Zestaw nr 86
1.Biosynteza nukleotydow pyrynowych-przebieg,regulacja.
2.Kompleks syntezy kwasow tluszczowych.
3.Metody izolacji i oczyszczania bialek.

Ad.1.
szlak rezerwowy: aktywowana ryboza (PRPP=5-fosforybozylo-1-pirofosforan)+zasada=nukleotyd

szlak de novo:PRPP + skladanie zasad z prostszych związków (aa,CO2,ATP,…)
powstające rybonukleotydy w wyniku redukcji rybozy przeksztalacaja się do deoksyrybonukleotydow
pirymidyny-najpierw budowany szkielet zasady,potem przylaczany jest do rybozy; puryny odwrotnie (poszczególne fragmenty stopniowo dobudowywane do rybozy)




szlak rezerwowy
wolne zasady (z rozpadu nukleotydow,hydrolizy kwasow nukleinowych nukleinowych,z pożywienia)+PRPP=>monofossforany nukleotydow + PPi
-fosforybozylotransferaza adeninowa
adenina+PRPP=>adenylan+PPi
-fosforybozylotransferaza hipoksantyno-guaninowa (HGPRT)
guanina+PRPP=>guanylan+PPi
hipoksantyna+PRPP=>inozynian+PPi
inozynian(inozynomonofosforan,IMP)-prekursoe guanylanu i adenylanu

szlak de novo
1.1)α-D-rybozo-5-fosforan przekształca się (pod wpływem syntazy PRPP,jonow magnezu i ATP przekształcającego się do AMP) do PRPP
2)PRPP (pod wpływem poniższego enzymu i NH3 z hydrolizy glutaminy) przeksztalca się do 5-fosforybozylo-1-aminy (wydziela się PPi=>pirofosfataza do 2Pi)
fosforybozyloamidotransferaza (amidotransferaza glutamylo-PRPP) sklada się z dwóch domen:
1.homologiczna do fosforybozylotransferaz uczestniczących uczestniczących szlaku rezerwowym syntezy nukleotydow
2.odpowiedzialna za pozyskiwanie NH4+ z hydrolizy glutaminy (Gln)
-rozni się od domeny pełniącej te sama funkcje w syntetazie karbamoilofosforanowej

na aminowym koncu enzymu jest cysteina - ulatwia hydrolize Gln
przymuje konfiguracje aktywna tylko gdy zwiaze się do niego PPPP jak i glutaminian (Glu)=>ochrona obu substratow przed zamrnowaniem
-podobienstwa: jony amonowe (uwolnione z Gln) przenoszone sa tunelowo na PPPP do otoczenia
2.synteza pierścienia purynowego-9etapow=>pierwsze szesc to reakcje analogiczne,bo większość katalizowana przez enzymy zawierajace domeny wiążące ATP, homologiczne do domeny syntetazy karbamoilofosforanowej, każdy etap sklada się z aktywacji tlenu związanego związanego atomem wegla (grupa karbonylowa) na drodze fosforyzacji, po której nastepuje wymiana grupy fosforanowej przez NH4+ lub grupe aminowa (działające jako nukleofile).Reakcja ta zuzywa ATP.


3)
4)aktywacja mrówczanu i jego przyłączenie do grupy aminowej glicyny=>nowe wiazanie amidowe, u niektórych organizmow dwa rozne enzymy katakizuja ten etap:
1))dostarcza grupe formylowa grupek N10-formylotetrahydrofolianu
2))aktywuje mrówczan do formylofosforanu,który nastepnie zostaje bezpośrednio przyłączony do grupy aminowej glicyny
5)podstawienie tlenu karbonylowego grupa NH
6)cyklizacja;cyklizacjaeakcja preferowana termodynamicznie,ale zuzycie ATP do blokowania odwracalności tej reackji
7)przyłączenie wodorowęglanu do egzocyklicznej grupy aminowej
8)grupa karboksylowa imidazolu ulega ponownie fosforyzacji.po której nastepuje podstawinie grupy fosforanowej grupa aminowa pochodzaca z asparaginianu (Asp)
9)z Asp pozostaje tylko atom azotu
enzym homologiczny enzymowi przeksztalacajacemu cytruline w arginine w cyklu mocznikowym
10)przyłączenie grupy formylowej z N10-formylotetrahydrofolianu do atomu N
11)
3 wielofunkcyjne katalizatory:
3,4 i 6
7i8
10i11

