20101117133

ENZYMY

Laboratorium 5

PREPARATYKA I OCZYSZCZANIE INWERTAZY (p-FRUKTOFURANOZYDAZY)

Ćwiczenie 1: Izolacja Inwertazy z komOiok dmirif w

Inwertaza - enzym z Klaty hydrolaz. rozkłada wl^/ania fruklofuranorydowe Kaluii/o,'. n/droi'ze sacharozy do glukozy I fruktozy (tzw cukier Inwertowany)

Pierwszy etap izolowania enzymu z komórek drożdży polega nu ich rozbiciu przez    ■ z

ziemią okrzemkową i rozpuszczalnikiem (eter I toluen) Eksu .ikcjo we*a enzyrr.aiycxoegr przeprowadza się następnie wodą Czysty preparat enzymu mozn.-i uzysk. iC tfrac»ac •-balastowe przy utyciu kwasu pikrynowego który me powoduje denar/, r j:,, , wytrąćer*i - ■- •

Całą procedurę izolacji i oczyszczania enzymu należy przeprowadzać * niskiaj temperatur Wykonanie:

1.    Utrzy) w moździerzu 5 g drożdży 11 g ziemi okrzemluwiei iCetaei z 5 mL-otuenu

2.    Uciera] nadal próbę przez około 15 minut. dodaMc tiopn>owo wodę destylowana « ;-K.u porcjach po 1 mL

3.    Przelej zawiesinę do probówki wirówkowej i odstaw na 20 minut (w rym czaee miesza* kilkakrotnie zawartość probówki)

4 Odwiruj próbę przy 3500 obrotów / rmnutę przez to m;nu!

5.    Przelej ostrożnie supematant do nowej proóówki ;ov,»'v.fi c-cda; 2 -ni. t U ouforu octanowego o pH 4,5 I wstaw probówkę na około 2-3 minuty do pojemnika z lodem w oefc. oziębienia zawartości do temperatury 0*C

6.    Dodaj do probówki 2 mL 3% roztworu pduymanu sodowego i odstaw do lodu na 30 minut

7    Odwiruj próbę przy 3500 obrotów / rmnutę przez 10 minut

8    Ostrożnie przelej supematant do nowej probówki wirówkowej i w celu opęo«ama supematantu do -10*C, wstaw probówkę na około 5 minut do pojemnka z looem wymieszanym ze stałym NaCI.

9    Dodaj 10 mL zimnego acetonu

10    Odwiruj próbę przy 3500 obrotów / minutę przez 10 minut

11    Supematant wylej, a osad przyklejony do ścianek probówki przemyj kilkoma porcjami (po około 2-3 mL) zimnego acetonu, aż do uzyskania czystego białego osadu.

12    Przemyj osad 4-5 kroplami zlmnago eteru I odstaw probówkę na kilka minut, do momentu wysuszenia osadu

13. Przemyty i osuszony preparat rozpuść w 2 mL wody destylowanej l przelej do butelki z napisem .inwertaza’

Tak przygotowany preparat należy przechowywać do czasu przeprowadzenia dalszych doświadczeń w lodówce w temp 2-8*C.