Metoda kometowa

Metoda opiera się na ocenie stopnia degradacji DNA. Podczas apoptozy komórkowe DNA jest degradowane przez endonukleazę aktywowaną przez kaspazy (proteazy cysteinowe biorące udział w przebiegu apoptozy). DNA jest hydrolizowane preferencyjnie w miejscach pomiędzy nukleosomami. Skutkuje to powstaniem fragmentów o długości 180 par zasad lub ich wielokrotności (360, 560, 720 itd). Dowiedziono, że ilość powstających fragmentów DNA jest dla komórki apoptotycznej wyższa niż dla komórki nekrotycznej. Test kometkowy umożliwia odróżnienie dwóch typów śmierci komórek właśnie na tej podstawie.

Eksperyment ten wykonuje się następująco: komórki miesza się z agarozą i nanosi na szkiełko mikroskopowe. Następnie traktuje się komórki buforem lizującym w celu przerwania ciągłości błony komórkowej. Po przyłożeniu napięcia pofragmentowane DNA opuszcza komórkę i migruje w żelu w kierunku anody. Po zakończeniu elektroforezy DNA wybarwia się w celu uwidocznienia DNA (najczęściej bromkiem etydyny). DNA, które opuściło komórkę, tworzy wzór podobny do ogona komety. DNA pozostałe w komórce wygląda jak głowa komety; stąd pochodzi nazwa metody. Jeśli nie doszło do pęknięć lub cięcia DNA wówczas obserwuje się świecenie tylko w obrębie komórki (głowa komety). Nie pocięte DNA jest bowiem zbyt duże, aby pod wpływem pola elektrycznego opuścić komórkę i pozostaje uwięzione w strukturach komórkowych. Komórki nekrotyczne także dają fluoryzujący ogon, jednak precyzyjny pomiar parametrów opisujących intensywność świecenia ogona pozwala na odróżnienie ich od komórek apoptotycznych. Metoda jest dość pracochłonna, ale po wystandaryzowaniu i precyzyjnym wykonaniu daje powtarzalne rezultaty.

---