3.Konwersja IMP do AMP i GMP



AMP lub GMP po wpływem kinezy nukleozydomonofosforanowej i ATP przeksztalacja się do ADP i GDP
nastepnie ADP w wymiku fosforyzacji oksydacyjnej lub glikolizy w cyklu Kresa przeksztalca się do ATP
GDP pod wpływem kinezy nukleozydodifosforanowej przeksztalca się do GTP

*rybonukleotydy-redukcja z wykorzystaniem mechanizmu rodnikowego do deoksyrybonukleotydow


kompleks reduktazyrybonukleotydowej aktywny tylko gdy komorki aktywnie syntezuja DNA podczas przygotowania do podzialu komorki

*Blokowanie biosyntezy nukleotydow purynowych (leki przeciwfolianowe i analogi glutaminy):
=>zahamowanie tworzenia związków tetrahydrofolianowych (reakcja 4i10)
=>azaseryna(reakcja7)
=>diazanorleucyna (reakcja 3)
=>6-merkaptopuryna (reakcja 13 i 14)
=>kwas mykofenolowy (reakcja 14)
=>niedobor kwasu foliowego foliowego wit.B12-wtorny niedobor pochodnych folianowych
=>cPRPP


synteza PRPP wrazliwa na stężenie fosforanu i stężenie rybonukleotydow purynowych - allosteryczne regulatory
=>sprzężenie zwrotne

oddziaływania allosteryczne reguluja redukcje rybonukleotydow do deoksyrybonukleotydow
reduktaza rybonukleotydowa tlenowych bakterii escherichia Coli ma dwa miejsca allosteryczne:1.kontroluje calkowita aktywność enzymu
spada po związaniu dATP a ATP odwraca efekt hamowania (sprzężenie zwrotne)
2.specyficznosc substartowa
dAtp lub ATP związany=>intensyfikacja redukcji nukleotydow pirymidynowch UDP,CDP
DTP (trifosforan deoksytymidyny)=>wzrost redukcji GTP oraz hamuje dalsza redukcje nukleotydow pirymidynowcyh
wzrost DTP=>aktywuje redukcje ATP do daTP













Ad.2.Proces wydłużania łańcucha kwasow tluszczowego(skladania z fragmentuow dwuweglowych) zachodzi pod dzialaniem syntezy kwasow tluszczowych (synteza KT).Jest to enzym o szczegolnnych wlasciowsciach.Ma strukture diemryczna.Kazdy monomer wykazuje 7 aktywnosci enzymatycznych oraz zawiera domene,która kowalencyjnie wiaze jedna cząsteczkę fosfopanteteiny(Pan-SH).W komorkach prokariotycznych domena wiazaca Pan-SH wystepuje pod postacia odrębnej czasteczk izwanej bialkiem przenoszącym grupy acylow(ACP).Terminu tego uzywa się w odniesienu do komorek eukariotycznych majac na mysli wspomniana domene syntezy KT.ACP jest przejściowym nosnikiem grup acylowcy wiążących się z siarka grup SH fosfopanteteiny.Enzymy zaangażowane zaangażowane biosynteze kwasow tluszczowych nie SA odrębnymi bialkami enzymatycznymi lecz specjalistycznymi domenami w obrebie jednej monomerycznej czasteczki syntezy KT.
Domena1:malonylotransferaza,acetylotransferaza,synteza ketoacylowa (przyłączenie acetylu i malonylu oraz ich kondensacja)
Domena2:reduktaza enoilowa,dehydrataza,reduktaza ketoacylowa,ACP)=>redukcja
Domena3:tioesteraza=>uwolnienie palmitynianu










Ad.3.Oczyszczanie
Schemat uzyskiwania czystej frakcji białek z materiału biologicznego

1. Ekstrakcję białka z materiału biologicznego rozpoczynamy od homogenizacji tkanki w

zimnym ( ok. 4ºC ) buforze. Do buforu dodajemy inhibitory proteaz aby zapobiec proteolizie .

2. Wytrząsanie z H2O Ⴎ białka rozpuszczalne w H2O przechodzą do roztworu

3. Ekstrakcja białka do 1:1 etanol : chloroform

4. Wysalanie przy odpowiednim stężeniu soli ( wypada kilka białek )

5. Wsalanie

6. Wytrącanie w pJ ( kilka białek ). Pozbywamy się przy okazji znacznej ilości białek

balastowych.

