STRONY 112-122

Inne zastosowania wektorów YAC:

Mogą posluzyc badaniom nad segreacja chormosomów w trkacie mejozy, jednak ich podstaowe zastooswanie dotyczy klonowanai bardzo dlugich fragmentów, które nie mieszcza się w wektorach E. Coli. Wiekszosc genów ssaczych, przekracza 100 kb, przez co jedynym sposobem ich klonowania jest umieszczanie w sztucznych chromosomach. YAC otwiera zartem droge od badania ekspresji tych genóe, co blyo wczensiej niemożliwe z zastosowaniem innych wektorów. Nowy wymiar tych eksperymentach zostal niedawno odkryty, kiedy okazlao się ze YACi mogą być właczane w normalny genom ssaczy i rezydowac w nich jak macierzyste geny.

YAC maj olbrzymi kwlad w produkcje bibliotek genomoych, o których była mowa wczesniej, umozliwiajac wkladanie insertów do 600 kb, romziar takiej biblioteki dla clzoweika ogranicza się do zaledwie 6500 klonów. Niestety takie mega-klony są często niestabilne, i dochodzi w nich do spontanicznych rearanzacji. Niemniej jednak YAC jest przykladem wektora który wnisol wiele w badania sekwencjowania DNA na wielka skalę.

Wektory dla innych drożdzy oraz grzybów

Episomalne plazmidy oparte na plazmidzie 2 µm, mogą być wektorami dla innych drożdży ale ich znaczenei jest nieporownywalnie mniejsze niż u s.cerevisiae. Wymaganai biotechnoloczne boiwem są takie aby wektor dlugo znajdowal się w bioreaktorze i był stabilny w genomie gospodarza, stąd w innych niż drozdze organizmamch pozadanym wektorami są głownie YIpy. Mogą one występować u m.in. Pichia pastoris, Kluveromyces lactis, oraz grzybów niktowatych takich jak Aspergillus nidulans i Neurospora crassa.

7.2 Wektory dla wyzszych roślin

Wektory dla roślin zostały odkryte w latach 80. i doporowadizly do stworzenia genetycznie modyfikowanych upraw(GM). Popatrzmy na ot jakei wektory się temu przyczyniły, natomiast cechy takich mutantów będziemy omawiac w rozdziale 15. Trzy typt wektorow są używane w przypadku roślin:

• Wektory oparte na naturalnym plazmidize wystepujacym w agrobacterium

• Bezpośredni transfer genów z użyciem plazmidowego DNA

• Wektory bazujące na wirusach roslinnych

Agrobacterium tumefaciens - najmniejszy an swiecie inzynier genetyczny

Chociaz nie znamy zadnych istniejacych plazmidow roslinnych, istnieje jedne plazmid bakteryjny majacy niesamowitą rolę - plazmid Ti z agrobacterium tumefaciens. Jest to mikroorganizm , który wywołuje u rolsin chorobę guzowatą, wnikajac w jej uszkodozne wezły w miejscach jej obtarcia lub zranienia.. Po infekcji tą bakterii u roslin zaczynaja pojawiac się nowtwoowe narośla i guzy. Są one spowodane obecnościa w bakterii plazmidu Ti. Jest to duzy plazmid , który zawiera duza ilość genów inicjujcych i prowadzących proces infekcji. Co jest dla nas najwazniejsze czesc jego genomu ma zdolnosc do wlaczania się w genom rosliny. Ten segment zwany T-DNA doskonale integruje się z chormosomami rosliny, jest krotki 15-30 kb i zaiwera około 8 genów odpowiedizalnych za zaminy rakowe w roślinie. Fragment ten jest stabilny w roślinie i jego skewencja jest przekazywana komorkom potomnym. Zawiera on również geny, które są wykorzsytywane przez rosline do pordukcji pozywienia dla bakterii. Można zatem powieidzec ze po infekcji a. tumefaciens całkowicie kontroluje roslinę.

