01 2

między elektrodami wynosiło 1-5 V/cm. Prowadzić elektroforezę, aż barwnik buforu obciążającego (błękit bromofenolowy lub cyjanian ksylenu) osiągnie wymagane położenie.

7. Odłączyć elektrody od źródła prądu; w przypadku dodania bromku etydyny oglądać żel w świetle UV, zaś żel nie zawierający bromku barwić przez moczenie go w roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5 fig/ml przez 30-45 minut, płukać w wodzie i oglądać w świetle UV.

Uwagi:

1)    Należy używać jednej porcji buforu elektroforctycznego do sporządzania żelu i do napełniania zbiornika do elektroforezy — niewielkie różnice w sile jonowej lub pil wpływają na ruchliwość elektroforetyczną DNA.

2)    Ogrzewanie agarozy (etap 2.) należy zakończyć natychmiast po jej rozpuszczeniu.

3)    Bromek etydyny jest silnym mutagenem i wymaga postępowania dekontamina-cyjnego opisanego w ćw. 10.34.

4)    W przypadku stosowania żeli o małym stężeniu agarozy (<0,5%) przed jej wylaniem na płytkę należy utworzyć cienką warstwę z agarozy o stężeniu 1%, a dopiero potem wylać agarozę o małym stężeniu. Zmniejsza to szansę uszkodzenia żelu podczas postępowania po elektroforezie. Żele o małym stężeniu agarozy podczas polimeryzacji powinno się schłodzić do temp. 4³C, a elektroforezę przeprowadzać w chłodni.

5)    Najmniejsza ilość DNA, którą można wprowadzić do studzienki o szerokości 0,5 cm, by umożliwić detekcję z użyciem bromku etydyny, wynosi 2 ng; gdy ilość DNA przekracza 500 ng na ścieżkę, obraz staje się nieczytelny z powodu rozmazania. Badając populację DNA o jednorodnej długości (plazmidy, bakteriofagi) należy wprowadzać 100 500 ng DNA na ścieżkę o szerokości 0,5 cm; gdy populacja DNA jest niejednorodna, tak jak u Eukaryota, możliwe jest wprowadzenie 20 30 pg bez straty rozdzielczości otrzymanego obrazu.

6)    Światło UV jest szkodliwe dla wzroku; do oglądania żelu barwionego bromkiem etydyny należy zakładać okulary ochronne.

7)    Po barwieniu bromkiem etydyny na ogół nie jest konieczne wypłukiwanie niezwią-zanego barwnika, jednakże aby wykryć małe ilości DNA (< 10 ng), wskazane jest moczenie żelu po barwieniu przez 20 min w wodzie lub lepiej w 1 mM roztworze MgS0₄.

8)    Barwiąc żel bromkiem etydyny przed elektroforezą, należy pamiętać, że obecność lego barwnika zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną liniowego DNA o ok. 15%.

Ćwiczenie 10.38. Elektroforeza w żelu agarozowym w warunkach denaturujących (M.W. McDonell i wsp. 1977: J. Moi Biol., 110:119-127)

Zasada: Elektroforezę w warunkach denaturujących stosuje się do analizy jedno-niciowego DNA. W szczególności metoda ta może służyć do badania: 1) rozmiaru nici cDNA hybryd DNA:RNA opornych na działanie nukleazy SI, 2) wielkości pierwszej i drugiej nici cDNA syntetyzowanych przez odwrotną transkryptazę i

3) aktywności wprowadzania pęknięć jednoniciowych przez enzymy stosowane w biologii molekularnej.

441