Gałęzowska Agnieszka

Rybicka Emilia

Wieteska Anna

Wójcik Dominik

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

TEMAT: Enzymatyczna hydroliza tłuszczów

Wykonano: 29.11.2007r.

Oddano: 06.12.2007r.

I. WSTĘP TEORETYCZNY

Tłuszcze są mieszaniną estrów gliceryny i wyższych kwasów tłuszczów. Naturalne tłuszcze zawierają wyłącznie w swym składzie trójglicerydy. Obecność jedno i dwuglicerydów świadczy o częściowym zjełczeniu i zmydleniu tłuszczów. Wchodzące w skład tłuszczów trójglicerydy mogą być proste bądź mieszane. W pierwszym przypadku wszystkie trzy reszty kwasowe w cząsteczce tłuszczów są jednakowe, a w drugim dwie lub trzy różne, co pociąga za sobą możliwość występowania izomerów. Dla człowieka triacyloglicerole są głównym magazynem energii i podstawowym lipidem zawartym w pokarmie. Są nierozpuszczalne w wodzie, a głównym miejscem ich występowania są wyspecjalizowane komórki tłuszczowe (adipocyty).

Zanim tłuszcz zostanie w organizmie żywym poddany dalszemu rozkładowi, musi ulec hydrolizie do podstawowych składników, a więc w przypadku triacylogliceroli do glicerolu i trzech cząsteczek wyższych kwasów tłuszczowych. Hydroliza triacylogliceroli jest pierwszym etapem wykorzystania tłuszczu magazynowanego i zawartego w pokarmie jako źródło energii. Jest ona prowadzona przez lipazy. Enzymy te katalizują uwolnienie trzech kwasów tłuszczowych ze szkieletu glicerolowego. Kwasy tłuszczowe są następnie rozkładane na drodze β-oksydacji, czemu towarzyszy uwolnienie energii. Szkielet glicerolowy jest także wykorzystywany; ulega on przekształceniu w fosfodihydroksyaceton, który stanowi związek przejściowy glikolizy. Przekształcenie to wymaga dwóch enzymów: kinazy glicerolowej, która zużywając ATP katalizuje reakcje ufosforylowania glicerolu do L-3-fosfoglicerolu, i dehydrogenazy 3-fosforoglicerowej umożliwiającej powstawanie fosfodihydroksyacetonu.

Hydroliza tłuszczy zawartych w pokarmie prowadzi w jelicie lipaza trzustkowa, a uwolnione kwasy tłuszczowe są pobierane przez komórki jelitowe. Procesy trawienia i pobierania są wspomagane przez sole żółciowe o właściwościach przypominających detergent.

Lipoliza to proces rozkładu hydrolitycznego triacyloglicerolu w tkance tłuszczowej prowadzący do powstania kwasów tłuszczowych i glicerolu, które uwolnione do krwioobiegu, wychwytywane są przez większość tkanek (za wyjątkiem mózgu i erytrocytów) i estryfikowane do acylogliceroli lub utleniane jako główne źródło energetyczne do dwutlenku węgla i wody. Proces ten zachodzi dzięki obecności enzymów lipolitycznych - lipazy. Enzymy te należą do klas hydrolaz .

Lipazy są szeroko rozpowszechnione. Występują w soku żołądkowym, trzustkowym, jelitowym (enzymy trawienne) i we krwi, jak również w wielu roślinach, głównie nasionach oraz w różnych drobnoustrojach (grzyby nitkowe, bakterie, drożdże). Częściowa hydroliza jest pożądana w przemyśle spożywczym a szczególnie w mleczarskim. Lipazy stosuje się także w przemyśle skórzanym, jedwabniczym i wełnianym w celu usunięcia z surowca zanieczyszczenia, jakie stanowi tłuszcz. Lipazy są składnikami preparatów farmaceutycznych, proszków do prania, środków do oczyszczania ścieków.

Z obecnością lipaz w produktach spożywczych wiążą się często procesy niepożądane, zwane jełczeniem. Dotyczy to szczególnie przetworów zbożowych i tłuszczowych. Proces jełczenia jest rezultatem działania dwóch enzymów: lipazy i lipooksygenazy, katalizującej utlenienie uwolnionych przez lipazę kwasów tłuszczowych.