Choroba guzowata:

Szybko zdano osbie sprawę że Ti może być wykorzsytany do przenoszenia insertów do rośliny. Jedyne co blyo potrzebne to wprowadzić insert do fragmentu T-DNA i pozowlic na jego dlaszą propagację w roślinie. W praktyce jest to uciazliwa psrawa, gdyż manipulacja plazmidem Ti ze względu na jego duze orzmiary jest utrtudniona, a do tego odchodzi problem ze w tka duzym genomie ciezko będzie znalezc unikalne i jedyne miejsce restrykcyjne, akurat tam gdzie będziemy chcieli wprowadzic nasz insert. Dlatego przyjeto pewne strategie postepowania z plazmidem Ti.

-strategia wektora binarnego, opiera się na obserwacji że T-DNA nie musi być fizycznie zwiazana z resztą plazmidu Ti. Dwupalzmidowy system wykorzystujacy T-DNA jako mała cząsteczkę i reszte plazmidu, jest dosc efektywny w wiekszosci transformowanych roslin. Plazmid T-DNA jest wystarczajaco maly aby mieć unikalne miejsca restrykcyjne i być dobrze manipulowany

-strategia konitegracji, poelga na tym ze uzywany jest nwoy plazmid, oparty na wektorach E. Coli, który nosi w osbie male porcje T-DNA. Homologia pomeidzy nowym plazmidem a plazmidem Ti polega na tym ze w komorce rekombinacja miedzy tmyi dowma pozwlaa zintegorwac plazmid E. Coli z T-DNA. Gen jest wstawiany w plazmid E. Coli, wprowadzany jest ten plazmid do komórek rolsin zainfekowanych przez tumefaciens i naturalne procesy rekombinacji powoduja ze nasz insert właczany jest w chormosom rosliny.

Plazmid Ti i jego integracja z rosliną:

Strategia wektora binarnego:

Strategia kointegracji:

Produkcja transformantów:

Normalny prcoes infekcji powoduje ze bakteria wnika w rany w orslinie i tma się namnazja dzięki plazmidowi Ti, co oznacza ze caly material z plazmidów jest skupiony w jednym tylko miejscu - guzie nowotworowym, co stanowi mlą atrakcje dla biotechnologów. Chcialoby się aby material wprowadozny przez nas wp ostaci insertu dzięki ktorejs z wymienionych wyżej strategii znajdowąła się w cąłej roslinie , w każdej jej komórce.

Istnieje kilka roziwazan tego problemu, jednym z nich jest infekowanie nie dorosłej rosliny, lecz jej protoplastów w płynnym medium. Selekcja tranformantów na tmy etpaie może być prowadozan jak z bakteriami, np. po wysianiu na podloze slekcyjne. Roslina nastepnie odtwarza się z protoplastów i jej odrosla forma zawiera w claosci material genetyczny wprowadozny przez nas z plamidem Ti. Jednak konieczne jest rozborjenie wektora Ti, tak aby nie zniszczył naszych protoplastów, gdyż jak wiemy ma on włąsciwosci raktowórcze i mołgby zabic rosline zanim by dojrzała. Jest ono molziwe ponieważ chorobowe geny nie są potrzebne do procesu samej infekcji, co oznacza ze mogą być usniete nie powodujac niemoznosci wniknieca bakterii do protoplastów. Zatem można usunac cąłe rakowe DNA nie przeszkadzjac procesowi samej transformacji. Po rozbrojeniu Ti możemy użyć typowego wektora binarnego jak pBIN19, zawiera on wspomniane T-DNA, lac Z'z unikalnymi miejscami restrykcyjnymi oraz gen odpornosci na kanamycyne, który zaczyna funkcjonowac dopiero po integracji z chromosomem rosliny. Tak jak wektory transferowe drożdży najpierw inserty wprowadzane i slekcjonujemy rekombiannty korzsytajac z E. Coli, a dopiero potem przechodzimy do infekcji rolsiny. Transformowane rosliny są slekecjonowane na podlozu z kanamycyną.

Transformacja plazmidem Ti:

Wektor pBIN19:

Po latach rozwoju tej galezi genetyki odkryto plazmid Ri. Ri i Ti są plazmidami bardo podobnymi, z tą różnicą że Ri ma innego typu właściwości kancerogenne, mianowiciep owoduje chorobę korzeni wlosowatych.

