BIOLOGIA MOLEKULARNA wykład 7 - 17.11.2006 rok

Replikacja i rekombinacja DNA u Eucaryota

Zasada i podłoże replikacji zarówno dla eucaryota i procaryota jest ta sama.

Mianowicie sensem jest zduplikowanie dwuniciowego DNA. Jest to proces semikonserwatywny tzn. 2 stare nici stanowią matrycę dla dwóch nowych nici, które są do nich dosyntetyzowane. Mimo, iż zasada jest dość prosta, w rzeczywistości istnieje cały szereg problemów do pokonania.



rys.1 Alfa helisa DNA służy jako matryca do syntezy swojej nowej nici. Ponieważ nukleotyd A łączy się z T, a C z G każda z nici DNA może stanowić matrycę dla specyficznej sekwencji nukleotydów poprzez zasadę komplementarności jednej nici do drugiej. Dzięki temu alfa helisa DNA może być syntetyzowana bardzo precyzyjnie.

rys.2 Semikonserwatywna natura replikacji DNA. W rundzie replikacyjnej każda z dwóch nici stanowi matrycę do formowania nowej, komplementarnej nici. Dlatego oryginalna nić DNA wydaje się być nietkniętą przez wiele podziałów komórkowych.

U Eucaryota, co bardzo istotne, replikacja jest częścią cyklu komórkowego. Cały cykl komórkowy obraca się wokół replikacji. Jest to cykl, który ma rozdzielić podwojony materiał genetyczny do komórek potomnych.

Rys 3 Cztery kolejne fazy standardowego, eukariotycznego cyklu. Podczas faz G₁, S i G₂ komórka stale rośnie. Podczas fazy M wzrost ustaje, jądro się dzieli, a komórka dzieli się na dwie potomne komórki. Replikacja DNA zachodzi podczas fazy S. Fazy G₁ i G₂ są przerwami pomiędzy odpowiednio fazą M i S oraz S i M.

W cyklu komórkowym bardzo istotne są dwie fazy:

• Faza S - tu dochodzi do replikacji

• Faza mitozy (M) - tu dochodzi do rozdziału zduplikowanego DNA do komórek potomnych.

Dwie aktywne fazy są przerwane dwiema „nieaktywnymi” (tylko z pozoru) fazami - przerwami G (ang. Gap):

• G1 - przygotowanie aparatu, prekursorów do syntezy DNA

• G2 - przygotowanie do podziału; pod koniec następuje mechanicystyczne przygotowanie, czyli początek kondensowania DNA

W tych fazach dochodzi do bardzo wielu niewidocznych (w stosunku do replikacji i mitozy) procesów, które umożliwiają rozdział DNA.

Cykl komórkowy jest kolistym cyklem zdarzeń, w którym kolejność zdarzeń jest kluczowa. Jakakolwiek zmiana w kolejności zdarzeń może prowadzić do bardzo poważnych skutków. W związku z tym cykl komórkowy musi podlegać bardzo silnej kontroli.

Druga ważna różnica między procaryota, a eucaryota wynika z kontekstu strukturalnego, w jakim odbywa się replikacja. Mianowicie chodzi o chromosomy, czyli kompleks nukleoproteinowy. Chromatyna jest operacyjną nazwą dla kompleksu nuleoproteinowego (DNA + białka + inne składniki) - termin ten został wprowadzony w latach 70-tych, kiedy nie znano jeszcze struktury chromatyny.

Ta operacyjna nazwa odnosi się do jej różnych faz ustrukturyzowania.

Organizacja DNA w jądrze rys.4

Sens istnienia chromatyny jest następujący:

• Bez takiego upakowania DNA, nie byłby możliwy taki wzrost ilości DNA, jaki nastąpił w ewolucji, między procariotami i eucariotami - rozmiary chromosomu to metry, a jądra komórkowego - mikrometry.

• Możliwość kontroli i regulacji procesów zachodzących w komórce (m.in. replikacji) - jest możliwa dzięki takiej formie upakowania

REPLIKACJA U EUKARIONTÓW - główne zagadnienia:

• Trzy etapy: inicjacja, elongacja i terminacja.

