81

Ryc. 7-20. Obraz erytrocytu prawidłowego (A) oraz sierpowatego (B)w skaningowym mikroskopie elektronowym. Obserwowane różnice strukturalne są wynikiem zmiany w obrębie łańcuchów (i będącej skutkiem mutacji punktowej w DNA. Zamiana T na A powoduje, że w łańcuchu {J zamiast kwasu glutaminowego znajduje się walina.

PIŚMIENNICTWO

Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin: Molecular, Gene-tic, and Ciinical Aspects, Saunders, 1986.

Dickerson RE, Geis I: Hemoglobin. Benjamin/Cum-mjngs, 1983.

Embury SH: The ciinical pathology of sickle-ceil disease. Anmt Rcv Med 1986;37:36[.

Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, Gholson MA, Golbus M, Arnheim N, Erlich HA: Rapid prenatal diagnosis of sickle celi anemia by a new method of DNA analysis. New Engl J Med 1987;316:ó56.

Fermi G, Perutz MF, Shaanan B, Fourme R: The crystal structure of hunian deoxyhemoglobin at 1.74 angstrom resolution. J Mol Biol I984;175: 159.

Friedman JM: Structure, dynamics, and reactivity in hemoglobin. Science 1985;228:1273.

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, MuBis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N: Enzymatic amplification of beta-globin genomic: seąuences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science, 1985;230:1350.

Schacter L, Wartti JA, Gordon EM, Prasad A, Klein BL: Altered araount and activity of superoxide dismutase in sickle celi anemia. FASEB J 198S;2:237.

Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG: The hemoglobinopathies. In The Metabolk Basis of InheritedDisease, 6th Ed. Serwer CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill, p. 2281, 1989.

6 — Biochemia

---