Ograniczenia w uzywaniu tych plazmidów:

Rosliny wyuzsze dzelimy na dwie kategorie dwulisciennych i jednolisciennych. Istnieje kilka czynnikow powodujacych ze orsliny dwulisicenne są bardziej podatne na klonowanie, np. ziemniaki, pomidory, groszek, fasola niż dwuliscienne. Jest to frustrujace dla naukowocw, gdyż wlasnie jednoliscienne maja szersze zastooswania w srodowisku i staja się celami wielu problemow badawczych, np. ryz, pszenica, jeczmien i to one są roslinami najczesciej uprawianymi na swiecie.

Podstawowa trudnosc polega na zasiegu dzialan agrobacterium tumefaciens które atakuje głownie rolsiny dwuliscienne. Jednolisicienen są praktycznie clakowicie odprone na transformacje plazmidami Ti i Ri. Transformacja z tymi wketorami polega regenracji rosliny z protoplastów, i tutaj również znacznie bardziej opieraja się temu procederowi rosliny jednoliscienne. Ostatnim ratunkiem jest uzycie bilostyki, czyli bombardowanai komórek, wektoreami wp ostaci granulek otoczonych metalem. Choc wydaje się to brutlane, jednak nie niszczy embrionlanych komórek i struktur i roslina może się roziwjac dlaej. Ta technika znalazla sukcesy w postpeowaniu z wieloma jednolisciennymi jak np. kukurydza.

BEZPOŚREDNI TRANSFER GENÓW

Omowiismy zatem już jeden ze spsobów wprowadzania genów do roslin jakim było uzycie plazmidów z a.tumefaciens. Inne podejscie przedstawia taktyka bezposredniego transferu genów.

Pierwsze obserwacje naturlanie wystpeujacego transferu genów nastpaily w roku 1984. Wtedy to zobaczono ze superskrecony plazmid bakteryjny, choc nie mzoe się replikowac w roslinie, to jednak potrafi rekombniowac z chromsooami roslinnymi. Chocaiz jest to proces lsabo poznany, nie ulega watpliwosci ze nastepuje czesciowa integracja plazmidowego DNA z roslinnym, mimo ze plazmidy nie wykazuja zadnego podobienstwa w skewencji do chormosomów roslin. Wynika z tego ze proces ten nastepuje losowo w róznych pozycjach róznych chromosomów.

Transfer genów może zatem obejmowac plazmid, który my przygotujemy a zatem wektor z insertem i genami markerowymi. Nic zatem nie stlao na przeszkdozie aby za pmoocą biolistyki lub innych technik zaczac wprowadzac tak material genetyczny do roslin, jedna z metod uzywala zawieosznych protoplastów w roztowrze z glikolem polietylenowym, aby wytracic DNA plazmidowe na powierzchnie protplastu aby ulatwic mu wnikniecie. Uzywana była czasami również elektroporacja. Po wniknieciu protoplastyp ozostawiono na kilka dni, w roztowrze aby zregenerowaly się ich sciany kmoorkowe i pozwolon na odtowrzenie się z nich pełnych roslin, które selekcjonowano na podlozu z antybiotykiem(np. kanamycyną).

Bezposredni transfer genów:

Transfer z uzyciem wytracania:

Transfer genów do chloroplastów:

Jeśli użyjemy biolistyki, niektóre wystrzelone cząsteczki mogą spenertrowac genom chloroplastów. Chloroplasty to organella posiadajace wlasny, niezlaezny od jadrowego genom, mogące dzielic się niezaleznie od podziałów komórki. W pewnych oklicznosciach wektory mogą zintegorwac się z genomem chloroplastów. Ta integracja w przeciwienstwie od integracji z jadrowym DNA nie jest przyadkowa, i odtyczy homologicznego regionu o którego obecnosc trzeba zadbac w plazmidize. Miedzy ten homologiczny fragment(min. 500 bp) musimy wstaiwac nasze DNA , które chcemy wprowadzic i reszte zalatwi natura. Czasami transfer jest indukowany przez dodanie PEG.