• Problem końców chromosomów. Ten problem nie występuje u procaryota, gdyż zazwyczaj mają DNA koliste, zaś DNA eukariontów ma swój koniec. Istnieją problemy z ich replikacją.

• Jądro, organella (mitochondria, plastydy). DNA znajdujące się w różnych organellach musi zostać zreplikowane.

INICJACJA

U eucaryota jest bardzo dużo DNA i dynamika tego procesu nie jest dostatecznie duża, aby zreplikować całe DNA, gdyby istniało tylko jedno origin replikacji. W związku z tym, mechanizm inicjacji replikacji wykształcił się w bardzo wielu miejscach. Zsynchronizowane starty replikacji występujące w wielu miejscach prowadzą do wydłużania zreplikowanych cząsteczek. Widełki replikacyjne wydłużają się aż do momentu, gdy się połączą i zostanie zreplikowana nowa nić DNA. Jest to więc sumaryczny wysiłek wielu niezależnych wydarzeń replikacyjnych.

ORI:

• U eukariontów mamy do czynienia z klasycznym typem zestawu replikacji DNA, który wymaga tzw. ARS (autonomously replicating sequence) - sekwencji, które zostały po raz pierwszy zdefiniowane u drożdży. U drożdży ich wielkość wynosi ok. 200pz. Jest to minimalna, specyficzna sekwencja niezbędna do inicjacji replikacji chromosowego DNA. Wymusza ona replikację. Gdyby wyciąć tę sekwencje i połączyć z kompletnie innym chromosomem (innym odcinkiem DNA), to po ponownym wprowadzeniu do drożdży replikacja zachodziłaby ponownie, autonomicznie od tego ori - ARS. Jest to sekwencja, która przenosi w sobie informację o starcie replikacji, i jest w stanie potencjalnie rekrutować cały aparat replikacji.

Sekwencje ARS są wykorzystywane w biotechnologii do wymuszania replikacji (w tzw. sztucznych chromosomach).

U ssaków inicjacja (ori) obejmuje sekwencję 10 tys. pz, jest ona znacznie większa niż u drożdży, gdyż ssaki są bardziej złożonymi (wielokomórkowymi) organizmami. U nich istotna jest synchronizacja podziałów między sąsiadującymi komórkami, dlatego nie jest dziwna różnica w wielkości między tymi sekwencjami - zawierają one znacznie więcej sekwencji regulujących.

U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane.

W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI (odpowiadają konsensusem sekwencyjnym ORI), ale nie wszystkie muszą być aktywne - komórka może wybierać raz jedno, raz drugie ORI. Odcinki DNA będące replikowane z jednego ori noszą nazwę replikonu (u roślin jego długość to przeciętnie 50-70 kb, u zwierząt podobnie).

Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak porządek ich uruchamiania jest w komórce ściśle kontrolowany (zachodzi w tej samej sekwencji czasowej) i zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.

Porządek uruchamiania ORI jest również bardzo silnie konserwowany - w kolejnych pokoleniach danego organizmu, miejsca ORI startują w dokładnie takiej samej kolejności.

KONTROLA INICJACJI - nie może dojść do przypadkowej replikacji. Mimo, że wszystko, aby rozpocząć replikację jest przygotowane, to nie zawsze może zajść replikacja, np. przed zakończeniem mitozy byłoby to zabójcze dla komórki. W związku z tym w ewolucji wykształciły się bardzo sprawne mechanizmy kontrolujące inicjację replikacji, które noszą nazwę:

• Licencjonowania (kontrola pozytywna) - zapewnia, że chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą przez mitozę i znajdą się w komórce potomnej.

Aby zaszła inicjacja do ORI musi się przyłączyć kompleks rozpoznający origin (ORC - Origin Recognition Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące - Cdc1-cdt1). Dopiero pojawienie się tych czynników licencjonujących w obecności tego kompleksu umożliwia ścisłe pokrycie DNA białkami MCM (ang. minichromosome maitance), które pokrywają znaczny fragment DNA w okolicy ori (upstream i downstream) - tylko taki DNA może być replikowany. Gdy cały mechanizm ruszy, białka MCM przesuwane są przez poruszające się widełki a następnie przechodzą do puli rozpuszczalnych białek, które mogą być wykorzystywane w następnym procesie replikacji.