Jełczenia polega na tym, że tłuszcze pozostające przez dłuższy czas pod działaniem powietrza i światła ulegają rozkładowi. Szczególnie szybko jełczeją tłuszcze zawierające niższe, względnie silnie nienasycone kwasy. Jełczenie tłuszczów przypisuje się procesowi utleniania, a mianowicie tworzeniu nadtlenków w miejscach podwójnych wiązań. Nadtlenki ulegają rozpadowi z wydzieleniem aldehydów, ketonów, ketokwasów, oksokwasów itp. Procesowi jełczenia towarzyszy zwykle rozpad tłuszczów na wolne kwasy tłuszczowe i glicerynę. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych jest do pewnego stopnia miarą świeżości tłuszczu. Jełczenie tłuszczu powoduje powstanie nieprzyjemnego zapachu i smaku.

II. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Przygotowanie preparatu lipazy z trzustki.

Wykonanie: Tabletkę enzymatyczną Kreon zawiesiliśmy w 10 ml 0,1 M buforu o

pH 7. Po dokładnym wymieszaniu przesączyliśmy przez gazę. Filtrat stosowaliśmy w reakcji.

2. Przygotowanie emulsji oleju.

Wykonanie: 60 ml 2%-owego wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego wymieszaliśmy z 40 ml oleju kukurydzianego i homogenizowaliśmy 5 min. Uzyskaną emulsję w postaci białego mleczka stosowaliśmy jako substrat w reakcji.

3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji.

Wykonanie: Do trzech erlenmayerek o poj. 100ml wprowadziliśmy substancje uwzględniając podaną kolejność. Do dwóch erlenmayerek które stanowiły próby właściwe wprowadziliśmy:

1. 5 ml emulsji

2. 4 ml buforu

3. 1 ml enzymu lipazy

Po 30 minutach (pierwsza próba) i po 60 minutach (druga próba) inkubacji w temperaturze 37˚C dodaliśmy po 10 ml etanolu.

Do trzeciej erlenmayerki która stanowiła próbę kontrolną wprowadziliśmy:

1. 5 ml emulsji

2. 4 ml buforu

3. 10 ml etanolu

4. 1 ml enzymu lipazy

Tak przygotowane mieszaniny miareczkowaliśmy 0,05 M NaOH wobec fenoloftaleiny

(2-3 krople) do różowego zabarwienia. Uzyskane wyniki zestawiliśmy w tabeli.

Tabela nr 1. Zestawienie wyników.

Substrat	Próba kontrolna[ml]	V30' [ml]	V60' [ml]	V30' [ml]	V60' [ml]
Olej rzepakowy	7,5	8,65	9,65	1,15	2,15
Olej kukurydziany	8,6	10,5	11,0	1,9	2,4
Olej ryżowy	6,65	9,05	10,3	2,4	3,65
Oliwa z oliwek	5,6	6,35	6,95	0,75	1,35

Obliczenia:

I. Obliczenie aktywności badanego preparatu wg. wzoru:

gdzie:

A_L - aktywność lipazy

A - objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby właściwej (ml)

A₀ - objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby kontrolnej(ml)

n - ilość preparatu lipazy w ml w mieszaninie reakcyjnej

50 - współczynnik pozwalający przeliczyć cm³ 0,05 M NaOH na μmole kwasu tłuszczowego

t - czas w minutach

• Olej rzepakowy

• Olej kukurydziany

• Olej ryżowy

• Oliwa z oliwek

Tabela nr 2. Zestawienie obliczeń.

Substrat	AL30'	AL60'
Olej rzepakowy	19,17	17,92
Olej kukurydziany	31,67	20
Olej ryżowy	40	30,42
Oliwa z oliwek	12,50	11,25

II. Wykres zależności
V=f(t) dla oleju kukurydzianego

V[ml]

Wnioski: Na podstawie obliczonych aktywności lipazy zauważyliśmy, że po 30 min. inkubacji wytworzyło się więcej kwasów tłuszczonych niż po upływie 60 min. Ilość otrzymanych kwasów tłuszczowych nie podwoiła się. Nie wydzieliło się 2-krotnie więcej produktu w tym samym czasie w warunkach stacjonarnych. Następuje grupowanie się produktów (kwasów tłuszczowych) na powierzchni rozdziału faz. Blokują one dostęp do powierzchni substratu, obniżają pH, które jest mniej korzystne dla działania lipazy.