W komorce zwykle znajduje się 10 chloroplastów, i zazwyczaj efketywnosc transformacji wynosi jeden chloroplast, stad aby poznać który z nich został stransformowany plazmid musi zaiwerac dobrze dobrany gen markerowy(np. odpornosci na kanamycyne), tak aby można blyo przperowadzic selekcje. Transformacja chloroplastowa jest zatem trudną metodą, lecz oczkeiwane rezultaty mogą być zadziwiajce gdyż ekspresja genomu chloroplastowego jest znacznie szybsza i obfitsza niż genomu jadrowego, co szczególnie zadowlaa biotechnolgów obserwujacych produkt bialkowy. Dobre rezultaty w transformacji chloroplastów uzyskano jak na razie z tytoniem.

Próby użycia wirusów jako wektorów:

CZy skor można fagi λ i M13 uzywac jako wektory, to czy rownie odbrze w tej roli sprawia się wirusy? Jeśli tak bylaby to znakomita informacja dla swiata badaczy, gdyż transformacja wirusowa moglabyp oelgac na doslownym „podaniu DNA na powierzchnie liscia”. Reszte zalatwilby naturlany proces infekcji wirusa. Potencjał wirusów rolsinnych, choc ogromny i badany od dawna jak dotąd nie przyniósł wielkich sukcesów. Głownym problemem jest to wiekszosc wirusow jako materialu uzywa RNA a nie DNA, co utrudnia sprawe bo RNA jest trudne do manipulacji. Jedyne DNA wirusy, które się nadają to geminiwirusy i kaulimowirusy ale żaden nie jest idealny.

Kaulimowirusy:

Chociaz pierwsze wyniki badan z nimi były obiecujace istnieja jednak dwiep odstaowe trudnosci w uzyciu tych wirusów. Pierwsza polega na ograncoznym miejscu do wporwadzanai insertu, nawet po wycięciu części genów wirusa. Problem ten czesciowo rozwiazano stosujac strategie taka jak u fagemidów, mianowicie wektor wirusowy CaMV jest odstarczany w formie pozbawionej wiekoszosci genów, a do mieszaniny dolacza się cale cząsteczki wirusów, aby to one zajely się procesem budowy nowych wirusów. Wektor zawiera insert, reszta dostarczonych wirusow buduje inne wirusy, w które wbudowywany jest CaMV. Nie roziwaze to jednak drugiego problemu jakim jest ekstremalnie mały zakres gospodarzy dla tych wirusów. Walsciwie tylko kilka orslin poddaje się ich infekcji, tkaich jak kalafior czy kapusta. Kaulimowirusy przydaja się bardziej jako dostarczyciele silnych pormotorów od innych badań z użyciem tradycyjnych wektorów.

Geminiwirusy:

Wydaja się być szczególnie ciekawe, gdyż ich nosicielami mogą być pszenica lub kukurydza. Jednak wnoszą one swoje trudności do procesu klonowania. Jeden jest taki żep odczas cyklu infekcji genom geminiwirusa ulega czestym rearanzacjom, co może w oczywisty spsoob zmienic jego skewencje i tym samym sekwencje wprowadzanego w nim insertu. Zastanawiano się jak nie zaprzepescic potencjału jaki niosą i wymyślono technikę VIGS, czyli wirusowego wyciszania genu. Technika ta bada funkcje pojedynczych genów roslinnych. Ta metoda uszkadza jeden z systemow obronnych rosliny przed wirusem , ktoryp olega na umiejstnosci do degradacji określonego mRNA wirusa. VIGS pozwla an to aby razme z uzytym DNA wirusa, było degradowane komplemnetarne do niego mRNA rosliny, które zaiera okrelsony gen, który cchemy wyciszyc. Po takiej degrdacji gen kdowany przez zniszczone mRNA nie jest dluzej aktywny, a badacze mogą zaobserowqac zmiany jakie to wyciszenie wywołało w roslinie i na tej podstawie okreslic funkcje badanego genu.