• Musi też dochodzić do negatywnej kontroli replikacji. To związane jest z tzw. białkiem Gemininą. Ta kontrola zachodzi już w fazie G2, czyli już w fazie poreplikacyjnej i działa przeciwnie do procesu licencjonowania. Przeciwdziała ponownemu przyłączeniu się białek MCM do świeżo zreplikowanego DNA (byłoby to możliwe, gdyż nowe DNA dalej zawiera ORI, oraz kompleks je rozpoznający). Musi być jakiś czynnik negatywny, który uniemożliwia rozpoczęcie replikacji jeszcze raz. Jest to dosyć charakterystyczne dla procesów komórkowych, że wszystko jest gotowe do ponownego rozpoczęcia procesu, ale sens takiego kolistego cyklu jest taki, że procesy te muszą przebiegać w ściśle określonej sekwencji. Dlatego istnieje kontrola negatywna - blokuje powtórne zajście tego samego procesu aż do czasu, gdy cykl wróci do tej samej fazy.

Geminina zwykle przeciwdziała przyłączeniu się MCM do świeżo zreplikowanego DNA konkurencyjnie oddziałując z tymi miejscami na DNA (zablokowanie czynnika Cdt1). Geminina blokuje więc przyłączenie MCM, a po zakończeniu mitozy jest degradowana (dopiero wtedy ponowna replikacja staje się możliwa). Podczas replikacji białka MCM są usuwane.

To także jest charakterystyczne dla cyklicznych procesów, że coś się pojawia, a potem jest degradowane.

Gemininy nie wykryto w drożdżach i u roślin. Nie jest to zatem uniwersalne białko (nie jest konserwowane ewolucyjnie). W tych organizmach funkcjonuje inny, nie do końca poznany system spełniający funkcję kontroli negatywnej.

KONTROLA INICJACJI W CYKLU KOMÓKOWYM

Faza:

M  dwa niezależne komplety chromosomów

G1 licencjonowanie: MCM, ORC i czynniki licencjonujące

S  replikacja, która usuwa czynniki licencjonowania poprzez sam fakt, że zachodzi

G2 feminina (lecz nadal są obecne ORC i MCM)

ELONGACJA

rys. 5 A replication bubble formed by replication fork initiation. This diagram outlines the major steps involved in the initiation of replication forks at replication origins. The structure formed at the last step, in which both strands of the parental DNA helix have been separated from each other and serve as templates for DNA synthesis, is called a replication bubble

ELONGACJA:

• Kompleks wieloenzymatyczny (wielopodjednostkowy) zawierający polimerazę DNA, katalizuje przyłączenie deoksyrybonukleotydów do 3'końca DNA lub RNA przyłączonego do nici matrycowego DNA.

• Synteza DNA idzie 5'3', a matryca jest odczytywana 3'5'

• Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już istniejącego fragmentu kwasu nukleinowego (primera). Nie może zacząć od zera.

• Polimeraza DNA nie jest aktywna w nieobecności primera z wolną grupą 3'OH - aktywującą grupą tej reakcji ( Z niej następuje atak nukleofilowy na grupę fosforanową innego nukleotydu. Nukleotyd ten musi jednak być uprzednio sparowany z innym, leżącym naprzeciw nukleotydem - komplementarnym wiązaniem wodorowym. To ułożenie jest niezbędne do ataku nukleofilowego, zapewnia odpowiednie odległości do zajścia reakcji.). Primery są syntetyzowane przez bardzo specyficzną polimerazę RNA zwaną primazą, która ma możliwość rozpoczęcia syntezy nici bez wolnego nukleotydu (punktu zaczepienia). DNA primaza zawsze rozpoczyna syntezę od rybonukleotydu purynowego.

