DSC00107

INSTRUKCJA

Detekcja translokacji białaczkowej Bcr-Abl metodą RT- PCK

Uwaga

Po rozmrożeniu wszystkie odczynniki umieść na lodzie. Przed użyciem wstrząsnąć I krótko żwirować (i-2 s.) aby usunąć krople z wieczka probówki. PCB przygotowujemy na lodzie.

Mix do detekcji translokacji

Mix do sprawdzenia jakości cDNA

proporcja na 1 reakcję:

bufor PCR 10x	i 2,5pl
mix dNTPs (20mM)	1 0,2 pl
starter BcPAbl F (20 pM)	- 0,2 pl
starter Bcl-Abl R (20 pM)	- 0,2 pl
Tag polimeraza (2U/pl)	- 0,8 pł
H20 ster.	- 9,1 pl
cDNA	- 2,0 pl
V(o|	= 15 pl

proporcja na 1 reakcję:

bufor PCR 10x	- 2,5pl
mix dNTPs (20mM)	- 0,2 pl
starter Ab! F (20 pM)	- 0,2 pl
starter Abl R (20 pM)	- 0,2 pl
Tag polimeraza (2U/pł)	■ 0,8 pl
H20 ster.	1 9,1 pl
cDNA	- 2,0 pl
V«ót	mm

Zawsze należy przygotować kontrolę; • dodatnią (cONA z komórek K562) I

ujemną (zamiast cDNA dodajemy wodę, którą używamy do przygotowania mieszaniny reakcyjnej)

Uwaaalll

Przed wstawieniem próby do termocyklera bez pokrywy grzejnej dodać 1 kroplę oleju mineralnego do probówki, aby zabezpieczyć Ją przed parowaniem.

Warunki reakcji PCR: denaturacja wstępna- 95°C, 2 min.

denaturacja - 94°C, 30 s. "1 anneallng — 65°C, 60s. ?■ 35 cykli wydłużanie - 72®C, 60 s.. J końcowe wydłużanie - 72°C, 3 min.

Kontynuacja na kolejnych ćwiczeniach

DETEKCJA PRODUKTU PCR NA 2.0 % ŻELU AG A ROZOWYM

Przygotowanie próbek do elektroforezy:

1.5    pl- bufor obciążający

8.5    pi-produkt PCR

Warunki elektroforezy:

1x TBE buffer

2% źeł agarozowy z bromkiem etydyny napięcie; 100V czas 1 h jyf — standard wielkości i * Bcr-Ab! - pnazek o dt 417 pz