ANDROLOGIA Pałka

Ćwiczenie 1.

Plan badania inseminacyjnego ♀ zwierząt domowych.

Sztuczna inseminacja jest bardzo korzystna, bo nie dochodzi do przenoszenia chorób zakaźnych, nie ma kontaktu ♂ z ♀. Poza tym mając jednego ♂ możemy zapłodnić kilka ♀, a gdyby wszystko miało być naturalnie, to biedak by się męczył i pewnie niewiele by zdziałał. Potrzebny jest lek. wet. oraz pipeta inseminacyjna i dawka nasienia. No i oczywiście przydałaby się samica z owulacją. Nasienie można podać:

- dopochwowo- mało skuteczne

- domacicznie

- doszyjkowo- najlepsza metoda

U klaczy trzeba włożyć rękę do pochwy, umieścić palec w szyjce macicy i po palcu wprowadzić pipetę inseminacyjną do szyjki. U suk pipetę wprowadza się po sromie- po górnym sklepieniu pochwy do końca i deponujemy nasienie.

Technika podania zależy od rodzaju nasienia. A może ono być:

- świeże

- schłodzone

- mrożone

Świeże nasienie deponujemy od razu, natomiast schłodzone i zamrożone należy podgrzać.

Przydatne są rozrzedzalniki, które rozrzedzają nasienie i zwiększają przeżywalność plemników. Można samemu je zrobić, np. mleko UHT + żółtko, ale lepsze są gotowe.

Plan badania ♀:

1. Opis zwierzęcia: (Generalia)

- gatunek

- rasa

- wiek

- umaszczenie

- waga

- identyfikacja (kolczyki, tatuaże, znaki szczególne)

2. Wywiad: (Anamnesis)

- pochodzenie zwierzęcia i okres jego posiadania

- warunki żywienia, pielęgnacji i utrzymania ♀

- w przypadku krów- czy ♀ nie pochodzi z ciąż bliźniaczych różnopłciowych (należy wykluczyć zjawisko frymartynizmu- forma obojnactwa występująca u bydła i owiec).

Przyczyną tej formy obojnactwa jest oddziaływanie na płód żeński testosteronu, produkowanego przez płód męski. Hormon ten przenika do płodu ♀ poprzez połączenia naczyniowe (anastomozy), powstające pomiędzy łożyskami rozwijających się płodów bliźniaczych.

- dane dotyczące czasu trwania, przebiegu i zejścia dotychczasowej ciąży, porodów, okresów poporodowych, ze szczególnym uwzględnieniem ostatniej ciąży. Charakter i długość występowania lochii po porodzie, łożysko (jeśli nie odeszło- kto udzielał pomocy), czas w jakim pojawiła się pierwsza ruja po porodzie.

- dane dotyczące rui: czas trwania, nasilanie objawów zewnętrznych, powtarzanie rui, ew. brak rui, ciche ruje, nieregularność w cyklu rujowym, czas w jakim zostały zaobserwowane zewnętrzne objawy obecnej rui

- ile razy ♀ była inseminowana (kryta) i w którym okresie rui; czy była reinseminacja (powtórna inseminacja w czasie trwania tej samej rui)

- czy do inseminacji ponownych użyto nasienia tego samego ♂- jeśli tak, to ile razy

- dane dotyczące zabiegu inseminacji- kto robił, technika unasienniania, miejsce deponowania nasienia, czy nasienie było wcześniej rozmrożone, czy ma atest

- czy właściciel w okresie międzyrujowym zauważył wypływy z dróg rodnych, jak tak to jakiego charakteru, obfitość, konsystencja, barwa

- w przypadku jałówek- czy po rui było zaobserwowane krwawienie z dróg rodnych

3. Badanie kliniczne:

A. Stan ogólny:

- budowa, stan odżywienia i utrzymania

- zachowanie psychoseksualne: zewnętrzne objawy rui, samcze zachowanie płciowe, wirylizm (Cechy samcze u osobników ♀. Jedną z postaci jest wirylizm nadnerczowy, spowodowany wytwarzaniem w korze nadnerczy związków o właściwościach androgennych. Schorzenie dotyczy najczęściej bydła i klaczy)

- błony śluzowe widocznych otworów ciała ze szczególnym zwróceniem uwagi na błony śluzowe pochwy

- CTO

B. Badanie przez oglądanie:

- zewnętrzne części narządu rodnego: wypływy, ich charakter (ciągły, okresowy, skąpy, obfity) i rodzaj (śluzowy, śluzowo-ropny, ropny), obrzęk sromu, błona śluzowa przedsionka pochwy

- zwrócić uwagę na ewentualne ślady po wypływie, zwłaszcza na włosach sromowych, wewnętrznej stronie ogona, guzach siedzeniowych

- wargi sromowe: położenie, pofałdowanie, wielkość, symetria, wrażliwość, nalanie

- srom i szpara sromowa: zamknięta, rozwarta, ziejąca

C. Badanie przez prostnicę: (Exploratio per rectum)

- szyjka macicy: położenie, grubość, tkliwość, przesuwalność, konsystencja

- macica: położenie, wielkość, konsystencja, wrażliwość, przesuwalność, zawartość

- rogi macicy: grubość (wielkość), symetria

- jajowody: fizjologicznie niewyczuwalne

- jajniki: w czasie rui badanie jajników ma ograniczone znaczenie z powodu ryzyka uszkodzenia pęcherzyka jajnikowego. Jeśli zachodzi konieczność przeprowadzenia badania, należy zachować jak najdalej idącą ostrożność. W trakcie badania zwrócić uwagę na: położenie, wielkość, kształt, strukturę powierzchni, wrażliwość, próba na wyłuszczenie z kieszonki jajnikowej

- więzadła szerokie macicy: położenie, napięcie, tętnica maciczna środkowa (grubość, drżenie- może świadczyć o ewentualnej ciąży lub stanach zapalnych macicy)

- badanie USG

D. Badanie przez pochwę: (Exploratio per vaginam)

- przy pomocy wziernika: ocena barwy i stanu powierzchni błony śluzowej pochwy; ilość i jakość wydzieliny; stan zewnętrznego (pochwowego) ujścia szyjki macicznej (portio vaginalis uteri)- wielkość, barwa, położenie, stopień rozwarcia kanału szyjki, stan fałdów wokół ujścia szyjki

- badanie przy pomocy ręki: przestronność pochwy, obecność ew. patologii- guzy, pęcherzyki, ubytki tkanki, blizny, u krów gruczoł Bartholiniego, przewód Gärtnera, obrzęki, zmiany zapalne, stopień rozwarcia zewnętrznego ujścia szyjki macicznej, ilość i jakość wydzieliny (śluzu)

E. Badania dodatkowe:

- bakteriologiczne

- mykologiczne

- parazytologiczne

- cytohormonalne (krystalizacja śluzu, odczyn glikogenowy, oznaczanie poziomu progesteronu, badanie cytologiczne wymazu z pochwy, badanie histopatologiczne wycinka pochwy, pomiary oporności śluzu pochwowego).

Ustalenie optymalnego czasu krycia lub inseminacji:

Rozpoznanie i decyzja:

- ♀ zdrowa klinicznie- inseminować, kryć

- ♀ jałowa- odpowiednio leczyć

- ♀ niepłodna- eliminować z hodowli

Ustalenie czasu owulacji, rozpoznawanie rui:

1. Objawy kliniczne

2. Badanie per rectum- krowy i klacze

3. Badanie USG- najbardziej przydatne u klaczy

4. Badanie per vaginam- wzierniki, waginoskopia

5. Użycie ♂ próbnika

6. Użycie ♀ stymulowanych testosteronem, tak, aby wywołać u nich zachowanie jak u ♂

7. Tresowane psy

8. Pedometry- w przypadku krów utrzymywanych w chowie stanowiskowym

9. Urządzenie znaczące typu KAMAR- w przypadku krów w chowie wolnostanowiskowym

10. Badanie oporności śluzu pochwowego- najchętniej wykorzystywane u krów i suk

11. Test arboryzacji (krystalizacji) śluzu szyjkowego

12. Odczyn glikogenowy Macka

13. Oznaczanie poziomu hormonów płciowych (głównie progesteronu)

14. Badanie cytologiczne wymazu z pochwy

GATUNEK: DŁUGOŚĆ RUI: CZAS OWULACJI:

Krowy 4 - 24 godz. (18) -średnio ok.30 godz. od początkowych objawów rui

Klacze 3 - 9 dni ( 5 ) - 24 - 48 godz.- przed zakończeniem rui (blisko 80% klaczy). Najczęściej między godz. 16 a 8 rano.

Owce 3 - 84 godz. (24-36) - 20 - 40 godz. od początkowych objawów rui

Kozy ok. 36 godz. - 30 - 36 godz. od początkowych objawów rui

Świnie 48 - 72 godz. - zazwyczaj w 43 godz. od początku rui,

z wahaniami od 35 - 55 godz.

Suki 2 - 12 dni, duże wahania - 48 - 72 godz. po piku LH, trwa do 72 godz. (w zależności od wł. osobniczych) Przypada z reguły na 9 - 13 dzień cieczki.

Kotki 4 - 10 dni (nawet do 21) - owulacja prowokowana, zwykle następuje po 27 godz. od momentu krycia

OPTYMALNY CZAS INSEMINACJI:

• Krowy- najczęściej 12 - 18 godz. od początku rui. W praktyce wieczorem- jeśli ruję zauważono rano, rano dnia następnego- jeśli ruję zauważono wieczorem. Przy rujach długich, reinseminacja po 12 godz. od inseminacji.

• Klacze- idealnie byłoby 6 - 12 godz. przed owulacją, ew. jak najszybciej po owulacji (stąd konieczność badania USG jajników co 4 - 6 godz.)

• Owce- 12 - 24 godz. od pierwszych objawów rui

• Kozy- 12 - 24 godz. od początkowych objawów rui

• Świnie- 16 - 20 godz. od rozpoczęcia rui u loszek i 22 - 26 godz. u loch. Zalecana reinseminacja po 12 - 18 godz.

• Suki- 24 - 48 godz. od chwili akceptacji ♂. Powtarzać krycia co 24 - 48 godz.

• Kotki- krycie w każdym momencie po akceptacji ♂, w przypadku inseminacji pamiętać o stymulacji dróg rodnych.

Ćwiczenie 2.

Schemat badania ♂ pod kątem płodności:

Jako płodność ♂ rozumie się zdolność do spermio- i spermatogenezy, prawidłową czynność neurohormonalną oraz odpowiednią aktywność plemników (prawidłowe przemieszczanie z jąder do ♂ układu rozrodczego). Spermatogeneza trwa 50-60dni, do70 (zależy od gatunku).

Istnieją specjalne przepisy- załączniki 1, 2, 3, 4 do Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Gospodarki Żywnościowej z 11.II.1999r. w sprawie szczegółowych warunków weterynaryjnych przy pozyskiwaniu, konserwacji, obróbce, przechowywaniu, wprowadzaniu do obrotu oraz prowadzeniu punktów kopulacyjnych i wykorzystywaniu materiałów biologicznych.

1. Wywiad:

- numer identyfikacyjny, paszport (konie, psy, bydło), tatuaże (tryki, świnie)

- rasa

- wiek

- nazwa ♂

- własność

- czas posiadania

- sposób i czas użytkowania

- rodowód

- dotychczasowa zapładnialność w wyniku krycia lub inseminacji (ilość ♀ pokrytych i ciąż).

Zapładnialność zależy m.in. od techniki inseminacji oraz przygotowania ♀

- odruchy płciowe

- przebyte choroby i leczenie

- wyniki obowiązkowych badań (u bydła: zwłaszcza pod kątem brucelozy, białaczki, trichomonadozy, kampylobakteriozy; u ogierów: pod kątem NZK, zarazy stadniczej, nosacizny). ♂ z tymi chorobami lub po ich przebyciu nie nadają się do rozpłodu. Obecnie ogiery eliminuje się też przy arteritis, ale nie jest to obowiązkowe.

- pełna dokumentacja dotycząca leczenia

2. Ocena warunków środowiskowych:

- żywienie, skład paszy (proporcje energii do białka)

- pielęgnacja, utrzymanie, pomieszczenia (czy przestronne, oświetlone, suche, z wybiegiem)

Ważne jest utrzymanie kondycji rozpłodowej:

- ogier: żywienie, ruch

- knur: żywienie, wybieg

- ogier, buhaj- układ kostny kończyn tylnych (stawy skokowe, pęcinowe)

Przy częstych kryciach oraz niedoborach mineralno-witaminowych może dojść do uszkodzenia stawów i ♂ nie może wykonać skoku, mimo zachowanej płodności.

- tryki: żywienie, pomieszczenie, okrywa w czasie upalnego lata (może być zaburzona termoregulacja)

- psy: żywienie, ruch, ułożenie- ♂ w wieku 6-8 mies. (do roku) mogą być czasem mocno pobudzone i gdy właściciel je za to karci to potem nie chcą kryć bo mają złe wspomnienia

3. Badanie ogólne:

- CTO, ogólna kondycja

- błony śluzowe naturalnych otworów ciała

- węzły chłonne

4. Badanie szczegółowe:

- skóra

- układ oddechowy (osłuchiwanie)

- układ pokarmowy

- krążenie

- układ moczowo-płciowy

- układ ruchu: badamy w spoczynku i w ruchu, postawa kończyn (wady postawy), stawy skokowe, koronowe, kopytowe. U buhajów na mokrym podłożu może dojść do rozrostu szpary międzyracicznej-limex, co wywołuje ból i tłumi objawy popędu płciowego.

5. Badania specjalistyczne:

- analiza i ocena odruchów płciowych- kolejność, czas trwania.

Odruchy płciowe:

Składają się z fazy progresywnej i regresywnej (zeskok). Są 3 grupy odruchów:

A. Odruchy zdalne:

- odruch zbliżenia płciowego (ważny jest węch, słuch, wzrok)

- odruch erekcji

- odruch wysunięcia prącia

- odruch mm. dźwigaczy jąder

B. Odruchy kontaktowe:

- odruch bezpośredniego dotyku (obwąchiwanie, oblizywanie, skubanie)

- odruch wspięcia

- odruch obejmowania

C. Odruchy kopulacyjne:

- odruch poszukiwania szpary sromowej

- odruch wprowadzenia prącia

- odruch ruchów kopulacyjnych (ogier, knur, pies)

- odruch ejakulacji

Buhaj, tryk i kozioł wykonują pchnięcie i już maja ejakulację. Inne zwierzęta wykonują ruchy kopulacyjne. U knura trwa to bardzo długo.

Faza regresywna: zeskok.

Ocena libido sexualis ♂:

Oceny dokonuje się na podstawie czasu potrzebnego na zainteresowanie ♀, podejścia do niej, odpowiednich odruchów płciowych. Od L₀ - L₄

L₄ - poniżej 5 min. od wyprowadzenia do dojścia do ♀ (trochę za szybki)

L₃ - 5-10 min. NAJLEPSZY!

L₂ - 10-15 min. (trochę za wolny)

L₀ - brak reakcji

6. Oglądanie narządów płciowych:

- worek mosznowy: kształt, symetria, wielkość, ew. termoregulacja

- jądra: wielkość, położenie, symetria, kształt, ew. zniekształcenia.

Buhaj, tryk- mają jądra ułożone pionowo, a ogier i pies- podłużnie, dogłowowo.

- napletek- okolica i ujście: zmiany, obrzęk, zranienia, wydzielina

7. Omacywanie:

Należy omacywać ostrożnie, stojąc z boku i nie dziwić się jak się zdenerwuje i kopnie.

- skóra na worku mosznowym: czy są zranienia, zgrubienia, blizny, włosy, reakcja na dotyk,

grubość skóry moszny

- jądra: kształt, wielkość, konsystencja (sprężysta, a po ejakulacji miękka), przesuwalność jądra w worku mosznowym

- najądrze- głowa, trzon i ogon: czy nie ma stwardnień, guzków- bo może mieć to wpływ na

wyprowadzanie nasienia z dróg rodnych

- powrózki nasienne- buhaj, tryk, kozioł: omacywać od jądra do góry- czy nie ma obrzęków, bolesności, u ogierów czasem zdarzają się skręty powrózka

- napletek: ujście, ew. wypływy. U tryka, kozła i buhaja napletek pokryty jest włosem. To powinno być obcięte, ale na tym pędzelku dobrze widać jak coś wycieka.

- czy prącie jest wysuwane z worka napletkowego (stulejka- phimosis- gdy nie może wysunąć; załupek- paraphimosis- gdy nie może wciągnąć z powrotem. U buhajów do 3 - 4mies. życia prącie fizjologicznie przyrośnięte jest do napletka!!

8. Badanie przez prostnicę: (dodatkowe gruczoły płciowe: wielkość, konsystencja, tkliwość):

- gruczoły pęcherzykowe: wielkość, symetria, konsystencja, tkliwość, przesuwalność- są to gruczoły parzyste, leżą w miednicznej części cewki(u buhaja mają kształt literyV, dł.5-6cm szer.1cm, a u starszych większe rozmiary). Wydzielina gruczołów jest plazmą dla nasienia.