• Nukleotyd przed powstaniem wiązania difosfoestrowego musi być połączony z leżącym naprzeciw nukleotydem wiązaniem wodorowym (zbliża to do siebie kolejne atomy węgla tak, aby mógł nastąpić atak nukleofilowy - musi zajść odpowiednie ustawienie donora).

• Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych (kierunki obu nici DNA są przeciwległe!!- przeciwna polarność nici) syntetyzowane DNA jest w połowie nieciągłe. Na nici wiodącej synteza primera i dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły - wystarczy jeden primer, na którym może zajść synteza całej nici.. Na nici opóźnionej ten primer nie ma miejsca, w którym może się utworzyć w momencie startu na nici wiodącej, w związku z tym ta nić musi poczekać na miejsce, aby primer mógł się tam syntetyzować, od primera musimy zacząć reakcje w przeciwną stronę i w związku z tym za moment znowu jest taka przerwa, bo znowu nie ma miejsca dla primera. Oznacza to, że synteza odbywa się na nici opóźnionej w formie krótkich fragmentów Okazaki (Okazaki, dlatego, gdyż biochemik Japoński w 80-tych latach po raz pierwszy zauważył, że podczas izolacji świeżo zrepilikowanego DNA pojawiają się krótkie małe kawałki niepołączone z sobą), z których każdy wymaga swojego primera. W związku z tym nici są nierównocenne.

rys. 6 The structure of a DNA replication fork. Because both daughter DNA strands are polymerized in the 5
-to-3
direction, the DNA synthesized on the lagging strand must be made initially as a series of short DNA molecules, called Okazaki fragments.

• Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycowej nici opóźnionej wymaga systemu naprawczego DNA zawierającego specyficzną rybonukleazę - RNazę H, która usuwa primery RNA i zastępuje je fragmentami DNA. Inny enzym - ligaza DNA łączy koniec 3' nowego fragmentu DNA z 5' końcem DNA poniżej. Nić opóźniona potrzebuje więc dwóch dodatkowych aktywności enzymatycznych, aby zakończyć syntezę.

Kluczowe białka związane z replikacją:

• U Eucaryota występują 3 główne polimerazy DNA: α, δ i ε :

 α - główna funkcja primazy

δ i ε- synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej

• Helikaza DNA (występuje w kompleksie z polimerazą δ i ε) rozplata dwuniciowe DNA u nasady widełek. Wagę tego procesu można oszacować, gdy się oceni energię zużywaną na stabilizację α helisy - jest to najbardziej korzystna energetycznie forma i w związku z tym zmienienie jej, zerwanie wiązań jest też bardzo kosztowne energetycznie. Tym właśnie zajmuje się helikaza. Występuje ona przed kompleksem replikacyjnym.

• Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające w wyniku rozplatania nici spowodowane unieruchomionymi końcami i splątanymi nićmi. Topoizomerazy są przyłączane przed widełkami. Ten problem topologiczny często ilustrowany jest przykładem dwóch sznurowadeł związanych na końcach (zawiązanych - mimo, że chromosomy eukariotyczne mają wolne końce - jednak lokalnie to, co się dzieje z DNA, jest tym samym, co zachodzi na kolistym DNA) i oplecionych wokół siebie. Gdy próbujemy to rozwijać w jakimś miejscu to natychmiastowo pojawiają się nadskręty. To co odkręcimy musi się nakręcić z drugiej strony;) - musi topologicznie być zachowana liczba skrętów w układzie. To samo dzieje się w DNA. Rozplatanie przy widełkach replikacyjnych powoduje zaplatanie nici za nimi. To zaplatanie może zachodzić tylko do pewnego momentu, bo w pewnym momencie te napięcia są tak silne, że blokują już dalsze rozplatanie.

Ten problem (nadskrętność) był jednym z argumentów przeciwko dwuniciowej helisie DNA. Sprzeciwy istniały nawet w latach 60-tych, gdy ta struktura była już znana i genetycznie udowodniona (zgadzała się z modelem powielania DNA). Jednak fizycy, którzy studiowali topologię tego modelu, wskazywali, że ten model jest właściwie bez sensu, gdyż problem nadskrętności eliminuje możliwość takiego powielania, jak proponował Crick. Na co Crick sprytnie odpowiedział, że z fizycznego punktu widzenia jest to prawdą, jednak w komórce muszą istnieć jakieś mechanizmy temu przeciwdziałające.