Wykres zależności
V=f(t) nie jest linia prostą. Aktywność lipazy nie jest wprost proporcjonalna do czasu reakcji. Następuje hamowanie reakcji.

Olejem najlepiej rozkładanym przez lipazę trzustkową jest olej ryżowy. Aktywność lipazy po 30 minutach inkubacji wynosi 40
. Natomiast aktywność lipazy po 30 minutach hydrolizy estrów gliceryny i wyższych kwasów tłuszczowych jest najmniejsza w przypadku oliwy z oliwek i wynosi 12,50
.

4. Oznaczenie w preparacie otrzymanym z tabletki Kreon zawartych enzymów A) α-amylazy i B) proteinazy

Wykonanie:

A) Do dwóch probówek wprowadziliśmy po 5 ml 1% skrobi, następnie do pierwszej probówki (próba właściwa) wprowadziliśmy 2-3 krople preparatu enzymatycznego , do drugiej probówki (próba kontrolna) wprowadziliśmy 2-3 krople wody. Próbny pozostawiliśmy w temp. pokojowej na 30 min. Po tym czasie do obu probówek dodaliśmy po kilka kropel roztworu J₂ w KJ.

Obserwacje: W próbie z wodą pojawiło się ciemnoniebieskie zabarwienie. Natomiast w próbie z preparatem enzymatycznym(α-amylaza) nastąpiło odbarwienie i pojawiła się barwa czerwono-brunatna.

Wnioski: Zawarta w preparacie otrzymanym z tabletki Kreon α-amylaza rozkłada wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, powodując stopniowe rozszczepienie łańcuchów skrobi na krótsze fragmenty, zwane dekstrynami. Przebieg tego etapu degradacji skrobi można śledzić dzięki barwnej reakcji zarówno nierozłożonej skrobi, jak i dłuższych dekstryn z roztworem jodu w jodku potasu. W próbie w której znajdowała się woda skrobia nie uległa rozkładowi i pojawiła się barwa ciemnoniebieska. Natomiast w próbie z α-amylazą nastąpiła częściowa hydroliza skrobi, powstały krótkie dekstryny które zabarwiły się na kolor czerwono-brunatny.

B) Do dwóch probówek wprowadziliśmy po 2 ml 2% kazeiny, następnie do pierwszej probówki (próba właściwa) wprowadziliśmy 1 ml preparatu enzymatycznego, do drugiej probówki (próba kontrolna) wprowadziliśmy 1 ml wody . Próby pozostawiliśmy w temp. pokojowej na 30 min. Po tym czasie do probówek dodaliśmy po 4 ml 5% TCA.

Obserwacje: W próbie z enzymem wytrąciło się białko w postaci pylistego, drobnego osadu. W próbie z wodą wytrąciła się duża ilość białka w postaci serowatej.

Wnioski: W preparacie otrzymanym z tabletki Kreon znajdują się enzymy m.in. proteinazy(enzymy proteolityczne), które hydrolizują biało mleka-kazeinę. Reakcja przebiega wolno. Wynik reakcji sprawdzamy stosując reakcję strąceniową za pomocą kwasu trój chlorooctowego. Reakcja ta jest bardzo czuła z tym kwasem. W próbie z enzymem część białka ulega hydrolizie. Wytrąca się białko niezhydrolizowane (niestrawione) i jest go mniej w porównaniu z próbą z wodą. W próbie w której nie ma enzymu osad białka wytrącił się w postaci serowatej. Reakcja ta służy do oznaczania strąceniowego białka.

Tabletki Kreonu zawierające lipazy, α-amylazy i proteinazy stosujemy przy niestrawności. Usprawniają one działanie trzustki.

Wykres zależności ΔV=f(t)

---