- ampułki nasieniowodów (bada się u buhaja i ogiera)

- prostata- leży tuż za gruczołami pęcherzykowymi (psy mają tylko prostatę)

- gruczoły opuszkowo-cewkowe (u buhaja, tryka, kozła)

- podstawa prącia

- okoliczne węzły chłonne

9. Badanie nasienia: (ocena wstępna)

- objętość ejakulatu (dużą część stanowi wydzielina gr. płciowych dodatkowych)

- barwa, woń, konsystencja

- gęstość, pH

- ziarnistość

- ruch masy plemników, ruch indywidualny

- aglutynacja

Objętość ejakulatu jest właściwością gatunkową i indywidualną.

- ogier: 40 - 80ml.

- knur: 250 - 500ml.

- buhaj: 4 - 8ml.

- tryk: 2 - 4ml.

Barwa: mleczna, mleczno-biała, u tryków czasem żółtawa

Woń: samcza, typowa

Ziarnistość: zależy od gęstości nasienia, liczby plemników.

Tryk i kozioł mają najwięcej plemników w jednostce objętości.

• Ocena uzupełniająca:

- odsetek plemników martwych

- koncentracja plemników w 1mm³

- morfologia nasienia

• Wady nasienia:

1. główne (16)- decydują o płodności (budowa plemnika-główka, witka)- zła spermatogeneza

2. podrzędne (9 wad)- wady, które tworzą się w najądrzach, zawartość obcych komórek, przeżywalność plemników w podwyższonej i obniżonej temp. ciała.

Obecność leukocytów świadczy o stanie zapalnym dróg wyprowadzających lub jąder, a najczęściej osłonek. W temp. ciała plemniki żyją 24godz, w pokojowej żyją krócej, a w niższej ulegają hibernacji. W drogach rodnych suki plemniki mogą przeżyć 4 - 5dni, a w jajowodach do 10dni! Zależy to od środowiska- im więcej fruktozy, tym ↑ przeżywalność.

• Ocena dodatkowa:

- badanie mikrobiologiczne nasienia lub popłuczyn (Kampylobakterioza)

- badanie parazytologiczne (Trichomonadoza- rzęsistek)

- badanie biochemiczne (ilość fruktozy, kwas cytrynowy)

Bada się nasienie lub popłuczyny z worka napletkowego.

10. Badania dodatkowe:

- badanie prącia (podczas skoku lub można wyciągnąć- po znieczuleniu)

- badania krwi: biochemia, rozmaz, obraz białokrwinkowy, u ogierów grupy krwi

- badanie moczu: biochemia, rozmaz, badanie mikrobiologiczne

- próba biologiczna: kiedyś stosowano do wykrycia rzęsistka u buhaja- pokrywało się jałówki

Rozpoznanie, ocena zdrowotności i płodności ♂:

- zdatny (minimum 80% plemników żywych o ruchu postępowym, dobra przeżywalność)

- warunkowo przydatny (po leczeniu lub ponownej ocenie może być zdatny)

- nieprzydatny

Ćwiczenie 3.

Metody unasienniania ♀ zwierząt domowych.

1. Ważny jest wybór najbardziej optymalnego momentu inseminacji.

2. Odpowiednie przygotowanie nasienia.

3. Sposób wprowadzenia nasienia do dróg rodnych ♀

Najczęściej unasiennia się:

- bydło i trzodę chlewną

- konie

- owce, kozy

- psy

- koty sporadycznie

KROWA:

Rozpoznawanie rui u krów:

U bydła zewnętrzne objawy rui są widoczne przez 6 - 36 godz. ( zazwyczaj 24godz.). Jednak u niektórych krów występuje tzw. cicha ruja. Owulacja ma miejsce 24 - 36 godz. od początku rui. Z tego powodu bardzo istotne jest zauważenie, kiedy to się zaczęło. Po owulacji u bydła, komórka jajowa tylko przez 2-3godz. jest zdolna do zapłodnienia, potem ulega zwyrodnieniu.

1. Należy obserwować krowę 4x na dobę (co 6godz.)

2. Stosuje się specjalne pedometry (krokomierze) na nogi, które rejestrują liczbę kroków. Ma to

zastosowanie u krów bezuwiązowych. W czasie rui krowy 3 - 4x więcej chodzą, obskakują się, mniej jedzą. Odczyt z licznika najłatwiej sprawdzać podczas doju.

3. Test przewodnictwa mleka (w rui dochodzi do ↑ koncentracji estrogenów, co pociąga za sobą ↑ przepuszczalności naczyń, a tym samym ↑ ilości chlorków sodu, co w konsekwencji przyczynia się do ↑ przepuszczalności nabłonków i ↑ przewodnictwa mleka).

4. Śluz z dróg rodnych jest wodojasny, przeźroczysty, ciągliwy- widoczny na guzach

siedzeniowych, ogonie, sromie. Śluz jest wytwarzany przez gruczoły szyjkowe i pochwowe.

W cichej rui jest to jedyny symptom.

5. Symptomy rui: przemieszczanie się, krowa pozwala się obskakiwać, porykuje, widoczny obrzęk sromu, przekrwienie, zwiększona ilość śluzu.

6. KAMAR- metoda stosowana u krów, które podejrzewamy o ruję. Na grzbiecie krowy umieszcza się plastikowe worki o wymiarach 40x40, wypełnione wodą. W środku znajduje się pojemniczek o wymiarach 5x5, wypełniony farbą. Gdy krowa jest obskakiwana, worek pęka i krowa ma na grzbiecie czerwoną plamę. Rolnik zerka sobie przez lornetkę i jak zobaczy cos takiego, to zabiera krowę z pola i dzwoni po doktora, żeby ją jeszcze dodatkowo zbadał. Stosuje się w dużych gospodarstwach (np. w Bieszczadach).

7. Czujnik elektroniczny (metoda Dramińskiego)- służy do badania oporności śluzu w pochwie. Podczas rui oporność śluzu szyjkowego maleje (bo tuż przed rują jest maksymalna estrogenizacja i więcej chlorków). Czujnik wkłada się do pochwy.

8. Trening psów do wyczuwania estrogenów.

9. W cichej rui można stosować buhaja próbnika.

Inseminator wyznacza najlepszy termin zabiegu na podstawie:

1. Danych od właściciela- kiedy rozpoczęła się ruja, jakie są objawy.

2. Biorąc pod uwagę dane, czy krowa ma długą czy krótką ruję, czy ruja występuje z opóźnieniem.

3. Decyduje czy potrzebna będzie reinseminacja po 12godz.

4. Bada krowę per rectum: macica powinna być jędrna, nakrywana dłonią, ulegać wzwodowi pod wpływem masażu; należy wykluczyć ciążę, bo u niektórych krów w 4 - 6mies. ciąży występuje ruja i przy doszyjkowym podaniu nasienia można spowodować poronienie.

Przygotowanie i wprowadzenie nasienia:

Nasienie wprowadzamy na 15 - 18godz. od początku rui. Kapacytacja następuje po 6 - 8godz. od wprowadzenia nasienia. Jest to tzw. uzdatnianie (uaktywnianie) plemników. W błonie cytoplazmatycznej plemnika znajdują się inhibitory dla enzymów zawartych w akrosomie. Enzymy te mają zdolność rozpuszczania osłonek komórki jajowej. Dopiero w drogach rodnych ♀ następuje ich odblokowywanie (uaktywniają się, pozbywając się inhibitorów dla enzymów znajdujących się w akrosomie).

Gdy plemniki już są odpowiednio przygotowane na spotkanie z komórką jajową, muszą się przedostać przez barierę w postaci gęstego śluzu szyjkowego. Poruszają się szybko i walczą dzielnie, ale te, którym nie uda się przejść dalej, zostają eliminowane (przez fagocytozę). Inne zostają „wpuszczone w maliny”, bo komórka jajowa znajduje się tylko w jednym rogu i część plemników biegnie do pustego kąta. Po rozmrożeniu nasienia, w 1 porcji wprowadza się do dróg rodnych ok. 20mln. plemników. Z tego ok. 40% powinno dostać się dalej. Ok. 10mln. jest żywych i zdolnych do zapłodnienia. Do kom. jajowej dociera tylko100 najlepszych(wygrywa 1)

Najczęściej używa się nasienia mrożonego, które może być przechowywane na 2 sposoby:

- w kulkach o objętości ok. 1/15ml. (teraz już się nie stosuje u bydła, pozostało tylko u psa)

- w plastikowych słomkach o objętości 0.2ml. (zawierają 10 - 20mln. plemników o ruchu prawidłowym, a po rozmrożeniu pozostaje 80% plemników prawidłowo się poruszających).

Słomki przechowuje się w ciekłym azocie (temp. -193ºC). Mają różne kolory, żeby można było je odróżnić. Na każdej znajduje się opis- numer buhaja, numer kartoteki i data pobrania nasienia

Przed deponacją nasienia, słomki należy umieścić w łaźni wodnej o temp. 38ºC na 30 - 40 sek.

Po tym czasie wyciągamy słomkę, suszymy ją ligniną, odcinamy zgrzew i wkładamy do pistoletu inseminacyjnego tą stroną gdzie jest koreczek. Na to jeszcze nakłada się osłonkę i tak przygotowane nasienie można wprowadzić do dróg rodnych ♀ krowy. Pamiętać o higienie!!!

Zabieg unasienniania oburęcznego wykonuje się w etapach:

1. Wprowadzenie pipety inseminacyjnej do pochwy.

2. Wprowadzenie lewej ręki do odbytu i prostnicy.

3. Określenie położenia szyjki macicznej oraz stanu macicy.

4. Ustalenie szyjki macicznej.

Wykonuje się za pomocą lewej ręki przez ścianę jelita prostego. Szyjka powinna być uchwycona całą dłonią.

5. Wprowadzenie końca pipety do szyjki macicznej.

6. Wstrzyknięcie nasienia.

7. Wyjęcie z pochwy pipety inseminacyjnej a następnie ręki z odbytu.

Czynność ta wymaga przesuwania pipety w głąb pochwy. Początkowo należy kierować koniec pipety w kierunku grzbietu ( tak, aby nie trafić do zachyłka cewkowego), a potem pionowo i do przodu.

TRZODA CHLEWNA:

Nasienie knura przechowuje się w pojemnikach o pojemności 100ml. Bardzo trudno się ono mrozi, dlatego najczęściej używa się nasienia świeżego, płynnego. Lochy unasiennia się nawet przez 4dni. Ilość plemników w 100ml. wynosi ok. 3mld.

Objawy rui u loch:

1. Locha pohukuje, widoczny jest obrzęk i zaczerwienienie sromu, z którego wypływa wydzielina mleczno-śluzowa, utrata apetytu.

2. Próba dosiadu- uciska się w okolicy guzów biodrowych. Gdy locha stoi, nie broni się- jest gotowa na krycie. Jeśli się broni, denerwuje- nie ma ochoty.

Ruja trwa 48 - 72godz. (36 - 55godz.), a owulacja ma miejsce ok. 42godziny (36 - 54godz.).

W ciągu 1.5 - 2godzin owulują wszystkie komórki jajowe (jest ich około 20).

Loszki unasienniamy 16 - 22godz. od początku rui, natomiast lochy 22 - 26godz. od początkowych objawów. Reinseminację wykonuje się po 12godz.

KLACZ:

Ruja trwa 3-6-9-12 dni, owulacja ma miejsce 48 - 24godz. przed końcem rui.

Rozpoznanie owulacji:

1. Najlepiej obserwować jajniki (za pomocą USG) i mierzyć pęcherzyki, które przed owulacją mają Ø 4.5 - 6cm. Gdy pęcherzyk ma < 3cm. to jest jeszcze za wcześnie. Gdy ma > 4cm. możemy podać dawkę nasienia oraz hormony na pęknięcie pęcherzyka.

2. Badaniem rektalnym stwierdzamy, że macica jest jak cytryna.

Wyróżniamy:

1. Krycie naturalne- klacze kryje się co 48godzin, aż do momentu odbicia (nie przyjęcia ogiera), a gdy jest krótka ruja (np. 3dni), to przerwy muszą być krótsze. Ogier może w sezonie na punkcie kopulacyjnym pokryć ok. 60 klaczy.

2. Można użyć nasienia płynnego, które pobiera się na sztuczną pochwę. Inseminujemy co 24godz, aż do ustania objawów rui lub stwierdzenia owulacji (USG-pęcherzyk o Ø 4.5-6cm)

3. Nasienie mrożone- po wartościowych ogierach. Takie nasienie ma krótszą żywotność, ale jest łatwe do transportowania.

Owulację należy ustalić z dokładnością do 6godz. W dawce inseminacyjnej musi być minimum 300mln. plemników. Im mniejsza pojemność zamrażanego nasienia, tym lepiej się mrozi. W dawce o pojemności 0.5- 1ml. koncentracja plemników wynosi 100mln./1ml. Słomki rozmraża się w temp. 37ºC w ciągu 30sek. lub w 40ºC przez 30sek.(słomki duże). Dobrze mrozi się tylko nasienie pochodzące od 25% ogierów, od 25 - 50% mrozi się średnio i od 25%- źle (brak żywych plemników).

Sposób unasiennienia:

1. Metoda ręczna- podobnie jak u bydła.

2. Z użyciem wziernika pochwowego i z lampką czołową, którą podświetla się pochwę. Do szyjki macicy wkłada się kateter z nasieniem.

Pamiętać o aseptyce, wszystko musi być jałowo!!!

SUKA:

Psy najczęściej potrafią zająć się sobą, wszystko odbywa się naturalnie i nie trzeba sztucznie inseminować. Czasem jednak któraś ze stron nie ma ochoty, wtedy możemy zadziałać.

Zwykle używa się świeżego nasienia, które uzyskujemy po wykonaniu masturbacji u psa.

Umieszczamy pipetę w pochwie i po deponacji przytrzymujemy sukę w górze, trzymając za tylne nogi, żeby nie mogła się wylizać ani wysikać.

Ćwiczenie 4.

Budowa i funkcjonowanie układu rozrodczego u poszczególnych gatunków ♂ zwierząt domowych.

BUHAJ (bull):

Ocena przydatności rozpłodowej buhajów:

1. Badanie kliniczne.

2. Badanie nasienia- na nosicielstwo chorób itp.

Na podstawie tych badań dokonuje się kwalifikacji do rozrodu. Zwierzęta muszą być zdrowe.

Buhaja możemy zakwalifikować do:

1. Do stacji hodowli i unasienniania zwierząt, gdzie pobiera się, a następnie mrozi nasienie.

2. Do punktów kopulacyjnych. Tu wysyła się zwierzęta, które otrzymały niższą punktację w ocenie i raczej nie mogą unasienniać dużej populacji samic. Kryje się nimi 2 - 3x na tydzień, jest to tzw. krycie towarowe.

Do krzyżowania używa się najczęściej rasy mięsnej Limuze, bo rodzą się nieduże cielaki, a gdyby było inaczej to krowa mleczna nie byłaby w stanie go urodzić.

Wymagania wobec buhaja:

• Nie może być nosicielem:

- brucelozy

- gruźlicy

- białaczki

- otrętu

- kampylobakteriozy

- trichomonadozy

- nie może mieć wad genetycznych

Gdy się wykryje chorobę zakaźną lub wadę genetyczną, zazwyczaj zwierzę się likwiduje.

• Sprawność ruchowa samca:

- stan racic

- stan nadgarstka

- stan koronki

- postawa (podsiebna / przedsiebna). Nieprawidłowe ustawienie przy dużej masie ciała może doprowadzić do zmian zwyrodnieniowych.

7 miesięcy- wstępna kwalifikacja hodowlana

9 miesięcy- wstępna kwalifikacja nasienia. Pobieramy ok. 1000 porcji nasienia od każdego buhajka

i odstawiamy ♂ do przechowalni. Ich nasienie idzie do oceny na potomstwie. Pełna ocena jest po 2.5 roku na córkach buhajów. Dopiero wtedy jesteśmy w stanie ocenić, jakie cechy ojciec przekazał swojemu dziecku, którego pewnie nawet nie pozna. W 80% przypadków buhaj nie otrzymuje oceny pozytywnej. Wtedy można go odstawić do rzeźni i zjeść w niedzielę na obiad.

Wyselekcjonowane samce charakteryzują się dużą płodnością i dobrymi cechami hodowlanymi. Podłoże, na którym stoją musi być tak skonstruowane, żeby nie dochodziło do zatrzymywania moczu i kału, bo mogłoby to doprowadzić do rozmiękania rogu, maceracji i rozrostu tkanki łącznej w szparze międzyracicznej. Gdy podłoże jest nierówne, albo są kamienie, powoduje to duże obciążenie i może doprowadzić do odcisków a nawet wrzodów. Na zbyt śliskiej podłodze rozjeżdżają się racice i powstają ślimaki (limax). Nie dochodzi do złożenia racicy, jest duży ucisk, może nawet powstać martwica i biedaka trzeba wyeliminować. U buhaja na 1cm³ powinien przypadać 1.1 kg.m.c.