Topoizomerazy są w stanie dostarczyć chwilowo wolnych końców - dokonują one cięcia w pojedynczej nici DNA - wtedy wolny koniec wielokrotnie obraca się wokół drugiej nici. Gdy ta relaksacja się zakończy, enzym „wyczuwa” stan helikalny i natychmiastowo skleja te końce.

rys. 7 Schemat działania helikazy i Topoizomerazy.

Wierność replikacji

• Bardzo wysoka wierność replikacji (średnio 1 błąd na 10⁹ (miliard) nukleotydów zreplikowanych w ostatecznie zreplikowanej nici DNA)

• Polimerazy DNA zawierają funkcje autokorekty (proofreading) - usuwania własnych błędów podczas (w trakcie) replikacji. Jest to kluczowe, gdyż podczas replikacji powstają błędy. Szacuje się, że powstaje kilka błędów na każde tysiąc zasad.

• Kluczowe dla autokorekty przez polimerazy są ich aktywności 3' 5' egzonukleazy. Polimeraza usuwa źle sparowane nukleotydy od 3' końca nowo zsyntetyzowanego DNA i potem uzupełnia te braki (jest to specjalny system naprawy).

Jednak błędy się pojawiają i to z nich powstają mutacje. Gdyby błędy nigdy nie powstawały, ewolucja nie zachodziłaby.

Istnieją błędy, których nie można korygować (nie istnieje możliwość korekcji takich błędów). Na rysunku mamy jeden przykład. Wynika on z tego, że czasami podczas replikacji powstają formy tautomeryczne.

W pierwszej replikacji powstaje normalna para A-T, na drugiej nici powstaje tautomeryczna forma A, która paruje z C. Jeżeli się to zdarzy, system korekty nie jest w stanie tego rozpoznać (parowanie z formą tautomeryczną „wygląda” jak prawidłowo sparowane zasady) - po kolejnej rundzie replikacji na 1 z nici potomnych powstaje para A-T, a na drugiej C-G - są to normalne pary zasad i błąd taki jest powielany.

Niektórych błędów nie da się skorygować(rys.8)

A

T T

A

A

C T

A C

G

T

A

TERMINACJA REPLIKACJI

• Następuje w miejscu, w którym spotkają się nowozsyntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch sąsiednich miejsc ORI. Z samego zetknięcia tych dwóch kompleksów wynika terminacja. Nie jest dokładnie znany mechanizm molekularny tego, w jaki sposób ostatni nukleotyd z jednej i ostatni nukleotyd z drugiej strony jest replikowany.

Aktywność telomerazowa - replikacja końców chromosomów (telomerów).

Niezależnie od tego, jak długie są chromosomy, w pewnym momencie replikacja musi dojść do końca. Ponieważ koniec jest wolny (nie jest połączony z początkiem) powstaje problem, jak zreplikować same końce. Polimeraza musi mieć miejsce, w którym będzie oddziaływać z DNA - musi mieć miejsce 3', do którego będzie dosyntetyzowywała kolejne nukleotydy, a na końcach w którymś momencie takiego miejsca brakuje.

Gdyby nie było jakiegoś specjalnego mechanizmu, który zabezpiecza te końce, to z każdą rundą replikacyjny ten koniec by się skracał. To zresztą ma miejsce w większości komórek somatycznych, gdzie aktywność telomarazowa jest nikła lub nie istnieje w ogóle. W tych komórkach powoli „zjadane” są końce. Dlatego uważa się, że u człowieka komórki tkanek różnicujących się są zdolne do kilkudziesięciu podziałów, a potem taka komórka nie zawiera zbyt dużej liczby nukleotydów, aby móc się dzielić (ponieważ dochodzi np. do uszkodzenia jakiegoś ważnego genu na chromosomie).

