0 6

Wymieniając różne techniki hybrydyzacji nie można pominąć metody, która w ostatnich latach zyskuje coraz większe uznanie. Jest to hybrydyzacja in silu. I Opracowano takie procedury utrwalania skrawków tkankowych i rozmazów cyic-1 logicznych, że kwasy nukleinowe (głównie DNA), tkwiące w strukturze komórkowej, są zdolne do hybrydyzacji z sondami molekularnymi. Sondy te są wyznakowane fluorochromami, a obrazy po hybrydyzacji ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Stąd nazwa tej metody hybrydyzacja FISH (fluorescence in situ hyb ridization). Równoczesne użycie kilku sond, z których każda ma inny ..znak" fluorescencyjny, umożliwia wykrywanie różnych sekwencji DNA w tej samej pojedynczej komórce.

Praktyczne wykonanie hybrydyzacyjnej analizy kw'asów nukleinow'ych, chociaż jest ona ideowo prosta i logiczna, wymaga znacznych nakładów- finansowych i nastręcza wiele trudności metodycznych, które w warunkach studenckiej sa.i ćwiczeń mogą być nie do pokonania. Ponadto merytoryczne uzasadnienie wykonania określonego testu hybrydyzacyjncgo znacznie rozszerza teoretyczny wstęp do każdego takiego ćwiczenia - często o problematykę nie mieszczącą się w podstawowym kanonie wiedzy, przewidzianej w' zakresie tego podręcznika. Stąd też zaproponowane dwa kolejne ćwiczenia mają charakter propozycji na w<yrost.

Ćwiczenie 10.44. Wykrywanie klonalności B-komórkowego rozrostu chłoniakowego metodą blotting i hybrydyzacji wg Southerna (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cola Spring Harbor, 9.31 9.57)

Zasada: Molekularna diagnostyka białaczek i chłoniaków' (w większości przypadków wywodzących się z komórek linii B lub T) operuje zestawem unikatowych znaczników- (markerów) genetycznych, nie związanych z początkowymi uszkodzeniami DNA. Tę dodatkową kategorię markerów stanowią somatycznie zrearan-żowane geny receptorów antygenowych w limfocytach B (bonę marrow dcrived — szpikopochodne) i T (thymus derived — grasiczopochodne), tj. odpowiednio: geny immunoglobulinow'e i geny receptora limfocytów' T — TCR (T-ccll receptor). Proces rearanżacji — analogiczny do przekształceń w prawidłowa różnicujących się limfocytach - jest koniecznym warunkiem wytworzenia odpowiednio różnorodnej populacji immunokompetentnych komórek, zdolnych do swoistego rozpoznawania ogromnego repertuaru najrozmaitszych antygenów' środowiska zewnętrznego. Proces rearanżacji limfocytowych genów receptorowych zachodzi w bardzo wczesnym etapie rozwoju tych komórek i wyprzedza zjawiska odpowiedzialne za ich transformację nowotworową. Monoklonalne w^fzory rearanżacyjne mogą więc świadczyć o złośliwym charakterze rozrostu (monoklonalność) oraz jego rodowodzie (lineage — np. B- albo T-komórkow-y).

W przypadku chłoniaków i białaczek B-komórkowych analizie poddaje się geny immunoglobulinowe. Geny te, kodujące zarówno białkowe łańcuchy ciężkie, jak i lekkie, zlokalizowane są na różnych chromosomach i przybierają w komórkach pnia postać nieaktywnych, rozprzestrzenionych zbiorów poszczególnych rodzajów fragmentów' genowych, tj. segmentów zmiennych V (variable),

456