MSIB |
Aleksandra Benko
|
Rok II, grupa 1/1 |
26.03.09 Data oddania : 10.04.2009 |
|
Ocena
|
1. Wstęp teoretyczny
Barwniki roślinne to złożone substancje chemiczne, występujące we wszystkich ogranizmach roślinnych zasiedlających Ziemię. Większość z nich to barwniki fotosyntetycznie czynne, które aktywnie uczestniczą w procesie fotosyntezy. Ich rolą jest pochłanianie energii świetlnej i wykorzystywanie jej do syntezy złożonych związków organicznych (jak np. glukoza), bedących swoistymi „magazynami” energii chemicznej.
Barwniki fotosyntetycznie czynne to przede wszystkim chlorofil (w tym głównie chlorofil a i b), oraz barwniki pomocnicze, jak karotenoidy i ksantofile (w tym głównie luteina i wiolaksantyna).
Funkcja biologiczna barwników warunkuje ich właściwości fizykochemiczne, takie jak absorbancja (czyli zdolność do pochłaniania światła o określonym zakresie długości fali) oraz transmitancja (czyli zdolność do przepuszczania światła)
Dobrze poznane widma absorpcyjne barwników roślinnych umożliwiają zastosowanie przy ich wykrywaniu łatwej metody spektrofotometrii.
Metoda spektrofotometrii opiera się na pomiarze zjawiska absorpcji, lub odbicia światła w badanej substancji, zależnie od długości fali światła padającego. Każda substancja wykazuje różne poziomy absorpcji dla różnej długość fal świetlnych.
Zastosowanie ma tu prawo Lamberta-Beera, które głosi, że dla współczynnika absorpcji rozpuszczalnika równego zeru, wiązka promieniowania monochromatycznego, po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c, ulega osłabieniu zgodnie z równaniem:
gdzie:
k - współczynnik absorpcji.
b - grubość wartswy roztworu
c - stężenie roztwou
Iₒ - natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego
It - natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór.
Po prostych przekształceniach otrzymujemy wzór na absorbancję, wykorzystywany w nasyzm doświadczeniu :
gdzie:
a = 0.4343k
2. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą spektrofotometrii, oraz poznanie jej zastosowania w analizie składu chemicznego różnorakich substancji.
3. Wykonanie ćwiczenia
Ekstrakcja barwników
Pierwszym punktem ćwiczenia jest wyekstrahowanie z liści pietruszki barwników roślinnych. W tym celu rozcieramy je w moździerzu wraz z acetonem, piaskiem (ułatwia rozcieranie), węglanem wapnia (zobojętnia środowisko) i askrobinianem sodu, który ma działanie przeciwutleniające.
Następnie przy, pomocy pipet Pasteura, przesączamy roztwór przez nasączoną acetonem bibułkę.
Przygotowanie linii bazowej
Przed rozpoczęciem właściwego pomiaru koieczne jest ustalenie linii bazowej, która stanowi referencję dla badanej substancji. Linię bazową zawsze ustala się przy użyciu rozpuszczalnika, w którym nasza substancja jest rozpuszczona. Dzięki temu pomiar nie jest zakłócony przez widma absorbcyjne rozpuszczalnika.
W naszym przypadku linię bazową stanowić będzie widmo absrobcyjne acetonu. Aby je uzyskać, przy pomocy pipety automatycznej, odmierzamy 2ml acetonu i przelewamy je do kuwety kwarcowej, którą następnie umieszczamy w spektrofotometrze. Następnie, w programie ustalamy parametry pomiarowe. Zakres pomiarowy ustawiamy na 800 - 330nm, szybkość pomiaru - 600nm/min, dokładność - 1nm i startujemy pomiar. Następnie wybieramy opcję base line. Od teraz widmo absorbcyjne acetonu stanowi naszą bazę pomiarową.
Pomiar widm absorbcyjnych roztworu
Rozpoczynamy pomiar absorbancji mieszaniny barwników fotosyntetyzujących w tym celu należy tak rozcieńczyć próbkę acetonem, aby absorbancja mieściła się w przedziale od 0,3 do 1. W pierwszym podejściu rozcieńczamy próbkę w stosunku 1:4 (400μl próbki na 1600μl acetonu). Abosrbancja wychodzi ponad 4, a więc przyjęliśmy zbyt małe rozcieńczenie :
Dodajemy do naszego roztworu kolejne 1600μl acetonu. Teraz próbka rozcieńczona jest w stosunku 1:8. I znów, absrobancja wynosi ponad 1.