Specjalistyczne badanie układu rozrodczego buhaja:

1. Moszna- oglądamy i omacujemy.

Skóra pokryta delikatnym, drobnym włosem. Należy zwrócić uwagę na ubytki, blizny, skurcz (reakcja) błony kurczliwej. W obrębie splotu wiciowatego zachodzi wymiana ciepła, wrażliwy na zabrudzenia metalami- dochodzi do niszczenia nabłonka plemnikotwórczego. Mięsień dźwigacz jąder odpowiada za mechanizmy wspomagające.

2. Jądra- jądro waży 250-500g., co stanowi 0.1% m.c. buhaja, długość 10-14cm., Ø 6-8cm., obwód 2 jąder nie mniejszy niż 40cm.(41-43cm.).

Korelacja między obwodem jąder a produkcją plemników wynosi blisko 1 (0.86-0.95).

3. Najądrze- składa się z 3 części: głowa, trzon, ogon. Ogon jest najłatwiejszy do omacywania- w nim przechowywane są dojrzałe plemniki, które otrzymują ładunek elektryczny, przechodzą do ampułek nasieniowodu i czekają na ejakulację. Wielkość ogona najądrza zależy od wypełnienia plemnikami. Normalnie przypomina śliwkę węgierkę, powinien być jędrny, elastyczny, niebolesny, wyraźnie wyczuwalny.

Najądrze przechodzi w przewód najądrza a dalej w nasieniowód.

POWRÓZEK NASIENNY: 1.Nasieniowody

2. Żyły i tętnice jądrowe.

3. Mięśnie wciągacze jąder.

4. Nerwy.

4. Nasieniowody- mają długość ok. 40-60cm.; początkowo przebiegają w powrózkach nasiennych,

a po przejściu przez jamę brzuszną pozostają już same nasieniowody, które w końcowej

części tworzą ampułki nasieniowodów. Ampułki mają 12-15cm. długości, Ø1-1.5cm. i ok. 6cm³ pojemności.

5. Dodatkowe gruczoły płciowe:

• gruczoły pęcherzykowe- u buhaja dorosłego w wieku 3-4lat mają dł.12-15cm., szer. 3-4cm, gr. 2- 3cm. Budowa gronowata (zrazikowa), są parzyste, w kształcie litery V, konsystencji opornej. Leżą tuż powyżej pęcherza moczowego, nad prostatą. Przy braku eksploatacji dochodzi do zmniejszenia ich objętości i stają się konsystencji flakowatej.

• gruczoł krokowy (prostata/stercz)- znajduje się na szyjce pęcherza moczowego. Dł. do 1.5cm., szer. 3-3.5cm. Składa się z części zbitej i rozproszonej, która jest bardzo trudna do usunięcia w przypadku wystąpienia nowotworu.

• gruczoły opuszkowo-cewkowe- są to gruczoły parzyste, wielkości orzecha laskowego, leżą przy przejściu miednicznej części cewki moczowej w część opuszkową.

6. Prącie- ma długość 100-120cm.; wewnątrz są ciała jamiste otoczone grubą warstwą tkanki włóknistej. Pisiorek posiada zagięcie esowate, do którego przyczepia się mięsień wciągacz prącia, a drugi przyczep znajduje się na kręgach lędźwiowo-krzyżowych kręgosłupa. Podczas erekcji dochodzi do wzrostu ciśnienia do 14mm. Hg. i ciała jamiste wypełniają się krwią (zostaje uwięzione 250ml.). Ciała jamiste wytrzymują ciśnienie do 76mm. Hg.

7. Napletek- u młodych buhajów napletek przyklejony jest do prącia, odkleja się ok. 32tyg. życia. Należy o tym pamiętać i nie odklejać na siłę!

Obwód moszny:

Korelacja między obwodem jąder a wiekiem = 0.86

- u rocznego buhaja- obwód nie mniej niż 34.5cm.

- 1.5 roku- obwód 38cm.

- 2 lata- minimum 40.4cm.

Rasy mięsne mają mniejsze jądra:

- 12 miesięcy- 32cm.

- 24 miesięcy- 36cm.

Ocena ♂ (buhaj, knur, ogier) w punkcie kopulacyjnym odbywa się 1x w roku.

KNUR (boar):

Wymagania wobec knura:

• Musi być wolny od:

- gruźlicy

- brucelozy

- leptospirozy

- ch. Aujeszky

- salmonellozy

- syndromu rozrodczo-oddechowego

- okresowo- badanie w kierunku wad genetycznych (gen halotanowy- osobniki z tym genem łatwo

ulegają stresowi podczas podstawowych zabiegów, takich jak: transport, kastracja, co wpływa na

zakwaszenie mięsa)

• Ogólny stan zdrowia:

- powłoki ciała

- kończyny (zniekształcenia przy dużym ciężarze ciała)

- postawa (bez wad postaw)

Badanie specjalistyczne:

Knur nie ma ampułek nasieniowodów, nasienie jest transportowane aż z najądrzy. Z tego powodu ejakulacja trwa bardzo długo (ok. 15-20min.). Nasienie oddawane jest do szyjki macicznej. Wydzielina ♂ uszczelnia drogi rodne ♀. Galaretowata masa tworzy czop w ujściu zewnętrznym.

Worek mosznowy- konsystencja, przesuwalność jąder i worka mosznowego.

Najądrze- końcowy odcinek najądrza jest możliwy do omacania.

Knura bada się w poskromie lub przy użyciu pętli ryjowej.

Sprawdzamy odruchy płciowe.

OGIER (stallion):

Wymagania wobec ogiera:

• Musi być wolny od:

- arteritis

- zakaźne ronienie klaczy

- otręt

- zaraza stadnicza koni!

- nosacizna

- niedokrwistość zakaźna koni

• Badanie kliniczne:

- sprawność układu kostno-stawowego

- grupy krwi

Badanie specjalistyczne:

1. Moszna- skóra miękka, pigmentowana, nieowłosiona, przesuwalna w stosunku do jąder; szuka się ew. zrostów między osłonkami.

2. Jądra- jądra jajowate, ułożone równolegle w stosunku do osi ciała; u dorosłego ♂ dł. 10-11cm., szer. 3-4cm. (6-7cm.). Oceniamy symetrię, konsystencję, wrażliwość. Konsystencja prawidłowo jest lekko oporna, zbita, guzowata. U młodych 2-3letnich ogierów lewe jądro jest większe od prawego, później już jest normalnie. Intensywny trening powoduje zmniejszenie objętości jąder.

3. Najądrze- w całości jest wyczuwalne, a najłatwiej ogon, trudniej głowa.

4. Powrózek nasienny- trudno ocenić jego zawartość.

U ogiera są bardzo długie bańki nasieniowodów- do 25cm., Ø 2.5cm. Pełnią funkcję magazynową i wydzielniczą.

5. Gruczoły pęcherzykowe- mają do 20cm. długości, 4.5cm. szerokości.

6. Gruczoły opuszkowo-cewkowe- parzyste, mają 3-4cm. długości i ok. 2.5cm. szerokości; są przykryte mięśniem opuszkowo-cewkowym. Dostępne do badania tylko za pomocą USG.

7. Prostata- składa się z dwóch płatów bocznych, połączonych cieśnią; ma 2-8cm. długości i 2- 3cm. szerokości. Jest umieszczona bocznie, na miednicznej części cewki moczowej.

8. Prącie- długość ok. 100cm., ma charakter jamisty. Należy je obserwować w trakcie erekcji (najlepiej się wtedy prezentuje ). Sedacja lub znieczulenie nerwów powoduje wypadnięcie prącia. Nie poleca się trankwiliny, bo może spowodować porażenie pisiorka.

W drugim ejakulacie, mającym miejsce 1godz po pierwszym, jest tyle samo plemników- minimum 1mld. o ruchu postępowym i nie wykazujących zmian morfologicznych.

Nasienie jest oddawane do szyjki macicznej. Podczas kopulacji żołądź prącia dochodzi do ujścia pochwowego szyjki macicy. Ciała jamiste wypełniają się krwią, co powoduje uszczelnienie otwartej szyjki i wyrzut nasienia aż do trzonu macicy.

TRYK:

Koniec cewki moczowej przechodzi w wyrostek cewkowy, który wykonuje ruchy okrężne.

Nasienie oddawane jest dopochwowo.

Ocena przydatności do rozpłodu:

• Musi być wolny od:

- gruźlicy

- brucelozy

- aktinobacillozy

- świerzbu

Badanie specjalistyczne:

1. Moszna- dobrze widoczna, pokryta wełną (ogranicza przegrzanie i oziębienie).

2. Jądra- ustawione pionowo; mają długość ok 10cm; ciężar 50-300g., co stanowi 0.02- 0.05% m.c.

Jest 7 różnych wzorów jąder. Objętość też jest różna, zmienia się sezonowo- największe jądra są w sierpniu, wrześniu i październiku. Na wiosnę znów są większe, bo produkują dużo plemników.

3. Nasieniowody- mają długość 26-38cm.; bańka nasieniowodu dł. 4-8cm. Ø 0.7cm.

4. Prącie- ma długość 35cm., jest włókniste z zagięciem esowatym.

KOZIOŁ:

Ma wyrostek cewkowy. Nasienie oddawane jest dopochwowo.

Ocena przydatności:

• Musi być wolny od:

- gruźlicy

- brucelozy

- rzęsistkowicy

- paratuberkulozy

Badanie specjalistyczne:

Trzeba sprawdzić czy nie ma przepukliny mosznowej i czy są drożne najądrza.

Prącie- włókniste, omacujemy od korzenia do żołędzi, bo często zdarzają się kamienie.

PSY:

Brak typowej oceny przydatności do rozrodu.

Ocenę wydaje związek kynologiczny w oparciu o ocenę hodowlana i rodowód.

Samce bada się pod kątem obecności jąder w worku mosznowym- w 2tygodniu życia powinny już tam być (max. do 3 miesięcy!!!). Jak nie ma do tego czasu, to jest to wnęter.

Psy rasowe częściej mają zaburzenia płodności- nawet do 50% zwierząt. U mieszańców zdarza się to w ok. 20% przypadków. U owczarków niemieckich i rottweilerów zdarzają się dysplazje. Mogą być problemy natury psychiczno-seksualnej.

Pies oddaje nasienie dopochwowo.

Ćwiczenie 5.

Metody znieczulania prącia u ♂ zwierząt domowych:

BUHAJ:

Prącie można obejrzeć w trakcie erekcji, która nie zawsze ma miejsce, jeśli sobie tego zażyczymy. Możemy jednak doprowadzić do wypadnięcia fiutka po zastosowaniu znieczulenia. Zwracamy uwagę, czy nie ma zranień, urazów, brodawczaków itp.

1. Metoda Larsona- polega na zablokowaniu nerwu nasiennego wewnętrznego (n. spermaticus internus).

Miejsce wkłucia- punkt w zagłębieniu

- granica górna: ograniczona jest przez guz siedzeniowy

- granica boczna: więzadło szerokie miednicy (krzyżowo-guzowe) (ligamentum sacrotuberale

latum). Dawniej nazywało się krzyżowo-kolcowo-guzowe (lig. sacrospinotuberculosum).

- granica przyśrodkowa: prostnica i fałd ogonowy

Wykonanie:

Lewą rękę należy włożyć do prostnicy. Szukamy otworu kulszowego mniejszego, a następnie znajdujemy n. nasienny wewnętrzny- biegnie przed otworem w postaci grubej przesuwalnej taśmy.

Miejsce wkłucia należy ogolić, zdezynfekować i wbić igłę pod kątem 45º. Przebijamy się przez mięśnie i przez prostnicę kontrolujemy dojście igły do nerwu. Podajemy ok. 20-25ml. 2% polokainy lub 50ml. 1% polokainy. Zabieg należy wykonać obustronnie. Wypadnięcie prącia ma miejsce po ok. 30minutach. W praktyce, metoda ta nie jest zbyt często używana, ponieważ przebija się grube partie mięśni i może dojść do tworzenia się ropni i przetok, zwłaszcza przy nieaseptycznym wykonaniu.

2. Metoda Abelajna- polega na znieczuleniu nerwów grzbietowych prącia (nn. dorsales penis) oraz znieczuleniu mięśnia cofacza prącia (m. retractor penis)

Miejsce wkłucia:

Wkłucie wykonuje się w szwie krocza, 10cm. poniżej odbytu.

Wykonanie:

Igłę wkłuwa się na głębokość 10-12cm. i deponuje się 50-60ml. 2% polokainy. Wypadnięcie siusiaka ma miejsce po 30-40minutach. Największe znieczulenie jest w obrębie m. cofacza prącia.

3. Metoda Abelajna w modyfikacji Marxa- zmienione jest miejsce podania znieczulenia.

Miejsce wkłucia:

Wyznaczamy punkt w miejscu przecięcia się 2 linii:

1. Linia pozioma, łącząca guzy siedzeniowe.

2. Szew krocza- linia pionowa.

Igłę wbijamy 2-3 palce poniżej punktu łączącego te dwie proste. Deponujemy 50-60ml.(do 120ml.)

4. Metoda Fatkina i Izajewa- polega na zablokowaniu nerwów grzbietowych prącia (nn. dorsalis penis), które przebiegają wzdłuż grzbietowej powierzchni prącia. To metoda dająca dobre efekty, jest najczęściej stosowana. Nie należy wprowadzać igły zbyt głęboko.

Miejsce wkłucia:

Dolny pokład zagięcia esowatego. Miejsce wkłucia ustala się po znalezieniu tego pokładu.

Wykonanie:

Wkłuwamy się w dolny pokład zagięcia esowatego. Nerwy, które znieczulamy, znajdują się na grzbietowej (górnej) powierzchni tego zagięcia.

Najlepiej podejść z tyłu lub z boku do buhaja, uważając żeby nie kopnął. Po odnalezieniu zagięcia esowatego, należy je złapać i włożyć igłę. Wprowadza się 150-200ml. 1-2% polokainy. Po 15-20min. pisiorek wypada. Znieczulenie działa do godziny.

5. Metoda Fatkina i Izajewa w modyfikacji Hoffego- wkłucie w grzbietową część pokładu. Wprowadza się 150-200ml. środka znieczulającego.

6. Metoda Fatkina i Izajewa w modyfikacji Marxa i Hasse- po odciągnięciu dolnego pokładu do tyłu wlewa się środek znieczulający. Można podejść z boku lub z tyłu zwierzęcia (zabezpieczyć się)

Buhaja można tez znieczulić farmakologicznie, np. ksylazyną, ale wtedy zwierzę się kładzie.

Najczęściej stosuje się metodę Fatkina i Izajewa, pozwalającą na dobrą kontrolę wkłucia. W innych metodach wkłuwamy się głęboko w mięśnie.

Miejsce iniekcji należy odpowiednio przygotować. W metodzie Larsona golimy, dezynfekujemy, okładamy serwetami. W metodzie Abelajna golimy w szwie krocza, a w Fatkina i Izajewa myjemy i dezynfekujemy spirytusem lub denaturatem. Buhaj musi być poskromiony i zabezpieczony (kółko w nos, chwyt za fałd ogonowy, złapanie za ogon).

Wymagania wobec buhajków w okresie pobierania nasienia znajdują się w instrukcji Ministra Rolnictwa, Leśnictwa i Gospodarki Żywnościowej Departamentu Weterynarii z 3.04.1986roku w sprawie badania i przydatności rozpłodowej buhajów.

Pobieranie popłuczyn z worka napletkowego:

Popłuczyny pobiera się w celu:

- wykluczenia lub stwierdzenia obecności Kampylobakteriozy, Trichomonadozy (rzęsistek)

- przy podejrzeniu swoistych przyczyn obniżenia płodności i niepłodności

- w aspekcie zmian mikrobiologicznych w nasieniu

- gdy widoczne są zmiany makroskopowe

Do pobrania popłuczyn potrzebna jest szczelna butelka szklana o pojemności 100ml., zamknięta szczelnym korkiem gumowym lub zakręcana. W butelce umieszcza się 50-70ml. jałowego NaCl lub odpowiedniego podłoża. Do laboratorium najlepiej transportować butelki z gotowym płynem, wzbogaconym glukozą i bulionem. Oprócz butelki, potrzebny jest metalowy kateter lub plastikowa pipeta jednorazowego użytku o długości 40cm, którą wprowadzamy do worka napletkowego. Pipeta połączona jest z butelką gumowym lub plastikowym wężykiem.

Przed pobraniem popłuczyn, należy odpowiednio przygotować okolicę intymną buhaja. Myjemy napletek i dezynfekujemy K₂MnO₄ lub 0.25-0.5% roztworem chloraminy. Napletek buhaja jest owłosiony i powinien zostać przystrzyżony na 2-3 paluszki. Po umyciu i dezynfekcji, rozchylamy napletek i wprowadzamy kateter głęboko do worka napletkowego. Potem zaciskamy włożony kateter oraz napletek i wlewamy płyn do jamy napletkowej. Po wlaniu, masujemy ok. 5minut. Następnie opuszczamy na dół butelkę i popłuczyny spływają do środka. Korkujemy buteleczkę i wysyłamy do laboratorium lub sami posiewamy.

W celu zidentyfikowania Kampylobakteriozy posiewamy materiał na podłoże z antybiotykiem i po wyrośnięciu oglądamy pod mikroskopem w ciemnym polu widzenia (bo to skrętek).

