0 1

Elektroforeza w polu pulsacyjnym. Podczas elektroforezy w żelu agarozowym wszystkie liniowe cząsteczki dwuniciowego DNA o długości większej od pewnej wartości granicznej — migrują przez żel z tą samą szybkością. Wartość graniczną determinuje wzajemna relacja między parametrami struktury DNA i wielkością porów' żelu. W takiej sytuacji nie nastąpi rozdział DNA względem jego masy. Im większe są pory żelu, tym większe cząsteczki DNA można poddać analizie; do rozdzielania fragmentów DNA o długości do 750 kpz nadaje się agaroza o małym stężeniu (ok. 0.1%), jednak sporządzanie i wykonywanie operacji na takich żelach jest niezwykle trudne. Skoro DNA w chromosomach niższych cukariotów może mieć długość 7000 kpz lub więcej, ograniczenie elektroforezy w stałym polu jest oczywiste.

Rozwiązaniem tego problemu było zastosowanie elektroforezy w polu pulsującym (Schwartz i Cantor 1984). W metodzie tej zastosowano zmienne, pulsujące, wzajemnie prostopadłe pola elektryczne, które w późniejszych wersjach techniki mogą być także zorientowane względem siebie pod kątami różnymi od prostego. Cząsteczki DNA znajdujące się w żelu, do którego przyłożono takie pole, potrzebują czasu, by zmienić ułożenie na zgodne z orientacją pola. Czas ten jest tym dłuższy, im większa jest masa cząsteczki. Cząsteczki DNA, których okres reorientacji jest dłuższy niż. trwanie impulsu elektrycznego, będą rozdzielane według masy. Granica rozdzielczości elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym zależy od wielu czynników, m.in. od stopnia jednorodności stosowanych pól, trwania impulsu i stosunku czasów jednego impulsu do drugiego, kąta między wektorami natężenia pól i ich względnych wartości. W czasie elektroforezy w polu inwersyjnym, FIGĘ (field inversion gel electrophoresis), wektor natężenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu dodatniego do ujemnego standardowo wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natężenia pola obydwu impulsów są równe, jednakże wielkości ic mogą być dobierane zależnie od analizowanego problemu. Zakres rozdzielczości tej metody <20—2(XK) kpz) przewyższa ok. 100-krotnie zakres konwencjonalnej elektroforezy. Badania ultrastrukturalne wykazały, że podczas FIGĘ łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natężenia pola elektrycznego na przeciwny.

Ćwiczenie 10.43. Elektroforeza w polu pulsacyjnym (J. Sambrook i wsp. I989: Molecular cloning. A aboratory manuał. Book 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 6.50-6.54)

Zasada: Sposób przeprowadzania elektroforezy w polu pulsacyjnym opiera się na podobnych zasadach jak elektroforeza w polu stałym (patrz ćwicz. 10.38) i zależy w dużej mierze od typu aparatu. W opisie¹ tego ćwiczenia podano sposób przygotowywania DNA do elektroforezy w polu pulsacyjnym. DNA jest izolowany z nienaruszonych komórek w blokach agarozowych i w takiej postaci może być wprowadzany do studzienek żelu.

Yluimul: Krew lub tkanka stała zawierająca DNA.

Odczynniki:

1)    Bufor PBS: 0,01 M bufor fosforanowosodowy o pH 7,2 - 0,14 M NaCI.

2)    Bufor L: 0,1 M EDTA (pH 8,0) - 0.01 M Tris/HCI (pH 7,6) - 0.02 M NaCI.

451