7. Adsorbcja na żelu fosforanowo - wapniowym

8. Elucja z żelu

9. Wysalanie

10. Wsalanie

11. Oczyszczanie końcowe i analiza .

Na każdym etapie oczyszczania należy kontrolować obecność badanego białka

Uzyskiwanie frakcji białkowych

1. Wirowanie różnicowe

- f. Jąder komórkowych i nie rozerwane fragmenty komórkowe - wirowanie 600 G 3 minuty

- f. Mitochondriów , chloroplastów , lizosomów i peroksysomów - wirowanie 6000 G 8 min.

- f. Mikrosomalna : błony komórkowe , fragmenty aparatu Golgiego i ER

wirowanie - 40 000 G 30 min.

- f. Podjednostek rybosomów - wirowanie 100 000 G 90 min. W roztworze pozostają białka

cytoplazmatyczne.

- f. Białek cytoplazmatycznych - wirowanie Ⴍ 100 000 G

2. Wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy ( lizosomyႮ mitochondria Ⴎ peroksysomy )

Izolacja
Rozdział mieszaniny białek

- biorąc pod uwagę wielkość ( rozmiar ) cząsteczek :

• Elektroforeza żelowa ( na żelu poliakryloamidowym ) w obecności SDS - rozdział białek

odbywa się na podstawie masy cząsteczkowej białka .

• Chromatografia żelowa - filtracja żelowa ( sączenie molekularne ). Fazą nieruchomą jest

żel polisacharydowy , który dzaiła jak sito molekularne . Jego cząstki zawierają wypełnione

wodą puste przestrzenie - kanaliki - do których przenikają małe i średnie cząsteczki . Duże

cząsteczki pozostają na zewnątrz. Odpowiedni rozpuszczalnik wymywa je.

• Ultrafiltracja

• Ultrawirowanie - wirowanie w gradiencie gęstości.

W tym celu nawarstwia się roztwory sacharozy o różnej gęstości. Podczas wirowania

białka wędrują tak długo aż własna gęstość białka zrówna się z gęstością rozpuszczalnika.

Po odwirowaniu rozdzielamy warstwy przez kolejne zlewanie każdej z nich z osobna.

- biorąc pod uwagę ładunek elektryczny :

• Chromatografia jonowymienna

• Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przy odpowiednim pH , które ustala się przez zastosowanie buforu , różne białka wędrują

w polu elektrycznym zgodnie ze swoim ładunkiem elektrycznym. Cząsteczki białka o

wypadkowym cząstkowym ładunku ujemnym wędrują w kierunku Anody, białka

posiadające ładunek dodatni - w kierunku Katody. Prędkość wędrówki zależy od sumy

ładunków , wielkości i kształtu cząsteczki . ( Elektroforeza dyskowa , Immunoelektroforeza )

• Elektroforeza w gradiencie pH - ogniskowanie izoelektryczne

Białko będzie wędrowalo do momentu osiągnięcia pozycji , w której pH żelu

zrówna się z pH białka .

• HPLC

- biorąc pod uwagę wielkość cząsteczki i ładunek elektryczny

• Rozdzielanie na podstawie rozpuszczalności .

Polega na wysalaniu z roztworu wodnego solami obojętnymi np.: (NH4)2SO4 lub MgSO4

Do roztworu białek dodaje się wzrastającą ilość soli każdorazowo odwirowując wytrącone

białko. Przez zmianę pH metodę można udoskonalić. Metoda ta stosowana jest tylko do

oczyszczania wstępnego .

Po wyizolowaniu białka w czystej postaci wyżej wymienionymi metodami białko należy

scharakteryzować pod względem chemicznym :

- przez wyznaczenie punktu izoelektrycznego

- przez wyznaczenie względnej masy cząsteczkowej

- przez analityczne oznaczenie całkowitego stężenia białka

- charakterystyka immunologiczna

Metody wyznaczania względnej masy cząsteczkowej :

• ultrawirowanie przez wyznaczenie stałej sedymentacji Svedberga

• na podstawie składu białka ( oznaczamy ilość O , C , N , S Ⴎ masa białka )

• na podstawie ciśnienia osmotycznego jakie białko wywiera na błonę półprzepuszczalną

w ściśle określonym pH i stężeniu białka w roztworze.

• na podstawie efektu Tyndala ( rozpraszania światła )

• chromatografia na sitach molekularnych

• Elektroforeza żelowa SDS

• Metoda wirowania w różnych gradientach stężeń

60 - 20% roztwór sacharozy

6M roztwór chlorku cezu sam tworzy gradient

Są to metody porównawcze naszego białka z białkiem stanowiącym wzorzec standardowy.

---