Mechanizm obrony tych końców polega na tym, że na końcach chromosomów znajduje się specjalna sekwencja telomerowa. Ma ona zarówno u roślin jak i u zwierząt swoje charakterystyczne motywy. Istnieje specjalny kompleks telomerazowy składający się z białek i RNA, w którym to RNA ma sekwencje komplementarne do końcowej sekwencji telomerazowej.

Dochodzi do zwykłego parowania, a następnie aktywności RNA zależnej DNA polimerazy, która wydłuża ten koniec chromosomu o wielokrotność sekwencji końcowej. To dostarcza wystarczająco dużo miejsca dla polimerazy i zabezpiecza tym samym replikację końców chromosomów. W kolejnym cyklu to się powtarza. Tak się to odbywa przy podziale komórek płciowych, gdzie absolutnie niemożliwy jest jakikolwiek defekt. (rys.)

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html - ładny filmik - nie potrafię go tu skopiować

rys. 9 Aktywność telomerazy

Jest charakterystyczne, że w nowotworach reindukuje się aktywność telomerazowa. Mechanizm tego nie jest jasny, ale jest to jeden z mechanizmów zabezpieczenia komórek nowotworowych, przed śmiercią. Byłoby dla nas bardzo dobrze, aby komórki nowotworowe, które się replikują bardzo szybko, bez kontroli obcinały sobie końce, bo w którymś momencie replikacja stawałaby w naturalny sposób. Natomiast zazwyczaj jest tak, że system nowotworzenia jest w stanie indukować aktywność telomerazową.

PUNKTY KONTROLNE CYKLU KOMÓRKOWEGO

Rys. 10 Punkty kontrolne (checkpoints) cyklu komórkowego.

Oprócz licencjonowania, o którym mowa była w początkowej części wykładu, istnieje kilka innych punktów kontrolnych w cyklu komórkowym.

Są to m. in. Punkty związane z obecnością białek:

• p53 jest to kluczowe białko w supresji nowotworów. Bardzo wiele dziedzicznych nowotworów (występujących u bliskich krewnych z dużą częstością) jest spowodowanych mutacją w tym białku. Białko to odpowiada za kontrolę jakości DNA przed replikacją, choć bierze również udział w późniejszych etapach cyklu. Białko to jest w stanie zatrzymać cykl komórkowy i nie dopuścić do replikacji i podziału w razie nieprawidłowości.

• Rad9 - kontroluje kompletność zreplikowania - sprawdza, czy są tak duże defekty po replikacji, że nie warto wchodzić w mitozę. Jeżeli takie defekty są, proces wejścia w mitozę jest zatrzymany

• Sam proces asocjacji chromosomów i tworzenia wrzeciona kariokinetycznego jest pod kontrolą.

• Mec1, ATM - kontrolują przebieg replikacji (mutacje tych białek są również bardzo częste w nowotworach).

Chromosomy politeniczne

Są to chromosomy widoczne gołym okiem, gdyż syntezie DNA nie towarzyszył rozdział chromosomów, np. u Drosophili 10 rund replikacyjnych bez rozdzielania powoduje powstanie 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie, w pełnej odpowiedniości loci chromosomów.

Są to chromosomy, których funkcje zmieniają się pod wpływem tego ułożenia (ma to swoje odzwierciedlenie np. w procesie transkrypcji). Jest to korzystne ułożenie dla badaczy, ponieważ można było niemal gołym okiem obserwować po kolei, co zachodzi podczas replikacji. Tu obserwowano m.in. tzw. puffy chromosomowe związane z aktywną transkrypcją. Można też było obserwować oddziaływania między homologicznymi loci, a także takie procesy, jak np. aktywacja transkrypcji po dodaniu hormonów.

Historycznie rzecz biorąc, olbrzymia liczba informacji została uzyskana dzięki analizie tych chromosomów.

PCR- polimerase chain reaction

PCR stanowi biotechnologiczne zastosowanie wykorzystujące właściwości replikacji.