Przy podejrzeniu rzęsistka materiał posiewamy na bulion wzbogacony. Dajemy mu czas na namnożenie się. Oglądamy pod mikroskopem w kropli wiszącej. Gdy inwazja rzęsistkiem jest nieduża, a mamy 60-80ml. popłuczyn, to ciężko go znaleźć. Taki preparat najlepiej odwirować lub poczekać aż rzęsistek się namnoży. Po odwirowaniu pobieramy kroplę supernatantu, rozpuszczamy i oglądamy pod mikroskopem. Po stwierdzeniu rzęsistka, buhaj jest leczony lub eliminowany.

Sprzęt używany do pobierania popłuczyn (buteleczki, korki, pipety, rurki) musi zostać umyty wodą destylowaną, a następnie zdezynfekowany (chloraminą, biovalem, sterinolem). Potem suszy się w suszarce o temp. 160ºC przez 2godz. lub w aparacie Kocha w celu odkażenia.

Sprzęt umieszczamy w oddzielnych woreczkach. Dla każdego buhaja stosuje się osobny zestaw!!!

Popłuczyny pobiera się najczęściej w celu stwierdzenia lub wykluczenia rzęsistka.

Buhaj może też chorować na otręt, który diagnozuje się badaniami wirusologicznymi i na chlamydiozę, którą wykrywają badania bakteriologiczne. Są też gotowe testy na te choroby.

Obecnie bada się obowiązkowo tylko pod kątem rzęsistka i Kampylobakteriozy.

Ćwiczenie 6.

Metody pozyskiwania nasienia od ♂ zwierząt domowych (czyli Sex Shop dla zwierząt).

Cel pobierania nasienia:

- w celu zbadania (czy nie jest nosicielem chorób zakaźnych)

- ocena jakościowa nasienia (przy nieskutecznym kryciu)

- w celu inseminacji, przy braku możliwości krycia naturalnego np. gdy jedna ze stron nie wykazuje

zainteresowania płcią przeciwną

- gdy mamy wartościowego samca i chcemy zapłodnić jak najwięcej samic

BUHAJ:

1. Pobieranie na sztuczną pochwę. Są 2 rodzaje:

• Model radziecki z 1932roku. Składa się z cylindra zewnętrznego z twardej gumy lub

ebonitowego. Guma ma grubość ok. 1cm., Ø ok. 5cm., długość ok. 60cm. W cylindrze

zewnętrznym jest zawór wodno-powietrzny, którym wprowadza się wodę do pochwy, a

następnie powietrze. Poza tym jest wkładka wewnętrzna, zbudowana z cienkiej gumy,

posiadająca 2 powierzchnie: gładką i karbowaną.

• Model duński. Składa się z cylindra zewnętrznego (ebonitowego), o długości 42cm. (jest

krótszy od radzieckiego, co ogranicza straty nasienia na ściankach). Posiada też zawór wodno-

powietrzny oraz wkładkę wewnętrzną z cienkiej gumy, posiadającą 2 powierzchnie.

Do obu typów pochew dołączony jest lejek łączący (gumowy) oraz zbiornik na nasienie. Właściwie są to 2 zbiorniki z płaszczem wodnym: wewnątrz znajduje się zbiorniczek z podziałką, do którego wpływa nasienie i jest on otoczony drugim zbiornikiem, do którego nalewa się wodę o temp. 37 - 38ºC, żeby nasienie stykało się z temperaturą podobną do fizjologicznej samicy. Dzięki temu plemniki nie przeżywają szoku termicznego.

Montowanie pochwy:

1. Wkładamy gumę do środka cylindra i wywijamy na zewnątrz brzegi wkładki.

2. Są specjalne pierścienie zaciskające, które zakłada się w celu umocowania brzegów.

3. Na wierzch zakładamy lejek łączący (łączy pochwę ze zbiornikiem).

4. Doczepiamy zbiornik na nasienie.

5. Wlewamy wodę przez zawór do cylindra (ok. 300ml. o temp. 45 - 50ºC). Woda ma spowodować, że ścianki wewnętrzne schodzą się z sobą, jednak nie może być za ciasno. W środku pochwy powinna być temperatura 40 - 42ºC. Jest specjalny termometr do mierzenia ciepłoty wody. U młodszych buhajów można stosować niższą temperaturę, ale u starszych potrzeba dodatkowych bodźców, bo oni gorzej sobie radzą. U nich temp. zwiększa się do minimum 42ºC- tzw. gorąca pochwa.

6. Na to wszystko zakładamy mankiet z materiału (filc, flanela), żeby utrzymać stałą temperaturę i nie uszkodzić zbiornika szklanego na nasienie.

Wkładka wewnętrzna ma 2 powierzchnie: gładką i karbowaną. U młodszych buhajów wkładamy do wewnątrz stroną gładką, żeby nie poszło im zbyt szybko. Natomiast u starszych potrzeba silniejszych bodźców, więc układamy tak, by strona karbowana była we wnętrzu pochwy i ich dodatkowo stymulowała.

Na przednią część pochwy nanosi się środek poślizgowy. Kiedyś stosowano wazelinę, obecnie używa się innych, nie plemnikobójczych preparatów (np. KY- ludzkie lub weterynaryjne). Nie należy nakładać środka poślizgowego głębiej, bo żel może dostać się do nasienia i je zanieczyścić. Tylko na przednią część, żeby był poślizg.

Do tak przygotowanej pochwy podprowadza się buhaja. Najczęściej kusi się go samicą w rui. Samiec czuje ciepło i wilgoć, no i wykonuje skok. Podchodzimy wtedy z prawej strony, podstawiamy pochwę pod kątem 45º, a lewą ręką chwytamy u podstawy prącia przez napletek (nie łapać fiutka gołą ręką, zwłaszcza zimną, bo można go zniechęcić). Nie można dopuścić, by przez naszą nieuwagę buhaj pokrył samicę pełniącą rolę kusicielki. Musimy skierować prącie do pochwy- nakładamy ją na pisiorka. Jak wszystko pójdzie ok., to buhaj wykonuje pchnięcie ejakulacyjne i wszyscy są zadowoleni. Zdejmujemy mankiet i patrzymy, czy jest cos w środku. Dokonujemy oceny.

2. Masaż dodatkowych gruczołów płciowych.

Metodę tę można zastosować, gdy nie ma możliwości pobrania nasienia na sztuczną pochwę. Gruczoły pęcherzykowe masuje się przez prostnicę ok. 2 - 3minuty. Następnie należy masować bańki nasieniowodów.

Początkowo uzyskujemy przejrzystą wydzielinę z gruczołów pęcherzykowych, a następnie właściwe nasienie, pochodzące z ampułek.

W tej metodzie nie osiągamy całej objętości ejakulatu, nie należy więc dokonywać oceny pod tym kątem. Zwracamy uwagę tylko na wartość biologiczną: ilość plemników, ich żywotność, budowa morfologiczna. Gdy jest dużo plemników ruchliwych (minimum 70%), to ♂ jest w porządku. Gdy mniej niż 70% plemników wykazuje prawidłowy ruch, to buhaj jest niepłodny lub wykazuje okresową niezdolność do rozrodu.

Skuteczność krycia ocenia się na podstawie płodności córek, pochodzących od tego buhaja.

3. Elektroejakulacja.

Metodę tę wymyślili Laployd i Kasu. Podobnie robi się u tryka.

Urządzenie do elektroejakulacji składa się z sondy doodbytniczej dwubiegunowej, zbudowanej z dielektryka- nie przewodzi prądu. Sonda posiada elektrody (mosiężne) w postaci pierścieni oraz przewody. Poza tym jest transformator i opornica suwakowa.

Transformator zmienia napięcie z 220 do 24 Volt, natomiast opornica pozwala na regulację natężenia prądu od 0 do 8 miliAmperów.

Przygotowanie buhaja (tryka) do elektroejakulacji:

1. U buhaja rzadko stosuje się tę metodę, ponieważ wymaga odpowiedniego przygotowania zwierzęcia. Buhaja należy poskromić, ewentualnie podać mu środki uspokajające.

2. Należy nałożyć długą rękawicę i wygarnąć kał z prostnicy.

3. Jak już wygarniemy, wykonujemy lewatywę przy użyciu 3 - 5% NaCl (dobrze przewodzi prąd).

4. Jedna osoba wprowadza do odbytu sondę pokrytą środkiem poślizgowym i ma w zasięgu ręki opornicę suwakową- przy jej pomocy pobudza buhaja (tryka).

5. Druga osoba ma zbiorniczek na nasienie (z lejkiem) i trzyma go w okolicy napletka. Napletek należy wcześniej wypłukać roztworem odkażającym, a następnie 0.9% NaCl, żeby było jak najmniej zanieczyszczeń. Jak wszystko jest przygotowane, można podstawić zbiorniczek i cierpliwie czekać na wypływ.

Pobudzanie rozpoczyna się od 5mA i pobudza się rytmicznie, aż do wystąpienia skurczów tężcowych. U tryka wystarczy ok. 4 pobudzeń, u buhaja potrzeba ok. 14. A potem już wypływa nasienie.

KNUR:

1. Elektroejakulacja.

Rzadko stosuje się tę metodę, bo dochodzi do zbyt silnego pobudzenia zwierzęcia, co jest dość kłopotliwe. Knura trzeba unieruchomić poprzez wywiązanie lub krótkotrwałą narkozę. Przepłukujemy worek napletkowy oraz czyścimy prostnicę za pomocą NaCl (r-r w temp. ciała).

Elektrodę dwubiegunową wprowadzamy do prostnicy i wykonujemy rytmiczne pobudzenia z przerwami co 5sekund. Stosujemy napięcie od 5 do 15 (20)V i natężenie 500 - 1000mA.

Pomimo, iż właściwie nie stosuje się metody elektrycznej u knura, uzyskuje się nasienie bardzo dobrej jakości (jest bardzo mało żelu- ok. 5ml., dobra koncentracja- ok. 500x10⁶ plemników w 1ml.), ale ruchliwość plemników jest poniżej 50% (powinna być ok. 70 - 80%).

2. Metoda manualna- najczęściej stosowana.

TRYK:

1. Elektroejakulacja.

• Po raz pierwszy metoda ta została zastosowana przez Gunna w 1934roku. Wtedy ten pan zastosował 2 elektrody:

- doodbytowa- w postaci rozszerzonego walca

- lędźwiowa- w postaci długiej igły, którą wkłuwało się w mięśnie lędźwiowe

Pozwalało to na uzyskanie dużej ilości nasienia, ale jednocześnie powodowało zbyt duże pobudzenie motoryczne.

• Modyfikacja Olbrychta- ten pan wymyślił, żeby zamiast igły zastosować metalową kulkę, obciągniętą irchą i nasączoną NaCl. Kulkę tę przykładało się na mięśnie w okolicy lędźwiowo-krzyżowej, a drugą elektrodę wkładało się w dupsko.

• Metoda Benadonna (kolejna modyfikacja)- zastosowano 2 metalowe walce, które przykładano po obu stronach kręgosłupa lędźwiowo-krzyżowego.

• Laployd i Kasu w 1945roku wpadli na pomysł zastosowania rurki (sonda doodbytowa z pierścieniami metalowymi- elektrodami). U tryka jest to obecnie główna metoda pobierania nasienia. Zwierzęta te wykazują odruchy obronne w postaci skurczów tężcowych.

Tryka nie trzeba jakoś specjalnie unieruchamiać, wystarczą pomocnicy do trzymania. Można wykonać lewatywę z NaCl, co polepsza przewodnictwo prądu. Poza tym dezynfekujemy i płuczemy worek napletkowy za pomocą NaCl. NaCl usuwa resztki środka dezynfekcyjnego, bo gdyby nie został on dobrze wypłukany, mogłoby dojść do pękania plemników (roztwór hipoosmotyczny).

Gdy wszystko jest gotowe, można zacząć działać. Jeden człowieczek trzyma sondę i pobudza tryka, a drugi trzyma zbiorniczek przy napletku i czeka na wypływ nasienia.

Pobudzanie zaczyna się od niskich dawek 5 - 1V, potem stopniowo się je nasila. Pobudzanie przerywa się po 3 - 5sekundach, kiedy wystąpią pierwsze skurcze tężcowe. Środki uspokajające nie pomagają. Średnio stosuje się 4 pobudzenia, dochodzące do napięcia 5.4V (wahania od 1 - 11Volt).

W metodzie elektroejakulacji należy uważać na głębokość wprowadzania sondy- nie pchać głębiej niż na 20 - 35cm. (średnio ok.30cm.) Sondę układa się na dolnym spojeniu miednicy.

U tryka jest bardzo mała ilość ejakulatu, należy więc łapać co się da i nie uronić nawet kropli. W 1ml. nasienia jest ok. 5mld. plemników. Często już po 2 - 3 pobudzeniach tryk ma wytrysk.

2. Sztuczna pochwa.

- Model rosyjski długi

- Model norweski

OGIER:

1. Sztuczna pochwa.

Jest to metoda najczęściej używana. Często nie udaje się pobrać nasienia, jeśli ogier jest przyzwyczajony do krycia naturalnego.

Są 2 typy pochew:

• Z elastycznym cylindrem zewnętrznym:

- Model Missouri (Missisipi)- posiada zamknięty zbiornik na nasienie, połączony z elastycznym

cylindrem zewnętrznym. Składa się z 2 pasków twardej gumy, otoczonych 2 wkładkami-

zewnętrzną i wewnętrzną (wywiniętą). Wkładki te są zgrzane ze sobą, między nie wlewa się

wodę przez zawór wodno-powietrzny. Poza tym jest skórzana osłona z uchwytem.

- Model francuski

- Model Kraków 66- posiada otwarty zbiornik na nasienie. Wkładkę umieszcza się w środku

cylindra i między zewnętrzną i wewnętrzną wlewa się wodę- ok. 1litra, tak, żeby wkładki się

zbliżyły, ale nie za bardzo.

• Z twardym cylindrem zewnętrznym:

- Model radziecki- posiada metalowy cylinder zewnętrzny, wkładkę wewnętrzną wywijaną na

zewnątrz, zamknięty zbiorniczek na nasienie

- Model Cambridge (angielski)- posiada metalowy cylinder z uchwytami; zbiornik na nasienie

może być szklany, ponieważ posiada osłonkę metalową, nakręcaną na cylinder zewnętrzny

- Model duński

- Model lwowski (Olbrychta)

- Model Kraków 55

2. Wygarnianie.

Nasienie można wygarniać z dróg rodnych samicy po kopulacji z ogierem. Można to robić ręcznie, łyżeczką albo w jeszcze inny sposób.

• Iwanov włożył gąbkę do pochwy klaczy, umieścił ją w okolicy szyjki macicy, a po kopulacji wyjął i wycisnął.

Nasienie pobierane metodą wygarniania nadaje się tylko do celów badawczych. Możemy ocenić czy jest dobre czy złe. Nie nadaje się do sztucznego unasienniania!!!

3. Pobieranie na miseczkę (podstawkę).

Należy przygotować zbiornik z dużym lejkiem. Ogiera dopuszcza się do krycia, ale zanim dojdzie do ejakulacji, ściągamy go z klaczy. Nasienie ulega upłynnieniu, dochodzi do zwiotczenia prącia i ejakulat spływa do miseczki. Tak pobrane nasienie używa się tylko do badania.

4. Prezerwatywa.

Metoda ta pozwala na uzyskanie nasienia o bardzo dobrej jakości. Prezerwatywa musi być jałowa; nakładamy ją po wzwodzie. Ma ona kształt grzyba- posiada specjalne rozszerzenie. U ogiera podczas erekcji żołądź prącia ma kształt kapelusza i gdyby nie było rozszerzenia prezerwatywa mogłaby pęknąć. Pisiorka należy dokładnie umyć, zdezynfekować, przepłukać płynem fizjologicznym.

5. Środki farmakologiczne.

Np. ksylazyna- powoduje zwiotczenie dróg wyprowadzających nasienie (można je pobrać do badań)

6. Masaż gruczołów dodatkowych.

PIES:

1. Masturbacja.

2. Sztuczna pochwa.

Ćwiczenie 7.

Badanie i ocena nasienia.

DOTYCHCZASOWY PODZIAŁ:

Badanie wstępne nasienia:

- badanie makroskopowe (objętość, barwa, zapach, konsystencja, pH, ziarnistość)

- ocena nasienia na stoliku Bloma ( ruch masy plemników, ruch indywidualny, aglutynacja, gęstość,

szacunkowa ocena ilości plemników)

Badania dodatkowe:

- koncentracja plemników

- morfologia plemników

- odsetek plemników martwych

- badanie mikrobiologiczne nasienia

- badanie biochemiczne nasienia

- ocena przeżywalności plemników

PODZIAŁ OBECNIE OBOWIĄZUJĄCY:

• Badanie makroskopowe: objętość, barwa, zapach, konsystencja, pH, ziarnistość

• Badanie mikroskopowe: ocena nasienia na stoliku Bloma

• Badania dodatkowe:

- koncentracja plemników

- morfologia plemników

- odsetek plemników martwych

- badanie mikrobiologiczne nasienia

- badanie biochemiczne nasienia

- ocena przeżywalności plemników

BUHAJ:

Badanie makroskopowe nasienia:

1. Objętość ejakulatu: 0.5 - 17ml. (średnio 4 - 7ml.)

Objętość ejakulatu zależy od intensywności eksploatacji. Gdy buhaj często wykonuje skoki,

ilość nasienia z pełnego ejakulatu jest mniejsza, niż kiedy rzadko oddaje nasienie.