Teraz bierzemy 200μl naszej próbki rozcieńczonej w stosunku 1:8 i dodajemy do niej kolejne 1600μl acetonu. Dzięki temu, nasza próbka rozcieńczona jest w stosunku 1:80. Otrzymujemy następujący wykres widma absorbancji :
Dla mieszaniny barwników absorbancja osiąga maksimum w zakresie długości fal 636 -686nm oraz 510 - 410 nm
Wykonanie chromatogramu
Kolejnym punktem ćwiczenia jest wyekstrahowanie z mieszaniny poszczególnych barwników roślinnych. W tym celu sporządzamy ich chromatogram. Zaczynamy od zaznaczenia na bibułce prostej linii przy pomocy ołówka. Następnie, nanosimy na naszą linię przy pomocy pipety Pasteura warstwę naszego roztworu. Suszymy bibułkę i nanosimy w ten sam sposób 2 kolejne warstwy. W międzyczasie, przygotowujemy komorę chromatograficzną - do dużej zlewki wlewamy cienką warstwę eluentu (mieszanina benzyny i acetonu) i następnie zamykamy zlewkę. Dzięki temu komora napełni się oparami eluentu.
Przesuszoną bibułę energicznym ruchem umieszczamy w komorze tak, aby jej dolna krawędź na całej swojej długości zetknęła się z eluentem równocześnie - miało to wpływ na dokładne rozdzielenie się warstw.
Po pewnym czasie obserwujemy wędrówkę barwników ku górze wzdłuż bibuły. Rozdzielenie poszczególnych związków jest związane ze znaczną różnicą w ich masach cząsteczkowych. Najcięższy barwnik - chlorofil a - osadza się na samym dole bibuły. Natomiast najlżejszy - β- karoten - na górze.
Otrzymany chromatograf przedstawia się następująco :
Patrząc od góry na chromatogram widzimy kolejne barwniki :
- β- karoten
- luteinę
- chlorofil a
- chlorofil b
Pomiar widm absorbcyjnych poszczególnych barwników :
Otrzymany chromatograf rozcinamy na paski, z których każdy zawiera inny barwnik. Każdy z pasków umieszczamy w osobnej probówce i zalewamy 2ml acetonu, co powoduje wyekstrahowanie barwników z bibuły. Następnie, rozcieńczamy wszystkie barwniki w stosunku 1:1 i badamy kolejno ich widma absorbcyjne.
|
Barwnik |
Maksima absorpcji [nm]
|
A1/A2 |
ε [M-1 cm-1] |
|
|
|
λ1 |
λ2 |
|
|
Wartości tablicowe |
Chlorofil a |
430 |
662 |
1.22 |
82.6 × 103 |
|
Chlorofil b |
456 |
645 |
2.81 |
46.9 × 103 |
|
β-karoten |
450 |
477 |
⎯ |
134.4 × 103 |
|
luteina |
447 |
475 |
⎯ |
127.2 × 103 |
Wartości otrzymane |
|
|
|
|
C [μg/ml] |
|
Chlorofil a |
431 |
662 |
1,33786 |
17,98 |
|
Chlorofil b |
457 |
645 |
2,897461 |
11,93 |
|
β-karoten |
452 |
470 |
1,162542 |
|
|
luteina |
448 |
476 |
1,115492 |
|
Otrzymane wartości absorbancji i maksimów są zbliżone do oczekiwanych. Świadczy to o dużej czystości otrzymanych preparatów.
4. Analiza wyników
Na podstawie wyników obliczamy stężenia poszczególnych barwników w roztworze, korzystając ze wzorów :
A więc badane stężenia naszych barwników będą równe :
Chlorofil a = 11,75 * 1,599586 - 2,35 * 0,349882 = 17,98 [μg/ml]
Chlorofil b = 18,62 * 0,701498 - 3,96 * 0,283679 = 11,93 [μg/ml]
β-karoten = [1000 * 0,575337 - 2,27 * 17,98 - 81,4 * 11,93] / 227 = -1,9 [μg/ml] - ujemny wynik może wynikać z niedokładnego określenia wartości absorpcji w punktach maksimów
Korzystając z prawa Lamberta i Beera obliczamy stężenie składników w wyjściowej próbce :
A więc po przekształceniach :
Stężenia dla poszczególnych barwników (l = 1cm):
Chlorofil a = 2,6 * 10-5
Chlorofil b = 4,3 * 10-5
β-karoten = 0,5 * 10-5
luteina = 1,2 * 10-5
5. Wnioski
Pomocnicze barwniki roślinne - kartotenoidy i ksantofile poszerzają pasma absorbancji.
Spektrofotometria to łatwa, a zarazem bardzo dokładna metoda badawcza. Dzięki niej otrzymujemy przydatne informacje o składzie jakościowym i procentowym badanej substancji. Wszystkie te zalety sprawiają, że znajduje ona szeroką gamę zastosowań zarówno w chemii, biologii, jak i fizyce.
Wyszukiwarka