Był to genialny wynalazek Kary'ego Mullisa, amerykańskiego biochemika w połowie lat 80-tych, który wymyślił tak naprawdę coś, co każdy mógł wymyślić - leżało to po prostu na talerzu;).

Wiąże się z tym słynna historia walki patentowej, gdyż Mullis nie opatentował tego sensownie na czas i wiele firm tworzących polimerazy i termocyklery próbowało ten początkowy patent obejść i obalić. Twierdzili, że gdy Kornberg dostał Nobla za wykazanie polimeryzacji DNA w komórkach, to właściwie wówczas już wszystko było wiadome, i że odkrycie Mullisa nie jest żadnym odkryciem. Na świadka w tej sprawie powołano właśnie Konberga, który początkowo też tak twierdził, jednak gdy zacytowano fragment jego książki pochodzącej z okresu sprzed rozprawy, gdzie oświadczył, że jest pełen podziwu i uznania dla odkrycia Mullisa i sam na to nie wpadł;) cała sprawa padła.

Reakcja ta jest wielką rewolucją biologii molekularnej!!!

Już kilkanaście cykli wystarczy do wytworzenia interesującego nas fragmentu DNA (od primera do primera) w olbrzymiej liczbie kopii. Zamiast kompleksu rozplatającego -podwyższamy temperaturę itd. Mullis udowodnił w bardzo prymitywny sposób, że PCR jest w ogóle możliwy np. dodawał za każdym razem primerów i polimerazy (ulegała termicznej inaktywacji).

Obecnie okazało się, że można pominąć wiele etapów manewrując odpowiednio temperaturą. Używa się również w tym celu polimeraz z termofilnych bakterii (np. Polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis.), które nie denaturują pod wpływem wysokiej temperatury. Jest to genialny przykład tego, jak na podstawie znajomości procesu można wpaść na pomysł technologiczny.

USZKODZENIA DNA:

Mimo, że DNA znajduje się w komórce i chroniony jest przez jej struktury, nadal narażony jest na przeróżne zewnętrzne czynniki destrukcyjne.

Przyczyny uszkodzeń DNA

• O2, wolne rodniki

• UV

• Związki alkilujące

• Spontaniczna deaminacja (C przechodzi w U)

i ich efekty:

• Przerwanie łańcucha

• Modyfikacje chemiczne zasad

• Tworzenie źle sparowanych zasad itd.

Przykłady związków mutagennych:

1. Psoralen- związek pojawiający się w wielu substancjach, m. in. w dymie. Związek ten interkaluje pomiędzy zasady, dzięki temu, że hydrofobowe wnętrze struktury helisy dość chętnie przyjmuje związki o określonej strukturze tj. płaskie. Podobną budowę i właściwości ma bromek etydyny.

2. Nitrogen mustard - (crosslinking agent) - gaz musztardowy - interkaluje w DNA i zakłóca replikację

3. cis Platyna - jej działanie polega na utworzeniu krzyżowych wiązań między sąsiadującymi nićmi DNA oraz w obrębie tej samej nici. Pojawienie się takiego związku blokuje replikację.

W związku z tak licznym zagrożeniem muszą istnieć systemy, które są w stanie cały szereg tych procesów kontrolować są to tzw. systemy naprawcze DNA:

• Systemy helikazy XPA - został wykryty u ludzi chorych na nowotwór skóry Xeroderma pigmentosum, czyli u osób, które mają defekt w tym systemie. Wycina on dimery pirymidyn lub aberracje strukturalne. Częściowa naprawa tego jest lepsza niż brak replikacji.