U buhaja powinny być 2 - 3 dniowe przerwy (1 - 2 dni krycia i następnie 2 - 3 dni odpoczynku).

Jeden buhaj średnio może oddać 120 skoków w roku.

Objętość zależy też od wieku buhaja i czasu, kiedy osiągnie pełny rozwój (najwięcej nasienia

oddaje do 4 - 5 lat). Dojrzałe buhaje oddają mniej nasienia.

Istotny jest też stopień pobudzenia płciowego. Im większe pobudzenie płciowe, tym większa

objętość ejakulatu. Buhaje słabo pobudzone, oddają mniej nasienia. Gwałtowne buhaje w ogóle

nie nadają się do krycia.

Wpływ ma również żywienie- odpowiednia dawka pokarmowa. Buhaj nie może być zapasiony,

ani wychudzony.

2. Barwa ejakulatu- nasienie zwykle jest białe nieprzejrzyste lub żółtawe (od domieszki flawin-

ryboflawina- wit B₂), często określane jako barwa kości słoniowej.

Odstępstwa od barwy mogą świadczyć o stanach patologicznych.

Zmiana barwy ma miejsce np.:

- przy domieszkach moczu

- gdy jest krew przy nadmiernym pobudzeniu płciowym

- przy brodawczycy

- gdy są obecne domieszki ropy (barwa nasienia jest biało-żółtawa do zielonkawej)

- przy bardzo niskiej koncentracji plemników (barwa wodnista)

3. Konsystencja:

- śmietanowata przy bardzo dużej koncentracji plemników, ok. 1mld./1ml.

- mleczno-śmietanowata przy koncentracji 700 - 800mln./1ml.

- mleczna przy koncentracji 500 - 600mln./1ml

- wodnisto-mleczna, gdy jest poniżej 500mln./1ml.

Osady na dnie zbiorniczka- są to zmiany powstałe w wyniku aglutynacji plemników.

Zabrudzenia- to przedostające się do nasienia ciała obce (np. ze sztucznej pochwy lub inne

pozostałości)

4. Zapach- specyficzny, przypomina zapach krowiego mleka. Zmienia się przy obecności

domieszek (krew, mocz, ropa).

5. Kwasowość (pH)- fizjologicznie wynosi 6.2 - 7.2 (średnio 6.8)

Wzrost pH powyżej 7 może być związany z procesem zapalnym w obrębie dróg

wyprowadzających nasienie (zwłaszcza przy zapaleniu gruczołów pęcherzykowych).

Wzrost pH ma też miejsce przy niskiej koncentracji plemników, bo im więcej plemników, tym

więcej procesów metabolicznych, więcej jonów H⁺ i niższe pH.

Gdy jest dużo wydzieliny z dodatkowych gruczołów płciowych, mimo prawidłowej

koncentracji, pH wzrasta nawet do 7.5 - 8.2.

pH ocenia się pH-metrem lub za pomocą papierka wskaźnikowego.

TRYK:

1. Objętość ejakulatu- 0.2 - 2ml. (do 4ml.)

Objętość zależy od stopnia pobudzenia płciowego oraz indywidualnych i rasowych

właściwości tryka. Tryki ras szlachetnych (Merynosy) dają mniej nasienia niż rasy prymitywne

(Karakuły).

2. Barwa- biała, biało-żółtawa, kremowo-biała, może być żółto-brązowa w nasieniu o bardzo dużej

koncentracji plemników (nawet do 5mld. plemników/1ml.). Przy niskiej koncentracji nasienie

jest coraz bardziej wodniste i ma barwę mleczną, przechodzącą w wodnistą.

Barwa zmienia się, gdy są domieszki z krwi, ropy, moczu. Krew świadczy o zmianach

patologicznych (brodawczaki, uszkodzenia mechaniczne prącia lub cewki moczowej).

3. Konsystencja- związana jest z koncentracją (średnia koncentracja: 2 - 5mld. plemników/1ml.)

Fizjologicznie jest konsystencja śmietanowata. Przy bardzo dużej koncentracji plemników,

gołym okiem widoczne są ziarnistości.

4. Zapach- nasienie tryka jest bezwonne lub wykazuje słaby zapach owczego potu. Odstępstwa od

zapachu najczęściej są patologiczne.

5. pH- fizjologicznie wynosi 6.1 - 6.4.

W nasieniu o wysokiej koncentracji plemników (ok. 5mld.) pH może wynosić nawet 5.9.

Rzadziej spotyka się alkaliczny odczyn nasienia (ok. 7.3), ale taki też może się zdarzyć.

OGIER:

1. Objętość ejakulatu- wynosi 60 - 70ml., z wahaniami od 20 do 250ml.; w tym objętość frakcji

bogatej w plemniki wynosi 25 - 30ml., a resztę stanowi frakcja śluzowo-galaretowata z

dodatkowych gruczołów płciowych.

Do punktu ejakulacyjnego przyjmowane są ogiery, u których objętość ejakulatu jest nie mniejsza

niż 15ml.

Objętość ejakulatu zależy od rasy- konie zimnokrwiste nieszlachetne oddają więcej ejakulatu,

najmniej dają araby.

2. Barwa- fizjologicznie jest mleczno-biała z odcieniem sinawym, ale są różnice osobnicze w

zabarwieniu. Może być barwa mleczno-szara, mleczno-żółta. Odchylenia od barwy występują

przy domieszkach w wydzielinie dodatkowych gruczołów płciowych.

3. Konsystencja- fizjologicznie od wodnistej do śluzowatej. Frakcja plemnikowa ma konsystencję

mleczno-śluzowatą, natomiast frakcja galaretowata ma konsystencję ciągliwą (galaretowatą).

4. Zapach- woń jest zbliżona do woni potu końskiego.

5. pH- nasienie ogiera przeważnie jest słabo alkaliczne, waha się w granicach 7 - 8, średnio

wynosi 7.3. Zasadowy odczyn nadaje pierwsza, wodnista frakcja nasienia, której pH= 8.1 - 8.8.

KNUR:

1. Objętość ejakulatu- 80 - 900ml do 1litra; średnio 500ml.

Objętość zależy od rasy, wieku, częstotliwości ejakulacji. Knur do 1roku oddaje 120 - 200ml.

nasienia, a powyżej 1roku 300 - 400ml. Najmniej nasienia oddają knury rasy Durock- nawet

poniżej 80ml. Zgodnie z Ustawą, do rozpłodu nie nadają się knury, oddające poniżej 50ml.

2. Barwa- przypomina silnie rozrzedzone mleko, wygląda jak kość słoniowa. Zmętnienie zależy od

koncentracji plemników.

3. Konsystencja:

W nasieniu knura występują 3 frakcje:

- frakcja przedplemnikowa, którą stanowi wydzielina gruczołów opuszkowo-cewkowych; jest

ona przejrzysta, śluzowata

- frakcja plemnikowa- jest biała lub szara, nieprzejrzysta, konsystencji mlecznej lub

śmietanowatej

- frakcja galaretowata- jest barwy szaro-białej, o konsystencji galarety

Frakcje te nie są wyraźnie odgraniczone od siebie. Mogą tworzyć się krupki (zlepy), które są

bardzo lepkie i mogą przyczepiać się do wszystkiego.

4. Zapach- przypomina białko jaja kurzego, jest bardzo specyficzny dla gatunku (śmierdzi).

PIES:

1. Objętość- objętość całego ejakulatu wynosi 1 - 40ml (zwykle ok. 9ml.). W Klinice na Głębokiej

najczęściej uzyskuje się 1 - 14ml.

Objętość zależy od wielkości psa i od wielkości prostaty (im większy pies, tym większa prostata).

Zależy też od sposobu pobierania nasienia. Metoda manualnego pozyskiwania nasienia

(masturbacja), pozwala na uzyskanie największej objętości.

Istotny jest również stopień pobudzenia płciowego. Nasienie należy pobierać w obecności suki

w cieczce, wtedy pies szybciej się pobudza, łatwiej oddaje nasienie i jest ono lepszej jakości w

porównaniu z nasieniem pochodzącym od psa słabo pobudzonego.

2. Barwa.

3. Konsystencja.

Objętość, barwa i konsystencja są różne dla poszczególnych frakcji:

- Pierwsza frakcja- z gruczołów cewkowych. Objętość wynosi 0.1 - 1ml., barwa przezroczysta,

konsystencja wodnista. Frakcja ta nie zawiera plemników. Jej zadanie polega na oczyszczeniu

dróg wyprowadzających i przygotowaniu drogi dla plemników.

- Druga frakcja- plemnikowa. Frakcja ta pochodzi z najądrzy, jest barwy mlecznej, konsystencji

śmietanowatej, o objętości 0.5 - 6ml.

- Trzecia frakcja- z prostaty. Jest to frakcja przejrzysta, o konsystencji wodnistej, z niewielką

zawartością plemników. Objętość tej frakcji wynosi 5 - 30ml.

Barwa, konsystencja i zapach mogą się zmieniać.

4. Zapach- jest specyficzny dla psa.

5. Kwasowość- pH pełnego nasienia wynosi 6.1 - 7.0

1. frakcja: 5.8 - 6.6

2. frakcja: 6.0 - 6.6

3. frakcja: 6.1 - 7.2

Mikroskopowe badanie nasienia na stoliku Bloma:

Stolik Bloma jest to szkiełko podstawowe, w którym na środku jest wyżłobiony rowek, a cylinderek jest zeszlifowany. Po aplikacji kropli nasienia i nałożeniu szkiełka nakrywkowego, tworzy się obraz. W różnych miejscach są różne grubości warstwy nasienia.

widok z góry:

W środkowym krążku warstwa nasienia ma grubość 50µ, a wokół niego jest rowek z warstwą nasienia o grubości 350µ. Na to nałożone jest kwadratowe szkiełko nakrywkowe, pod którym na zewnątrz rowka tworzy się warstwa grubości 5µ.

widok z boku:

| | |

350µ 50µ 350µ

Na stoliku Bloma ogląda się poszczególne frakcje nasienia. W każdej frakcji ocenia się inne cechy.

1. W warstwie o grubości 350µ oceniamy ruch falowy plemników, przy użyciu małego powiększenia: 50 - 100x. Falowanie dotyczy nasienia gęstego (buhaja, tryka).

Ocena:

- brak falowania: ─

- ledwo widoczne falowanie (u ogiera) ±

- słabe falowanie +

- średnie falowanie + +

- silne falowanie + + +

- bardzo silne falowanie (tylko u tryka) + + + +

To, czy wystąpi falowanie w nasieniu ogiera, psa lub knura, zależy od tego, ile nasienia pobraliśmy i ile było frakcji plemnikowej. U psa może być silne falowanie, gdy pobierzemy frakcję plemnikową. My jednak badamy pełne nasienie, dlatego nie widać falowania.

2. W warstwie o grubości 5µ oceniamy ruch indywidualny i aglutynację.

Ruch:

Fizjologicznie, plemniki wykonują ruch postępowy i torpedowy. Przyjęto 5-stopniową skalę ocen. Plemniki o ruchu postępowym wykonują ruch jednostajny do przodu.

Plemniki o ruchu torpedowym posuwają się do przodu i jednocześnie obracają się wzdłuż długiej osi.

Ocena: ocenia się w % lub stopniach

1. 1 - 20% plemników o ruchu postępowym (torpedowym) (1º)

2. 20 - 40% (2º)

3. 40 - 60% (3º)

4. 60 - 80% (4º)

5. 80 - 100% (5º)

Ruchy patologiczne:

- krążący C (zegarowy- H)

- wsteczny R

- oscylujący O

- brak ruchu N- necrospermia (martwe nasienie)

W nasieniu większości gatunków (buhaj, ogier, knur), co najmniej 70% plemników powinno wykazywać ruch postępowy. Gdy jest mniej niż 70%, płodność (jakość) ♂ ocenia się na podstawie wyników krycia. Czasami taki samiec bardzo dobrze kryje i nie ma potrzeby go eliminować.

Oznaczenie: 3/90 oznacza, że jest 90% plemników w ruchu, i mają one 3º ruchu postępowego (czyli 40 - 60% wykazuje ruch postępowy).

Aglutynacja:

Do aglutynacji dochodzi w wyniku zlepiania się główek plemników, które fizjologicznie mają takie same ładunki elektryczne. Gdy dojdzie do zaburzeń, plemniki zmieniają ładunki i przyciągają się.

Ocena: oceny dokonuje się w skali

1. słaba aglutynacja

AA- średnia aglutynacja

AAA- silna aglutynacja

Do zmiany ładunku plemników może dojść w wyniku zanieczyszczenia pipety, w przypadku dostania się drobnoustrojów do nasienia. Wirusy, bakterie, przeciwciała powodują opsonizację plemników i ich zlepianie.

3. W warstwie o grubości 50µ dokonuje się oceny gęstości nasienia. Plemniki ogląda się w środkowym krążku, po ich wcześniejszym unieruchomieniu (nakraplamy nasienie na zimne szkiełko lub je podgrzewamy), pod powiększeniem 200x.

Jest to szacunkowa ocena koncentracji plemników (mało dokładna). Pomiarów dokonuje się

na podstawie odległości pomiędzy plemnikami.

Aspermia- brak nasienia

Oligospermia- bardzo mało plemników

Ocena:

- R (rarum)- nasienie rzadkie; odległość między główkami plemników jest większa od długości witki

- SD (semidensum)- nasienie średnio gęste; odległość między główkami jest do długości witki

- D (densum)- nasienie gęste; odległość między główkami jest mniejsza niż połowa długości witki

- DD (densissimum)- nasienie bardzo gęste; plemniki układają się na sobie, jest jeden przy

drugim; takie nasienie występuje tylko u tryka.

Kiedyś wykonywało się jeszcze próby na przeżywalność plemników w większej i mniejszej temperaturze niż temp. ciała. Obecnie wykonuje się to czasem tylko u ogiera. Im dłużej plemniki przeżywają w większej lub mniejszej temperaturze niż temp. ciała, tym dłużej mogą być przechowywane.

Dla nasienia przeżuwaczy wykonywało się badania w temp. 46.5ºC u tryka i 42ºC u buhaja (powyżej temp. ciała). Nasienie rozcieńczało się 10x, mieszało z 2.9% cytrynianem sodu i wkładało się je do cieplarki o ww. temperaturze. Co 15minut dokonywało się pomiarów i oceniało się ruch postępowy na stoliku Bloma. Nasienie buhaja powinno przeżyć 1godzinę, a tryka 3 - 3.5godz. Ostatniej oceny dokonuje się po całkowitym zahamowaniu ruchu.

Temperatura, poniżej temp. ciała, do której w badaniach ochładzamy nasienie, wynosi 4 - 5ºC dla ogiera, 18ºC dla knura.

Ćwiczenie 8.

Ocena koncentracji nasienia.

Ocena mikrobiologiczna i biochemiczna nasienia.

Ocena koncentracji nasienia umożliwia oszacowanie stopnia jego rozrzedzenia w pipecie inseminacyjnej. Trzeba znać wyjściową ilość nasienia żeby to ustalić. Np. w przypadku inseminowania krowy, musimy zaaplikować 20mln. plemników w 0.2ml. dawce. Gdy zbadamy, jaka jest koncentracja, możemy odpowiednio rozrzedzić nasienie, żeby otrzymać wymagane parametry. Oceny dokonuje się na stoliku Bürkera.

Metoda uproszczona (fotokolorymetryczna)- polega na ustaleniu koncentracji plemników, w zależności od stopnia przechodzenia światła przez nasienie umieszczone w kuwecie, w porównaniu z próbą „0”. Metoda ta wychwytuje wszelkie domieszki i traktuje je w obliczeniach jako plemniki, co może dawać wyniki fałszywie „+”.

Można tez dokonywać oceny za pomocą tzw. klinu optycznego (klin Karrasa)- jest to ocena wzrokowa gęstości nasienia. Do badania używa się naczynia w kształcie klina (rozszerza się ku górze). Poza tym jest skala, na której każdy poziom oznacza określoną koncentrację.

Zawartość plemników w 1cm³ nasienia:

- buhaj 800mln. - 1mld.

- tryk 1.5 - 3.5mld.

- ogier 50 - 150mln.

- knur 100 - 200mln.

Ocena koncentracji nasienia na stoliku Bürkera:

Jest to metoda cytometryczna (hemocytometryczna), stanowi standaryzację wszystkich metod.

Do oceny potrzebny jest:

- mikroskop ze stolikiem krzyżowym

- komora Bürkera

- szkiełko nakrywkowe

- probówki o pojemności 25ml.

- pipety 0.1ml., 1ml., 2ml., 20ml.