VIGS:

7.3 Wektory dla zwierząt

Duzy wysilek jest wkladany w tworzenei wketorow dla zwierzecych komórek. Jednym z ich zasotoswoan jest produkcja zrekombniowanych białek, które nie są geenrowane prawidlowo w E. Coli, innym terapia genowa, umozliwiajaca wprowadzenei konkretnego genu choremu pacjentowi. Kliniczny apsekt decyduje o duzym wkladzie w badania nad ssakami, lecz dobre rezultaty otrzymuje się z owadów. Klinowanie owadów jest ciekawe z tego pwoodu ze wykorzystuje zupełnie nowy typ wektora z którym do tej pory się nie spotkalismy.

Wektory owadzie:

Muszka owocowa, drosophila melanogaster, pozostaje jednym z najbardizej znanych organizmów modelowych. Już w 1910 Thomas Morgan odkrył jej potencjał i wykorzystał badania nad nią do opracowania technik mapowania genetycznego. Dodatkwo odkrycie ze homeotyczne geny muszki, odpowiadaja w dziaalniu niektórym genom ssaczym spowodowlao ze muszka jest nawet uzywana jako baza do modleingu genetycznego rozowju człowieka. Niezwyklym wydarzeniem było zatem stworzenie wektorów klonujacych geny do muszki.

Nie odkryto zadnych plazmidów w muszce owocowej, wykluczono również mozliwosc infekcji wirusami, co spowdowalo ze odtychczasowe wektory były bezuzyteczne. Zamiast nich uzyto po razp ierwszy ruchomy elemnet genetyczny jakim był transpozon. Został on nazwany elementem P. Transpozony są krotkimi kawlakami DNA, nie przekraczjacymi 10 kb, która mogą się swobodnie przemieszczac miedzy chormosomami w komorce. Elemnet P, jest nawet krotszy ma 2.9 kb, i zaiwera w osbie gen kodujacy transpozazę, enzym który katalizuje przemieszczenie elemnetu miedzy chormosomami. Na jego koncach znajduja się odwrocone powtorzone skewencje, które pozwalają transpozazie wykryc konce transpozonu i go przeniesc. Elemnt P może przenosic się zarówno w obrebie chromosomu, miedzy dwoma rożnymi chromosomami, jak i pomiedzy plazmidem go zawierajacym a chromosomem owada. Tą ostatnia wlasciwosc jest klucozwa dla klonowania muszki. Wektor jest plazmidem która nosi w sobie dwa elemnety P, jeden z nich zawiera nasz insert, a drugi zawiera kopie elementu P bez insertu. Po co ona jest? Otóż jeśli wprowadzimy insert, wówczas uszkodzi on nasz gen transpozoazy i transpozycja nie będzie możliwa, drugi elelmnet P zawiera nietkniety gen transpozazy, dzięki czemu jest możliwa poprawna produkcja tego enzymu. Dobrze by było aby ten drugi element P z plazmidu, nie był przenosozny, i aby transpozycji ulegał tylko pierwszy transpozon z naszym insertem. Daltego drugi elemnet P nie zaiwra odworocnych powtórzeń na końcach co nazywane jest fachowo „obcieceim skrzydeł”. Transpozoaza nie rozpoznaje go jako elementu P i nie przenosi go. Przenosozny jest tylko element P z naszym insertem. Sam plazmid jest wprowadzany do jadra komórki poprzez mikroiniekcję. Efektem koncowym jest transpozycja naszego elelmnetu P z insertem z plazmidu na chromosom muszki, gdzie wystepuje już do konca jej zycia. Jeśli wstrzykniemy nasz plazmid do jadra komórki zarodkowej mamy pewnosc ze kopie naszego elementu P, będą we wszystkich komorkach muszki owocowej.

Klonowanie z użyciem elemnetu P:

Chociaz jak wspominalismy wirusy nie nadaja się do klonowania w owadach, to jeden z nich - bakulowirus, uzywany jest do produkcji zrekombinowanych białek z owadów. Wrócimy do niego w rozdziale 13.

---