• Homologi bakteryjnych białek typu Mut - naprawa błędnie sparowanych nukleotydów

• Glikozylaza DNA, Polimeraza δ - naprawa przez wycięcie nietypowych zasad w DNA (hipoksantyna, uracyl, zalkilowane zasady)

• Guanino 6-metylotransferaza - naprawa bezpośrednia (metyloguanina, dimery pirymidynowe)

W komórce jest, więc dość duży repertuar systemów naprawczych DNA , które ewoluowały jak do tego, aby chronić DNA przed zgubnymi wpływami środowiska. Jest to związane z tym, że zawsze było UV, wolne rodniki; z tym, że obecnie jest więcej chemicznych, syntetycznych substancji (zanieczyszczenie środowiska)

Rekombinacja DNA

W czasie mejozy dochodzi do rekombinacji międzyrodzicielskiej, która zapewnia zróżnicowanie. Dzięki rekombinacji, hipotetyczny trzeci organizm potomny pochodzący od tych samych organizmów rodzicielskich, ma inną sekwencje alleli niż te dwa początkowe. Na dłuższą metę proces ten umożliwia ewolucję (rearanżacje sekwencji DNA, powstanie nowych kombinacji genów, nowych rodzajów RNA i białek).

Proces rekombinacji jest ściśle związany z rekombinacja i naprawą DNA, gdyż bardzo wiele białek jest wspólnych dla tych trzech procesów.

Schemat rekombinacji mejotycznej

rys. 11 General recombination in meiosis. As indicated, the process begins when an endonuclease makes a double-strand break in a chromosome. An exonuclease then creates two protruding 3
single-stranded ends, which find the homologous region of a second chromosome to begin DNA synapsis. The joint molecule formed can eventually be resolved by selective strand cuts to produce two chromosomes that have crossed over, as shown.

Matczyny i rodzicielski organizm wymieniają homologiczne odcinki, wymiana ta prowadzi do utworzenia gamet z mieszanym układem alleli. To jest tzw. zmienność rekombinacyjna.

Rodzaje rekombinacji:

1. Homologiczna tzw. uprawniona - wymianie ulegają identyczne albo bardzo podobne sekwencje (silnie homologiczne) - są to długie sekwencje.

Katalizują białka typu:

Rec A - katalizuje przeniesienie nici z jednej cząsteczki dwuniciowej na drugą. Umożliwia też wniknięcie jednoniciowego fragmentu w strukturę dwuniciową (z utworzeniem przejściowego fragmentu trójniciowego).

W zależności od miejsca wniknięcia wyróżniamy rekombinacje :

• Miejscowo specyficzne (np. rearanżacje genów immunoglobulin) - występują w specyficznym loci, wymagają bardzo krótkich miejsc homologii - krótkich palindromowych sekwencji; nie wymagają białka recA, ale innych białek integralnych (integrazy=rekombinazy)

• Homologiczne - zachodzą w mejozie

Ten typ rekombinacji można wykorzystać do tzw. Podmienienia genów. Jest to możliwe u bakterii i drożdzy (gdyż u tych organizmów z dużą częstością zachodzi ten typ rekombinacji). U zwierząt stosuje się to rzadko (bądź w ogóle - w związku z dużym udziałem rekombinacji niehomologicznej), zaś u roślin nigdy, gdyż u nich rekombinacja homologiczna zachodzi raz na 10 tysięcy przypadków.

Schemat rekombinacji homologicznej

rys. 12 A Holliday junction and its isomerization. The synapsis step in general recombination is catalyzed by a RecA type of protein bound to a DNA single strand. This step is often followed by a reciprocal exchange of strands between two DNA double helices that have thereby paired with each other. This exchange produces a unique DNA structure known as a Holliday junction, named after the scientist who first proposed its formation. (A) The initially formed structure contains two crossing (inside) strands and two noncrossing (outside) strands. (B) An isomerization of the Holliday junction produces an open, symmetrical structure. (C) Further isomerization can interconvert the crossing and noncrossing strands, producing a structure that is otherwise the same as that in (A).

Występowanie charakterystycznych struktur Hollidaya - etap pośredni (czteroniciowe DNA)

Inny rodzaj rekombinacji:

2. Niehomologiczna tzw. nieuprawniona - wymiana zachodzi między niehomologicznymi fragmentami lub bardzo krótkimi homologicznymi.

Bardzo częsta u roślin.

W przypadku tego rodzaju rekombinacji ważną rolę odgrywa polimeraza RNA. Dodatkowo, jeśli miedzy rekombinującymi sekwencjami w ogóle nie ma homologii, niezbędna jest gyraza i topoizomeraza II.

13

---