- 3% wodny roztwór NaCl

- 5% wodny roztwór eozyny niebieskawej

Wykonanie:

1. Dokładnie oczyścić stolik (komorę) Bürkera i szkiełko nakrywkowe, tak, aby powstały pierścienie barwne Newtona.

2. Suchą pipetą odmierzamy po 0.1ml. nasienia i aplikujemy do 2 probówek.

3. Do każdej probówki z nasieniem dodajemy po 0.5ml. 5% eozyny, która barwi tło, oraz 19.5ml. 3% NaCl. W ten sposób uzyskujemy rozcieńczenie nasienia 1:200, najczęściej stosowane w przypadku badania nasienia buhaja. U tryka wykonujemy rozcieńczenie 1:400, poprzez dodanie 39.5ml. 3% NaCl i 0.5ml. 5% eozyny. U ogiera i knura rozcieńczamy 100x, dodając 9.5ml. 3% NaCl i 0.5ml. 5% eozyny.

4. Wszystko dobrze mieszamy.

5. Bagietką bądź pipetą pobieramy kroplę nasienia i kładziemy na brzeg szkiełka nakrywkowego w pobliże siatki. Kropla sama wpływa pod szkiełko i pokrywa całą powierzchnię siatki.

6. Komorę Bürkera kładziemy na stoliku mikroskopu pod małym powiększeniem i szukamy siatki.

7. Gdy znajdziemy siatkę, zmieniamy na większe powiększenie (40x), tak, aby w polu widzenia był widoczny 1 duży kwadrat.

8. Liczymy plemniki w 10 dużych kwadratach po przekątnej; liczymy tylko główki plemników (z witkami bądź luźne), znajdujące się wewnątrz dużego kwadratu oraz na lewej i dolnej linii (bierzemy pod uwagę tylko plemniki dotykające linii od wewnątrz).

9. Liczymy sumę i średnią liczbę plemników, przypadających na 1 duży kwadrat w 2 siatkach.

10. Otrzymaną średnią liczbę plemników z obu siatek mnożymy przez stopień rozrzedzenia oraz przez objętość rozrzedzonego nasienia, znajdującego się w jednym dużym kwadraciku.

Pole powierzchni = 1/25 pola kwadratowego

Głębokość = 0.1mm., od szkiełka do dna komory.

Zatem objętość = pole powierzchni (1/25mm²) x głębokość (1/10mm) = 1/250mm³

Objętość (1/250mm³) x rozrzedzenie (1/200) = 1/50000mm³

tryk (1/400)

ogier (1/100)

Przykładowa ilość plemników w dużych kwadratach :

I siatka II siatka

16 14

15 12

12 15

10 17

18 14

Uwaga! Dopuszczalna różnica w ilości plemników w obu siatkach nie powinna przekraczać 10% sumy ogólnej! Np. gdy na pierwszej siatce są 152 plemniki, a na drugiej 147, co w sumie daje 299, to 10% tej sumy wynosi 29.9. Zatem różnica między liczbą plemników z 1 i 2 siatki nie może być większa niż 29,9. W tym przypadku wynosi 5, więc wszystko jest ok. (152 - 147 = 5).

Inne metody oceny koncentracji plemników:

- Oznaczanie gęstości nasienia na podstawie stopnia zmętnienia (metoda densymetryczna):

Pomiar zmętnienia nasienia przeprowadza się w spermiodensymetrze wzoru Karrasa (tzw. klin

Karrasa), na podstawie widoczności cyfr stałej skali, przez różnej grubości warstwę nasienia.

Klin Karrasa ma skalę do 100 na tylnej ścianie. Pomiaru dokonujemy na nie rozrzedzonym,

świeżym nasieniu.

Wykonanie:

1. Do klina wlewamy 10ml. fizjologicznego NaCl, dodajemy 0.1 lub 1ml. nasienia (w zależności od szacunkowej oceny gęstości; zwykle 1ml. nasienia knura i ogiera, 0.1ml. nasienia przeżuwaczy).

2. Dokładnie mieszamy.

3. Odczytujemy na skali klina cyfrę, jaka jest jeszcze widoczna przez rozrzedzone nasienie.

4. Znajdujemy w tabeli, odpowiadającą odczytanej cyfrze, koncentrację nasienia.

Dopuszczalny błąd pomiaru wynosi ± 5%.

- Metoda fotometryczna (fotokolorymetryczna) wg. Maika:

Metoda ta jest stosowana w zakładach unasienniania. Pomiar wykonujemy w nefelometrach lub

fotokolorymetrach.

Wykonanie:

1. Jedną kuwetę napełniamy rozcieńczalnikiem (2.8% cytrynian sodu).

2. Drugą kuwetę napełniamy nasieniem rozcieńczonym 1:50 (nadaje się tylko dla nasienia z oceną densum- gęste). Aby rozcieńczyć nasienie 50x, należy dodać mikropipetą 0.2ml. nasienia do 9.8ml. rozcieńczalnika.

3. Mieszamy przez 30sekund i odczytujemy ekstynkcję.

4. Po odczytaniu, pobieramy z kuwety z nasieniem 1ml. płynu i rozcieńczamy 3% roztworem NaCl.

5. Za pomocą hemocytometru oznaczamy koncentrację plemników.

6. Wykreślenie prostej regresji przeprowadzamy, znacząc odczyty ekstynkcji na osi rzędnych, a koncentrację plemników w 1mm³ na osi odciętych.

Badanie mikrobiologiczne nasienia:

W ocenie stanu higienicznego nasienia, należy kierować się następującymi kryteriami:

- w nasieniu nie mogą znajdować się żadne drobnoustroje chorobotwórcze

- w 1cm³ nasienia świeżego, nie rozrzedzonego liczba drobnoustrojów niechorobotwórczych lub

warunkowo chorobotwórczych nie powinna przekroczyć 50 tysięcy.

- w 1cm³ nasienia mrożonego liczba drobnoustrojów niechorobotwórczych lub warunkowo

chorobotwórczych nie powinna przekroczyć 10 tysięcy.

- w nasieniu świeżym, nie rozrzedzonym liczba leukocytów nie powinna przekroczyć 1/na 1000

plemników.

W nasieniu pobieranym od knura, może być nawet 150tys. drobnoustrojów saprofitycznych. Przy

pobieraniu nasienia od ogiera na pochwę zamkniętą- może dostać się ich 10tysięcy, a na otwartą-

pojedyncze drobnoustroje.

Cel badania mikrobiologicznego:

- wykluczenie rozprzestrzeniania się chorób zakaźnych

Ocena mikrobiologiczna nasienia ♂ powinna opierać się na wynikach badania ilościowego i jakościowego drobnoustrojów, według aktualnie obowiązujących przepisów.

Badanie jakościowe (identyfikacja drobnoustrojów):

- posiew na podłoże wybiórczo-różnicowe

- wykonanie i barwienie preparatów (np. metodą Grama)

Badanie ilościowe:

- oparte na wyliczeniu ilości drobnoustrojów w jednostce nasienia (najczęściej w 1ml.)

Wykonanie:

- przygotować 2 płytki do posiewów bakteryjnych (agar z krwią), przedzielone na pół

- wykonać rozrzedzenia nasienia z płynem fizjologicznym w 2 probówkach- 1:100 i 1:1000

- na połowę pierwszej płytki wysiać 0.05ml. nasienia nie rozrzedzonego, a na drugą połówkę

nasienie rozrzedzone 1:100

- na drugą płytkę analogicznie posiać nasienie nie rozrzedzone i rozrzedzone 1:1000

- umieścić płytki w cieplarce o temp. 37ºC na 48godz.

Po inkubacji, liczymy kolonie bakteryjne na tej połowie płytki, na której wyrosło więcej niż 5, a mniej niż 100 kolonii. Wyliczoną liczbę kolonii przemnaża się odpowiednio przez 20 (nasienie nie rozrzedzone), 200 (1:100) i 20000 (1:1000). W ten sposób uzyskujemy ilość bakterii w 1ml. nasienia.

Np. gdy na połowie płytki z rozrzedzeniem 1:1000 jest 100 kolonii, to w 1ml. nasienia jest ponad 2mln. drobnoustrojów.

DROBNOUSTROJE, KTÓRYCH NIE MOŻE BYĆ W NASIENIU BUHAJA:

Drobnoustroje te wykrywamy za pomocą posiewów i badań serologicznych.

• Bakterie:

- prątek gruźlicy

- pałeczki ronienia zakaźnego (Bruceloza)

- mętwik płodowy (Kampylobakterioza)

• Pierwotniaki:

- rzęsistek bydlęcy

• Wirusy:

- białaczki

- z grupy IBR - IPV (Otręt, Ronienie zakaźne, Zap. jamy nosowej i tchawicy)

• Drobnoustroje zaliczane do warunkowo chorobotwórczych:

- chlamydia

- mykoplazmy

- gronkowiec złocisty

- E. Coli

- Streptococcus β- hemolityczny

- Pseudomonas aeruginosa (właściwie powinien być zaliczony do chorobotwórczych, a nie

do warunkowych)

- Corynebacterium pyogenes (Arcanobacter)

- czasem Staphylococcus epidermicus

• Grzyby:

- rodzaj Aspergillus

- Mucor

- Rhizophus

- Absidia

- Candida

- Trichosporon

Badania biochemiczne (dodatkowe):

- oznaczanie poziomu fruktozy (głównie u buhajów)

- oznaczanie poziomu kwasu cytrynowego

- oznaczanie poziomu katalizy

- oznaczanie poziomu fosfatazy kwaśnej i zasadowej

Są to badania najczęściej wykonywane.

Można też wykonywać :

- oznaczanie hiluronidazy

- oznaczanie 5α- nukleotydaza

To badania bardzo wybiórcze.

Fruktoza:

- fizjologiczny poziom fruktozy u buhaja wynosi 280 - 770mg%

- u tryka do 250mg%

- u knura jest mało fruktozy (ok. 10mg%), nie stanowi tu ona materiału energetycznego

- u ogiera jest zaledwie ślad fruktozy

Fruktoza świadczy o funkcji dodatkowych gruczołów płciowych (gruczołów pęcherzykowych i prostaty) oraz pośrednio o aktywności hormonalnej, bo gruczoły płciowe są pod kontrolą testosteronu. O poziomie testosteronu świadczy też libido. Może się zdarzyć, że dodatkowe gruczoły płciowe funkcjonują prawidłowo, ale istnieją zaburzenia w przekształcaniu testosteronu do 5α- hydroksytestosteronu, spowodowane brakiem odpowiedniego enzymu (np. w wyniku przewlekłego procesu zapalnego). Mogą też być zaburzenia w produkowaniu samego testosteronu, w wyniku zmian zwyrodnieniowych lub toksycznych, uszkadzających jądra.

Do oznaczania poziomu fruktozy stosuje się metodę spektrofotometryczną Roya.

Kwas cytrynowy:

- norma u buhaja wynosi 500 - 1000mg%

- tryk 100 - 250mg%

- knur ok. 100mg%

- ogier 5 - 50mg%

Kwas cytrynowy decyduje o osmolarności nasienia. Występuje w dużej ilości w nasieniu pierwszej frakcji- 300miliOsm. Odpowiada za warunki potrzebne do przechowywania nasienia i późniejsze przemieszczanie plemników.

Katalaza:

Jest to enzym, który w większej ilości świadczy o obecności niepożądanych domieszek (krew, ropa). Katalaza jest produkowana przez inne komórki niż plemniki. Wykrywa się ją przy pomocy H₂O₂- powoduje rozszczepienie wody utlenionej.

- norma u buhaja wynosi poniżej 300mg%

Przy wartościach do 400mg%, podejrzewamy o zanieczyszczenie; gdy jest powyżej 400mg%

świadczy to o stanie zapalnym narządów buhaja- do nasienia dołącza się krew lub drobnoustroje,

stanowiące przyczynę lub wikłające stan zapalny.

Fosfataza:

Odpowiada za metabolizm w obrębie plemników. Jej zwiększony poziom świadczy o rozpadzie plemników w większej ilości, np. gdy samce nie są systematycznie używane.

- norma fosfatazy zasadowej AP wynosi 14 - 24 jednostek Bodeńskiego

- norma fosfatazy kwaśnej wynosi 30 - 60 jednostek Bodeńskiego

Hialuronidaza:

Jej obecność świadczy o wycieku z akrosomu. Możemy się domyślać, że w drogach wyprowadzających zaistniał stan niefizjologiczny, w wyniku którego doszło do uszkodzenia akrosomu i wycieku enzymu do plazmy nasienia.

Uszkodzenie akrosomu nie zawsze stwierdza się poprzez oznaczanie hialuronidazy. Można np. dokonać oceny morfologicznej (na integralność akrosomu) lub przeprowadzić test hipoosmotyczny (na integralność błon komórkowych). Plemniki umieszcza się w określonych roztworach glukozy, fruktozy lub cytrynianu i patrzymy, jak reagują. Gdy plemniki się skręcają, próba jest „+”, integralność nie została naruszona. Gdy plemnik jest wyprostowany, świadczy to o utracie integralności błony komórkowej i obecności wycieku.

Ćwiczenie 9.

Ocena morfologiczna nasienia i odsetek plemników martwych.

Ocena morfologiczna nasienia i odsetek plemników martwych, wyrażany w % pozwala na klasyfikację ♂ według kryteriów. Sprawdzamy, czy dany samiec nadaje się do rozrodu, czy nie. Badamy nasienie 2x i jeśli mimo leczenia jakość nasienia nie poprawia się, samca należy wyeliminować z rozrodu. Ocena jest możliwa po wykonaniu rozmazu z nasienia świeżego! Rozmaz sporządza się zgodnie z procedurą. Ocena morfologii plemników jest najbardziej obiektywną oceną nasienia, gdyż na jej podstawie możemy wykazać nieprawidłowości w budowie plemników- wykrywamy tzw. wady plemników.

Wady plemników:

1. Wady pierwotne- powstają w procesie spermatogenezy.

2. Wady wtórne- powstają po wytworzeniu plemników, w drogach wyprowadzających nasienie (np. w wyniku stanu zapalnego) lub poza organizmem ♂ (np. nieprawidłowe wykonywanie preparatów).

Podział uwzględniający rodzaj zmian:

1. Wady główne- są to nieprawidłowości w budowie morfologicznej plemników, skorelowane z obniżoną płodnością ♂.

Łącznie nie powinno być więcej niż 15% plemników z wadami głównymi, w tym nie więcej

niż 5% wady najczęściej powtarzającej się.

2. Wady podrzędne- są to zmiany w budowie morfologicznej plemników, nie związane z płodnością ♂. Nie powinno być więcej niż 25% plemników z wadami podrzędnymi, w tym nie więcej niż 15% wady najczęściej powtarzającej się.

WADY GŁÓWNE:

1. Plemnik niedorozwinięty.

2. Plemnik podwójny.

3. Plemnik guzowaty- deformacja główki w miejscu, gdzie jest wakuola.

4. Plemnik bez głowy.

5. Plemnik z diademem główki.

6. Plemnik z główką gruszkowatą i olbrzymią.

7. Plemnik z główką zwężoną u podstawy.

8. Plemnik z główką o nieprawidłowym konturze główki.

9. Plemnik z główką małą i nieprawidłową.

10. Główka luźna i nieprawidłowa (brak witki).

11. Plemnik z wstawką w kształcie korkociągu.

12. Plemnik z nibywadą wstawki (wstawka kikutowata- bardzo cienka).

13. Plemnik z kroplą protoplazmy na wstawce w położeniu bliższym.

14. Plemnik z nibykroplą protoplazmy na wstawce (kropla rozlana, nie przesuwa się na witkę).

15. Plemnik z silnie zapętloną witką.

16. Plemnik z abaksalnym ustawieniem witki (prawidłowe dla ogiera!).

Silnie zapętlona witka nazywana jest wadą Daga, bo pierwszy raz została stwierdzona u

buhaja rasy duńskiej o imieniu Dag.

WADY PODRZĘDNE:

1. Plemnik z główką zwężoną.

2. Plemnik z główką małą, ale prawidłowo zbudowaną.

3. Plemnik z główką szeroką i olbrzymią.

4. Plemnik z główką luźną (często powstaje jako błąd techniczny przy robieniu rozmazu).

5. Plemnik z oddzieloną błoną akrosomu.

6. Plemnik z kroplą protoplazmatyczną w położeniu dalszym (ta wada może powstawać przy zbyt intensywnej eksploatacji, kiedy pobierane są plemniki z najądrzy, czyli takie, które nie nałożyły jeszcze kropli (ładunku) na siebie). Najczęściej występuje u knura.

7. Plemnik z pojedynczą pętlą witki (często u knura, w wyniku niedoborów białka i błędów żywieniowych).

8. Plemnik z pętlą na końcu witki.

OBCE KOMÓRKI- w ocenie morfologicznej nasienia zwracamy też uwagę na obecność komórek obcych.

