biotechnologia1

ETAPY:

Lwatanc przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA / obejmuje oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych/

2- dezintegracja komórek oraz Liza - rozbicie ściany i błony komórkowej. Dezintegrację

komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek, np. poprzez homogenizację

(miękkie tkanki zwierzęcej, sonifikację (zawiesiny komórek), rozcieranie (komótki roślinne.

bakteryjne), Lizę detergentami (komórki z hodowli komórkowej) oraz

liżę enzymatyczną (komórki bakteryjne, drożdżowe)

lizap/w

-    detergentów jonowych lub niejonowych / SDSL sarkozyL Tryton X-10/

-    rozpuszczalników organicznych

-    roztworów alkalicznych

-    wysokiej T

-    EDTA /sól sodowa kw. Wersenowego/

-    enzymów trawiących ściany komórkowe, np.: lizozym (nie działa w pH < 8)

Lizozym powoduje rozkład peptydoklikanu i powstanie sferoplastów, które ulegają lizic p/w detergentu lub bezpośrednio ciśnienia osmotycznego w roztworze hipotonicznym.

3.    Oczyszczanie DNA DNA może ulec degradacji p/w różnego rodzaju D-naz (aktywowanych w obecności dwudodatnich jonów metali), dlatego:

-    izolację DNA przeprowadza się w obecności zw. Che latających, np. EDTA lub CDTA / kwas hydroheksanodwuaminoczterooctowy/

-    posługiwać się jałowymi płynami, sterylnym szkłem i dobrej jakości sprzętem /końcówki Pipet/

-    wszystkie czynności wykonywać używając rękawic ochronnych.

4.    Precypitacia /oddzielenie/ DNA od innych frakcji -odwirowanie

-    odseparowanie od związanych z DNA białek /fenol, chloroform z alkoholem izoamyiowym chloroform z alkoholem, mieszanina fenoli z chloroformem i alkoholem Izom. 25:24:1 /

-    trawienie proteinazami /np.: proteinazą K/

Preeypitacja DNA z odbiałczanych próbek:

-    alkoholem ( Et-OH, Ipr-OH) w obecności soli /octanu potasu. Na lub amonu, chlorku Na/ aby złagodzić działanie alkoholu.

5. Usuniecie RN A

-    przeprowadza się enzymatycznie przez inkubację z Rnazą

-    selektywne wytrącenie RN A z chlorkiem litu /zmniejsza gęstość litu/

-    sączenie molekularne

-    wirowanie /cząsteczki RNA mają największą gęstość, zbierają się więc na dnie probówki/

/12 - 24h/