Mogą to być:

- komórki olbrzymie wielojądrzaste

- twory meduzowate (powstają w wyniku uszkodzenia nabłonka plemnikotwórczego)

- nabłonki

- leukocyty

- erytrocyty (pojawiają się w wyniku uszkodzenia ciągłości lub przy ostrym stanie zapalnym)

W preparacie można barwić szczególnie wybrane elementy budowy plemnika, np. akrosom na seledynowo, a reszta jest pomarańczowa. Dzięki takiemu barwieniu, widoczne są uszkodzenia, zwężenia, obrzęk.

Rozmaz wykonuje się na czystym i odtłuszczonym szkiełku podstawowym. Drugie szkiełko, którym robimy rozmaz, musi być dobrze wyszlifowane. Preparat powstaje z tzw. kropli ciągnionej (kropla jest za szkiełkiem i ciągnie się za nim, a nie przed szkiełkiem, bo moglibyśmy uszkodzić nasienie).

METODY BARWIENIA:

1. Barwienie negatywne- polega na zabarwieniu otoczenia plemnika barwnikiem, który ściśle przylega do plemnika, ale nie wnika do jego wnętrza. Barwienie to służy do oceny plemników niedojrzałych, z kroplą protoplazmatyczną lub z nieprawidłowym akrosomem. Barwniki:

- najczęściej jest używany czarny tusz chiński

- może też być tusz chiński + 1% fenol

- można również używać 10% roztwór nigrozyny

- ewentualnie 10% roztwór błękitu opalu

Wykonanie:

1. Na szkiełko podstawowe należy położyć obok siebie 1 kroplę świeżo pobranego nasienia oraz 2 krople tuszu.

2. Obie krople mieszamy bagietką szklaną.

3. Następnie wykonujemy rozmaz za pomocą kropli ciągnionej. Można to zrobić na tym samym szkiełku, ale najlepiej przenieść kroplę mieszaniny na inne szkiełko.

4. Suszymy na powietrzu.

5. Pod mikroskopem szukamy miejsca, w którym tusz tworzy czarne, jednolite tło, a plemniki wyraźnie przeświecają i są dokładnie widoczne.

2. Barwienie fioletem goryczki- metoda bydgoska/Jaśkowskiego, z użyciem kilku barwników

Barwniki:

- 10% wodny roztwór eozyny niebieskawej

- barwnik gencjanowy- złożony, o składzie:

• fiolet goryczki 0.75g.

• błękit metylenowy 2.0g.

• glicerol 5.0g.

• woda destylowana ad 100cm³

Oba barwniki im są starsze, tym lepsze. Po sporządzeniu, muszą leżakować minimum 2 - 3 tygodnie. Po tym czasie musimy je przefiltrować i dopiero wtedy są gotowe do użycia.

Wykonanie:

1. Po wykonaniu preparatu z kropli ciągnionej, rozmaz suszymy na powietrzu i zaraz potem utrwalamy w 96% alkoholu przez 5 minut.

2. Płuczemy preparat w strumieniu wody.

3. Następnie zanurzamy go do roztworu eozyny niebieskawej na 20 - 60 sekund.

4. Ponownie płuczemy.

5. Zanurzamy do barwnika gencjanowego na 3 minuty.

6. Znów płuczemy.

7. Suszymy i oglądamy pod immersją (100x).

Dobrze zabarwione plemniki mają barwę różowo-fioletową. Ciemnofioletowe zabarwienie główek plemników lub nadmierne wybarwienie witek i ich zgrubienie, świadczy o zbyt długim przetrzymywaniu w barwniku gencjanowym.

Liczymy co najmniej 300 plemników, posługując się tabelą uwzględniającą wygląd plemników prawidłowych i zmienionych. Można użyć licznika, takiego jak przy liczeniu leukocytów w rozmazie krwi.

Ocenę morfologiczną nasienia, wykonuje się obowiązkowo na miesiąc przed wprowadzeniem ♂ do stacji pozyskiwania nasienia i co najmniej 1x w roku przy ocenie płodności samca oraz zawsze, gdy zmiany w obrębie wartości biologicznej nasienia wskazują na konieczność badań.

3. Barwienie eozyną i nigrozyną- służy nie tylko do oceny morfologicznej plemników, ale również do oceny odsetka plemników martwych. To metoda barwienia przyżyciowego, pozwalająca na odróżnienie plemników żywych, ruchliwych, których główki się nie barwią od plemników martwych, które barwią się na różowo.

Jeśli plemnik jest zdrowy i żywy, to główka pozostaje niezabarwiona, chyba że za długo będziemy trzymać preparat w barwniku. Z tego powodu barwienie nie powinno trwać dłużej niż 1 minutę i preparat należy zabezpieczyć przed wysuszeniem.

Barwniki:

- 5% wodny roztwór eozyny niebieskawej

- 10% wodny roztwór nigrozyny

Każdy z barwników rozpuszczamy w 2.9% cytrynianie sodu. Następnie mieszamy 1 część roztworu eozyny z 4 częściami roztworu nigrozyny (stosunek 1:4).

Wykonanie:

1. Na czyste, odtłuszczone szkiełko podstawowe o temp. 40ºC nanosimy 1 kroplę nasienia i 2 krople barwnika.

2. Mieszamy bagietką i suszymy w temperaturze pokojowej.

3. Utrwalamy preparat nad płomieniem.

4. Oglądamy zaraz po sporządzeniu.

Plemniki martwe mają barwę różową, a żywe są niezabarwione. Plemniki, które częściowo przyjmują barwnik, zaliczamy do martwych.

Liczymy od 300 - 500 plemników, uwzględniając wszystkie całe plemniki i luźne główki w polu widzenia. Dopuszczalna ilość plemników martwych w nasieniu płodnego ♂ wynosi nie więcej niż 30%.

4. Barwienie odczynnikiem Giemsy.

1. Po sporządzeniu rozmazu, zalewamy go barwnikiem May-Grünwalda na 3 - 5min.

2. Następnie zalewamy barwnikiem Giemsy na 15 - 30min.(z roztworu macierzystego barwnika sporządzamy roztwór roboczy- do 1ml. r-ru macierzystego dodajemy 25ml. wody destylowanej).

3. Zmywamy barwniki, suszymy i oglądamy pod powiększeniem 40x lub pod immersją.

5. Barwienie akrosomów- met. Wells-Awa. Rozmaz robi się podobnie, jak w met. bydgoskiej

Barwniki:

- 1% roztwór eozyny - 0.6ml.

- 1% roztwór zieleni, tzw. fast green FCF - 0.4ml.

Mieszamy 0.6ml. eozyny z 0.4ml. FCF i dodajemy do tego 1ml. alkoholu etylowego. Barwimy 4 - 5min. Najczęściej zwiększa się proporcje na kilka preparatów.

Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z 30.04.2004r w sprawie materiału biologicznego, wykorzystanego w rozrodzie zwierząt gospodarskich:

1. Ogier:

a. świeże nasienie ogiera, używane do unasienniania, zawiera nie mniej niż:

- 85% plemników bez zmian morfologicznych

- 40% plemników o ruchu prawidłowym

- minimum 50tys. plemników w 1mm³

- średnia zawartość plemników w nasieniu powinna być nie mniejsza niż 150tys. plemników w 1mm³ frakcji nasiennej ejakulatu

b. nasienie konserwowane w stanie płynnym lub nasienie mrożone powinno zawierać:

- co najmniej 300mln. plemników o ruchu prawidłowym w 1 dawce inseminacyjnej

2. Buhaj:

a. świeże nasienie, pochodzące od buhaja mającego nie więcej niż 18mies. życia, wykorzystywane

w sztucznym unasiennieniu, powinno zawierać nie mniej niż:

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

- 60% plemników o ruchu prawidłowym

- nie mniej niż 500tys. plemników w 1mm³

b. świeże nasienie buhaja, który ma powyżej 18 miesięcy, powinno zawierać minimum:

- 70% plemników o ruchu prawidłowym

- 60% plemników o ruchu prawidłowym

- nie mniej niż 500tys. plemników w 1mm³

- nasienie powinno charakteryzować się ruchem falowym, co najmniej na poziomie średnim(na + +)- ruch masy plemników

c. nasienie mrożone w słomce, powinno zawierać po rozmrożeniu:

- nie mniej niż 50% plemników o ruchu prawidłowym

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

- dodatkowo, powinno mieć nie mniej niż 6mln. plemników o ruchu prawidłowym- czyli w takiej słomce musi być 12mln. plemników, bo tylko 50% prawidłowo się porusza

Uwaga! Wcześniej wymagano, żeby w słomce było 20mln. plemników, ale najnowsza Ustawa zmniejsza wymagany poziom.

d. dawka inseminacyjna mrożonych w słomce, sortowanych plemników buhaja z chromosomem X

lub Y powinna mieć po rozmrożeniu nie mniej niż:

- 50% plemników o ruchu prawidłowym

- 1mln. plemników żywych

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

e. nasienie mrożone w kulce met. japońską(na export) po rozmrożeniu powinno mieć nie mniej niż:

- 35% plemników o ruchu prawidłowym

- 10mln. plemników o ruchu prawidłowym

- w kulce powinno być co najmniej 30mln. plemników

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

f. nasienie konserwowane w stanie płynnym, umieszczone w słomce, powinno mieć nie mniej niż:

- 50%plemników o ruchu prawidłowym

- 6mln. plemników o ruchu prawidłowym

- w 1 słomce powinno być minimum 12mln. plemników

- 80% plemników bez zmian morfologicznych; nie więcej niż 15% z wadami głównymi

3. Knur:

a. świeże nasienie knura, używane w sztucznym unasiennianiu, powinno zawierać nie mniej niż:

- 70% plemników o ruchu prawidłowym

- 100tys. plemników w 1mm³

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

- objętość jednej dawki inseminacyjnej nie może być mniejsza niż 80tys. mm³ (80ml.)

- w dawce 80ml. powinno być nie mniej niż 2mld. plemników

b. nasienie mrożone (w Polsce raczej się nie mrozi, tylko stosuje się import od innych).

Niezależnie od metody konfekcjonowania, po rozmrożeniu takie nasienie powinno zawierać nie

mniej niż:

- 40% plemników o ruchu prawidłowym

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

- 50% plemników z normalnym akrosomem

- ogólna liczba plemników w 1 dawce inseminacyjnej mrożonego nasienia powinna

wynosić po rozmrożeniu nie mnij niż 3mld.

4. Tryk i kozioł:

a. świeże nasienie tryka i kozła, używane w sztucznym unasiennianiu powinno zawierać nie mniej

niż:

- 70% plemników o ruchu prawidłowym

- 1.5mln. plemników w 1mm³

- 80% plemników bez zmian morfologicznych

b. nasienie mrożone powinno zawierać nie mniej niż:

- 50mln. plemników o ruchu prawidłowym

- 50% plemników o ruchu prawidłowym

- objętość dawki inseminacyjnej rozrzedzonego nasienia wynosi 0.2ml.

Ćwiczenie 10.

Metody konserwacji nasienia ♂ zwierząt domowych.

Konserwacja nasienia pozwala na jego dłuższe przechowywanie oraz zwiększenie ilości porcji nasienia używanego w rozrodzie. W Polsce, konserwację stosuje się u wszystkich gatunków samców zwierząt gospodarskich (bydło, trzoda chlewna, konie, owce, kozy, króliki; stosuje się też u psów i kotów).

BUHAJ:

Nasienie buhaja pierwszy raz konserwowano w latach '30. Już wtedy były stosowane różne rozrzedzalniki. Unasiennianie nasieniem płynnym praktykowano w Polsce do końca lat '70, później zostało zastąpione nasieniem mrożonym. Są 2 techniki mrożenia:

1. Metoda japońska (nasienie w kulkach). Obecnie produkuje się tylko na export.

2. Nasienie w słomkach.

Temperatura poniżej -100ºC powoduje zahamowanie metabolizmu plemników. Najlepszy pod tym względem okazał się ciekły azot, który jest stosunkowo bezpieczny i niepalny, jednak gdy jest w dużej ilości, wypiera tlen i może spowodować omdlenie, a nawet uduszenie. Z tego powodu, w bankach nasienia do pomieszczeń z ciekłym N nie mogą wchodzić pojedyncze osoby, ale minimum dwie! Zwykle jedna osoba jest bardziej wytrzymała na ciekły N i może szybko zainterweniować i pomóc koledze, jeśli jest jakaś awaria i dojdzie do wycieku. No, chyba że obie są wrażliwe, to są 2 trupy. W takich zakładach są oczywiście czujniki poziomu azotu, ale nie można im do końca wierzyć, bo zawsze może zdarzyć się jakiś błąd.

Mrożenie w kulkach:

W Polsce, metoda ta już nie jest stosowana u bydła (stosuje się ją u psa). Jest ona prosta, nie sprawia większych kłopotów. Mrożenie odbywa się metodą dwustopniową.

Pierwsza metoda mrożenia w kulkach polegała na zamrażaniu nasienia na suchym lodzie, który stanowił zestalony CO_2. Suchy lód nie ma fazy płynnej, z postaci stałej przechodzi w gazową (sublimacja). Podczas tego przechodzenia jest temp. -79ºC. Taka temperatura nie była zbyt dobra, ponieważ obserwowało się objawy procesów metabolicznych w komórce (plemniku). Badania wykazały, że temperatura -130ºC jest graniczna, przy której plemniki przechodzą w stan anabiozy.

Przed mrożeniem, nasienie należy rozrzedzić i musi ono ulec procesowi ekwilibracji (jest to przenikanie kriopreparatu przez błonę komórkową plemnika i zabezpieczenie wody w plemniku przed zamarznięciem). Taki kriopreparat powoduje przekształcenie wody do postaci amorficznej, bez zmiany konfiguracji przestrzennej. Dzięki temu, struktury wewnątrz plemnika nie ulegają uszkodzeniu. Najpopularniejszą substancją, osłaniającą przed procesem zamarzania był glicerol (alkohol III-rzędowy). Jego właściwości zostały odkryte przypadkowo. W latach '50 usiłowano znaleźć związek, dzięki któremu nasienie po rozmrożeniu miałoby takie same właściwości, jak przed mrożeniem. Przypadkowo, zamiast fruktozy, którą próbowano rozcieńczać, do nasienia dodano mieszaninę glicerolu z białkiem jaja kurzego (służyła do powlekania preparatów mikrobiologicznych i histologicznych). W taki sposób odkryto właściwości krioprotekcyjne białka jaja i glicerolu. Stosowano 7% glicerol. Obecnie najczęściej używanym kriopreparatem jest EDTA.

Po ekwilibracji, która trwa 4 - 6 godzin, można zamrażać nasienie.

Potrzebna była bryła lodu z CO_2.

Na bryłę lodu nakładano metalową sztancę (płytkę z nabitymi bolcami w kształcie półowali). Płytkę rozgrzewano w piecu (w miarę postępu w piecykach elektrycznych) i gorący metal nakładano na lód. Tam, gdzie dotykały bolce, wyparowywał CO₂ i powstawały zagłębienia. Laborantka nanosiła pipetą po 0.1 - 0.15ml nasienia w dołki. W tej ilości miało być ok. 20mln. plemników. Po ok. 20min. kuleczki były gotowe.

Gotowe kulki umieszczano w lejku na statywie i zanurzano w wanience z ciekłym N oraz substancjami spowalniającymi parowanie azotu.

W późniejszych latach stosowano pojemniki plastikowe, a następnie zaczęto umieszczać nasienie w kontenerach z ciekłym azotem. Kontenery z azotem uzupełnia się w zakładach co jakiś czas. Gdy zabraknie go choćby na godzinę, to nasienie już jest do wyrzucenia. Pobieranie nasienia odbywa się z szyjki kontenera, nie otwiera się go. Niewłaściwe stosowanie zalecanej techniki powoduje pogorszenie jakości.

Postać płynna azotu, zajmująca 1litr, odpowiada 10litrom postaci gazowej.

Rozrzedzalniki aktualnie używane do mrożenia nasienia buhaja:

• Rozcieńczalnik Tris do mrożenia nasienia buhaja w słomkach:

ROZTWÓR PODSTAWOWY: ILOŚĆ NA:

Tris (hydroksymetyl)- aminometan 36.05g. 1litr

Kwas cytrynowy 20.24g.

Fruktoza 14.88g.

Antybiotyki:

- Penicylina 1mln. j. m.

- Streptomycyna 1.48g.

- Linkospektyna 5cm³

Woda redestylowana 1litr

*oprócz ww. antybiotyków może być jakiś inny, działający na bakterie G+, G-, Mykoplazmy,

Leptospiry.

• Rozcieńczalnik I (pH 6.75):

OBJĘTOŚĆ W CM³. 200 300 400 500

Roztwór podstawowy 134.4 201.6 268.8 336.0

Woda redestylowana 25.6 38.4 51.2 64.0

Żółtko 40.0 60.0 80.0 100.0

* żółtko musi pochodzić z jaj z ferm o dokładnie przestrzeganej kontroli (zwłaszcza pod kątem

Salmonelli)

• Rozcieńczalnik II (pH 6.95):

Jego skład różni się od Rozcieńczalnika I tym, że zamiast odpowiedniej objętości wody

redestylowanej, dodaje się glicerol o tej samej objętości, co wodę.

Istnieją specjalne tabele, na podstawie których określa się, ile danego rozrzedzalnika należy dodać i ile powstanie porcji nasienia z otrzymanej od buhaja objętości ejakulatu o określonej koncentracji plemników.

Koncentracja plemników w ml. Objętość ejakulatu	Stwierdzona koncentracja	Stwierdzona koncentracja
Ilość ejakulatu pobrana od buhaja	A B C	A B C
Ilość ejakulatu pobrana od buhaja	A B C	A B C

A- ilość porcji nasienia

B- objętość rozrzedzalnika I

C- objętość rozrzedzalnika II

Przed zamrożeniem, wykonuje się wstępne rozrzedzenie nasienia z Rozrzedzalnikiem I w stosunku 1:1 i schładza się do +5ºC. Następnie wykonujemy rozrzedzenie ww. mieszaniny z Rozrzedzalnikiem II w stosunku 1:1. Po rozrzedzeniu, nasienie przetrzymujemy 4 - 6godz., żeby doszło do ekwilibracji. Tak przygotowane nasienie, możemy mrozić w kulkach lub w słomkach.

Azot techniczny, który jest używany do mrożenia, nie jest idealnie czysty, dlatego bezpośredni kontakt z zamrożonymi kulkami może powodować ich zanieczyszczenie. Podczas mrożenia nasienia w słomkach, nie ma takiego zagrożenia. To kolejna zaleta na korzyść słomek, jednak w ich przypadku też istnieje pewne zagrożenie- jeśli pobiera się próbki do kontenera z azotem w oborze, to czasami się zdarza, że po jego otwarciu krowa akurat macha sobie ogonem i do azotu może wpaść grudka kału. Takiej niespodzianki nie można usunąć, zostaje w środku i zamarza. Dopiero przy uzupełnianiu kontenera w azot, można spróbować to wyjąć.

Mrożenie w słomkach:

Słomki mają dużo więcej zalet w porównaniu z kulkami. Są wykonane z nietoksycznego materiału. W profesjonalnych stacjach pobierania nasienia stosuje się automaty, mające od 10 - 100 igieł, które wchodzą jednocześnie do odpowiedniej ilości słomek i aplikują do nich nasienie. Wcześniej, słomki przechodzą przez drukarkę, która umieszcza na nich datę produkcji, numer nasienia, numer identyfikacyjny buhaja i kod zakładu weterynaryjnego.

Słomka ma na końcu koreczek.

Napełnia się ją 0.2ml. nasienia i zgrzewa się wolny koniec. Zalepione słomki są umieszczane na paletach i wkładane do aparatu do zamrażania. Stopniowo następuje obniżanie palet i tym samym zmniejszanie temperatury w odpowiednim czasie.

Po wyjęciu słomek, umieszcza się je w łaźni wodnej na 20 - 30 sekund (zależy od producenta). Następnie dokładnie je wycieramy i przed włożeniem do pipety inseminacyjnej odcinamy zgrzew. Pistoletem wypychamy koreczek i nasienie.

↑

KNUR:

Nasienie knura konserwuje się w stanie płynnym lub mrożonym.

Mrożenie jest dość kłopotliwe i mało skuteczne, bo po rozmrożeniu pozostaje mało żywych plemników. Do tej pory nie znaleziono substancji, która by dobrze osłaniała nasienie knura. Z tego powodu preferowane jest nasienie w stanie płynnym. Skuteczność zapłodnień zależy od liczby plemników, typu rozrzedzalnika i jakości ejakulatu. U knura jest niska koncentracja i duża objętość ejakulatu, więc robi się małe rozrzedzenia (1:5).

Nasienie płynne:

Nasienie prawidłowo rozrzedzone i ochłodzone, zachowuje płodność do 3 dni, a przechowywane w aktualnie produkowanych rozrzedzalnikach- nawet do 5 dni.

Hiszpanie, przesyłają nasienie na duże odległości. Inseminator ma w domu rozrzedzalnik, a nasienie jest wysyłane pocztą na zamówienie. Jak dotrze na miejsce, jest rozrzedzane i gotowe do podania.

• Skład rozrzedzalnika Kiev i Anrohep:

SKŁADNIK KIEV ANDROHEP

Glukoza 60.0 26.0

Cytrynian sodu 3.7 8.0

Dwuwęglan sodu 1.2 1.2

EDTA (Na) 3.7 2.4

HEPES - 9.0

BSA - 2.5

mOsm 380 309

Nasienie rozrzedzone przy pomocy ww. rozrzedzalnika może być użyte bez istotnego obniżenia płodności do 4dni, przy przechowywaniu go w temperaturze +17ºC. Zawsze należy dodać do tego antybiotyk.

Lochom podaje się minimum 80 (100)ml. nasienia i w tej objętości musi być co najmniej 2mld. plemników.

Po ejakulacji, plemniki są bardzo wrażliwe na szok chłodowy, ubywa z nich potasu i magnezu, a wzrasta poziom sodu i wapnia. Przed szokiem zabezpiecza je m.in. dodatek żółtka, lipoprotein, lecytyny i seryny. Plemniki stają się mniej wrażliwe na szok wraz z ich dojrzewaniem w najądrzach. Z tego powodu muszą być używane plemniki w pełni dojrzałe.

Do podstawowych rozrzedzalników należy Tris, EDTA i wiele innych. Rozrzedzalniki zawierają cukry- glukozę, fruktozę lub laktozę, poza tym białka lub lipoproteiny, mleko, kazeinę, żółtko jaja kurzego, związki buforowe- Tris, cytrynian sodu i glicerol.

Mrożenie nasienia:

Z ejakulatu usuwa się warstwę galaretowatą i rozrzedza się wstępnie z EDTA.

Schłodzone do 15ºC nasienie należy wirować przez 10minut, przy przeciążeniu1900gram. Zlewamy płyn znad osadu i dodajemy rozrzedzalnik- laktoza 11%, żółtko- 20%. Oziębiamy do 5ºC przez 1.5godz. i ponownie rozrzedzamy (rozrzedzenie końcowe). Napełniamy słomki o pojemności 5ml. i zamrażamy przez 20minut.

Przeżywalność plemników po rozmrożeniu w słomkach o pojemności 0.5ml. jest większa niż przy pojemności 5ml, ponieważ w mniejszych słomkach jest bardziej równomierne zamrażanie.

OGIER:

Nasienie ogiera może być przechowywane w stanie płynnym lub zamrożonym.

Nasienie płynne:

Nasienie przechowywane w stanie płynnym musi zostać jak najszybciej rozrzedzone i może być od razu użyte do inseminacji lub może być przetrzymywane przez 2 - 3 dni.

Do krótkotrwałego przechowywania nasienia w temp. pokojowej służy rozrzedzalnik mlekowo-żółtkowy Chmielarskiego i Nowakowskiego.

Skład:

- 100ml mleka pasteryzowanego

- 70ml. żółtka jaja kurzego

Obecnie, do przechowywania nasienia w +4ºC jest używany rozcieńczalnik Keneya i współpracowników.

Skład:

- sproszkowane i odtłuszczone mleko krowie 2.4g

- 7.5% roztwór dwuwęglanu sodu 2ml.

- glukoza 4.9g.

- antybiotyk (gentamycyna) 50mg./ml 2ml.

- woda podwójnie destylowana 92ml.

Powstaje rozrzedzalnik o osmolarności 356miliOsm/kg i pH = 6.99.

Przygotowanie nasienia:

Po pobraniu nasienia, rozrzedza się je w stosunku 1:1 lub 1:3 (zależy to od koncentracji), tak aby dawka inseminacyjna zawierała co najmniej 300mln. plemników o ruchu postępowym. Tak przygotowane nasienie można przechowywać w temp. pokojowej kilka godzin, a w +4ºC przez 2 - 3 dni.

Nasienie mrożone:

Pełny ejakulat pobiera się na sztuczną pochwę zamkniętą, zagęszcza się go przez wirowanie i następnie rozrzedza. Nasienie mrozi się w ciekłym azocie i przechowuje w słomkach o pojemności 4ml. lub 0.5 - 1ml. Tak pobierane nasienie ma dużo bakterii saprofitycznych.

Lepszy sposób polega na pobieraniu frakcji bogatej w plemniki na pochwę otwartą (nasienie znajduje się w tubach aluminiowych). Ryzyko zanieczyszczenia drobnoustrojami jest minimalne.

Skład rozrzedzalnika (na 100ml):

- woda redestylowana 100ml.

- laktoza 6.6g.

- mannitol 2.1g.

- glukoza 0.7g.

- EDTA 0.15g.

- 35.7% roztwór cytrynianu sodu 5*H₂O 0.45ml.

- 4.2% roztwór kwaśnego węglanu sodu 0.35ml.

- żółtko jaja 2.5g.

- glicerol 3.5ml.

Nasienie odpowiednio się rozrzedza, w zależności od koncentracji- tak, żeby w jednej dawce było 300mln. plemników o ruchu prawidłowym.

Rozrzedzalnik Palmera:

- mleko UHT

- glukoza

- laktoza

Do inseminacji używa się 8 słomek, każda po 4ml.

PIES:

Jako rozrzedzalnika nasienia płynnego, używa się zwykle chudego mleka podgrzanego do temp. 92 - 94ºC przez 10minut i następnie schłodzonego. Może być też 2% homogenizowane mleko, cytrynian sodu 2.9% lub dodatek 80% żółtka jaja kurzego.

Do nasienia mrożonego jest używany Tris żółtkowy z 8% glicerolu i 20% żółtka. Najczęściej jednak używane są rozcieńczalniki komercyjne, których skład jest chroniony przez producenta. Nasienie mrozi się w słomkach lub kulkach.

Maksymalne przechowywanie nasienia w +4ºC wynosi 4 - 5 dni.

Nie rozrzedzony, schłodzony ejakulat można przechowywać do 21 godzin w temp. 5 - 10ºC.

Do transportu używa się nasienia rozrzedzonego i schłodzonego.

Rozrzedzone nasienie psa w stosunku 1:3 do 1:8 przechowuje się w +4ºC przez 4 - 5 dni.

KOT:

Świeżo pobrane nasienie jest bardzo wrażliwe na zmiany pH i temperatury. Gdy dostanie się do niego mocz, dochodzi do szybkiej i nieodwracalnej utraty żywotności.

Nie rozrzedzony ejakulat, przechowywany w 37ºC zachowuje ruchliwość przez 60 minut. Po obniżeniu temperatury do 23ºC, można wydłużyć czas przechowywania do 120 minut.

Świeżo pobrane nasienie zaleca się bezzwłocznie rozrzedzić do objętości 1ml. izotonicznym roztworem.

Do inseminacji używa się 0.1ml. nasienia. Liczba zapłodnionych komórek jajowych wzrasta po ponownej inseminacji wykonanej 24godz. po pierwszej inseminacji lub po podaniu HCG.

TRYK i KOZIOŁ:

Podobnie jak buhaj. Nie wystarczyło czasu na omówienie.

Ćwiczenie 11.

Ćwiczenia praktyczne.

Ćwiczenie 12.

Biotransfer zarodków.

Biotransfer zarodków obecnie jest stosowany tylko u bydła i do tego w niewielkim zakresie, ponieważ pozyskiwanie zarodków jest dość drogie, poza tym nie ma na to dotacji z państwa. Z tego powodu mrozi się mało zarodków i w rozrodzie częściej korzysta się z nasienia mrożonego lub świeżego. Zarodek jest bardzo drogi- koszt produkcji waha się w okolicy 1000zł. Gdyby była dotacja, cena wynosiłaby 200 - 250zł.

Chcąc wykonać biotransfer, należy zwrócić uwagę na dwie istotne rzeczy:

1. W jakim stanie jest gospodarstwo?

2. Jak żywione jest bydło? Dobre żywienie jest bardzo istotne!

Poza tym ważna jest:

1. Odpowiednia pora roku- najlepsza jest wiosna i jesień, bo inaczej może dojść do szoku termicznego zarodków.

2. Odpowiedni dobór dawczyń i biorczyń zarodków.

Dawczynie- najlepsze są dojrzałe jałówki (w wieku 24 miesięcy) lub pierwiastki; ewentualnie krowy po 2 - 3 wycieleniach. Takie dawczynie muszą mieć regularne cykle rujowe, prawidłowo funkcjonujący narząd rozrodczy i muszą być dobrze utrzymywane.

Biorczynie- najlepsze są jałówki, pierwiastki, ewentualnie krowy po 2 - 3 wycieleniach, mające zdrowe narządy rozrodcze i regularny cykl rujowy.

Zarówno dawczynie, jak i biorczynie nie mogą pochodzić z ciąży mnogiej.

Żeby wykonać biotransfer, potrzebny jest też dobry sprzęt oraz laboratorium do przeprowadzenia zabiegu. Niezbędny jest:

1. Mikroskop stereoskopowy do oglądania oocytów (koszt ok. 10tys. zł), dający powiększenie 40 - 100x. Taki mikroskop najczęściej jest adaptowany do aparatu lub kamery.

2. Dobre hormony (PMSG, HCG, folidon, GNRH) w postaci implantów lub wkładek dopochwowych w celu wywołania superowulacji.

3. Katetery do płukania zarodków o długości 60 - 100cm (średnio 65cm.) z balonikiem. Do nich jest dołączony zaciskacz i prowadnica.

Są różne typy kateterów- np. niemieckie, kanadyjskie. Są one dość drogie- ok. 1200zł za sztukę, która wystarcza na ok. 15 płukań.

4. Płytki do różnych stężeń rozcieńczalników i przenoszenia zarodków.

5. Filtr.

6. Płyteczki do płukania w glicerolu i przekładania zarodków.

7. Płytki bez dołeczków do wyszukiwania zarodków.

8. Sprzęt do ściągania nadmiaru płynu pobranego z macicy.

Ok. 15 - 30 minut po wypłukaniu macicy, zlewarowaniu płynu i umieszczeniu go w butelce o pojemności 0.5 litra, wkładamy tam kateter, ustawiamy podziałkę na 100ml. i ściągamy nadmiar płynu, tak że w butelce pozostaje 100ml. Tą objętość wylewamy na płytkę i szukamy w tym zarodków.

9. Specjalne strzykawki do aspiracji zarodków.

Gdy pod mikroskopem znajdziemy zarodek, wciągamy go tą strzykawką.

Zarodek wyizolowany, wypłukany i oceniony umieszczamy w słomkach, a następnie w specjalnym pistolecie do wprowadzania zarodków. To wszystko jest dodatkowo w specjalnej osłonce. Zarodki pobiera się od dawczyni 7 - 8 dni po owulacji. Wprowadzanie kateteru do macicy i płukanie nie jest zbyt przyjemne. Katetery są grube, mają dużą Ø. Zwykle kanał szyjki macicy jest wtedy zamknięty i należy użyć dilatatorów w celu jego rozluźnienia i rozszerzenia. Można też krowę znieczulić, np. nadoponowo lub podać ksylazynę albo środki uspokajające. Niektórzy przed pobraniem zarodka podają doszyjkowo estrogeny. Czasem u biorczyni też jest konieczne podanie dilatatorów.

10. Media jałowe, służące do płukania macicy. (zwykle używa się PBS + 20% surowica cielęca lub bydlęca). Za pomocą strzykawki wlewamy naraz 50 - 100ml. płynu do każdego rogu, płuczemy kilkakrotnie i lewarujemy zawartość. Zwykle wystarcza 0.5l płynu, żeby znaleźć zarodki.

Najczęściej wiemy, ile zarodków powinniśmy znaleźć. Możemy po prostu wcześniej policzyć ciałka żółte na jajniku (ew. pęcherzyki) i wtedy znamy ich przybliżoną ilość.

Wyizolowane zarodki ocenia się pod mikroskopem. Stopień ich rozwoju określa się jako bardzo dobry, dobry lub średni. Gdy komórki trofoblastu są rozrzucone lub ściana zarodka jest pomarszczona- zarodek należy wyeliminować.

Od jednej krowy, po superowulacji, możemy uzyskać 9 - 10 (do 12 zarodków). Z tego zwykle 5 - 6 jest dobrych i nadaje się do mrożenia, a reszta jest nieprawidłowo rozwinięta.

U jednej dawczyni 2x w roku można wywołać superowulacji.

Punkcję pęcherzyków jajnikowych można robić co 2 tygodnie (co cykl) i pobierać oocysty.

Zarodki pobiera się od dawczyni w 7 - 8 dniu po owulacji, a biorczyni podaje się je w czasie rui. Biorczynię należy zbadać, czy nie ma żadnych wypływów z dróg rodnych oraz na którym jajniku jest ciałko żółte okresowe. Przed umieszczeniem zarodka w macicy, należy go rozmrozić w odpowiedniej temperaturze (każdy stosuje inną- jedni 22ºC, inni 30ºC, a jeszcze inni 27ºC lub 38 - 39ºC).

Kraje dominujące w biotransferze, to: USA, Niemcy, Holandia, Australia, Kanada- rocznie izolują 150 tysięcy zarodków. W Polsce w latach 2002 - 2003 wypłukano ok. 25 sztuk krów.

Być może w przyszłość bardziej popularne stanie się używanie zarodków. Obecnie jednak największą rolę w rozrodzie odgrywa nasienie mrożone lub świeże.

42

---