img107

CL-4B /aslosowano do wyodrębnienia m/|>us/i/ulnych kompleksów immunologi-cznych z surowicy chorych. W metodzie tej poslu/ono się najpierw techniką filtracji żelowej, aby oddzielić kompleksy od wolnych immunoglobulin, a następnie odzys kano kompleksy dzięki chromatografii powinowactwa. W ramach tego ćwiczenia rozpuszczalne kompleksy izoluje się z ekstraktu płytek krwi, do którego dodano przeciwciała rozpoznające analizowane białko płytkowe.

Materiał: Ekstrakt białek uzyskany z płytek krwi ludzkiej za pomocą buforu zawierającego Triton X-1<K). królicze przeciwciała poliklonalnc reagujące z glikoprotciną lila (GPIIIa podjednostka /?₃ receptora fibrynogenu).

Odczynniki:

1)    Protein A Scpharosc CL-4B.

2)    0.2 M bufor fosforanowy - 0.0! % CHAPS (cholamidopropylo-dimetyloamonio-propanosulfonian) (pH 7,5).

3)    0,2 M bufor fosforanowy - 0,01% CHAPS - 1 M NaCl (pH 7,5).

4)    0,1 M bufor cytrynianowy (pH 3,5).

5)    20% roztwór etanolu.

Wykonanie: Do ekstraktu białek płytkowych (5 ml; 10 mg/ml białka płytkowego) dodać monoswoiste królicze IgG skierowane przeciw GPIIIa (100 pi; 2 mg/ml), a następnie po wymieszaniu pozostawić w temperaturze pokojowej na okres 2 godz. W tym czasie przygotować złoże Protein A Sepharose CL-4B do chromatografii. Złoże (2 ml) upakować w plastikowej kolumnie i przemyć buforem fosforanowym z dodatkiem detergentu CHAPS (odcz. 2; 10 ml). Po zakończonej inkubacji mieszaninę białek rozcieńczyć 10-krotnic buforem fosforanowym i przepuścić przez kolumnę. Następnie, w celu odmycia niespecyficznie związanych białek, przemyć kolumnę buforem fosforanowym z dodatkiem CHAPS (10 ml), buforem fosforanowym z dodatkiem CHAPS i NaCl (10 ml) i jeszcze raz pierwszym z buforów (10 ml). Kompleksy antygen-przeciw-ciało swoiście związane ze złożem można wyeluować 0,1 M buforem cytrynianowym

0    pH 3,5. Wypływający z kolumny materiał zbierać w 1-mililitrowych frakcjach

1    oznaczyć w nich spektrofotomctrycznie (/. = 280 nm) zawartość białka. Frakcje zawierające białko dializować wobec buforu fosforanowego z dodatkiem CHAPS Kolumnę przemyć wodą (40 ml), 20% etanolem (10 ml) i przechowywać w temp. 4 C. Uzyskane kompleksy można poddać analizie elektroforetyczncj. Należy oczekiwać, że w toku elektroforezy w obecności SDS w 7,5% żelu poliakrylamidowym pojawią się prążki o m.cz: ok. 100 kDa (GPIIIa), 130 kDa (GPIIb) oraz 160 kDa (IgG). W obecności /?-merkaptoetanolu w wyniku redukcji wiazań disulfidowych obra/ elektroforetyczny ulegnie zmianie. Pojawią się wtedy prążki o m.cz.: ok. 25 kDa i 55 kDa (lekki i ciężki łańcuch IgG), 110 kDa (zredukowana GPIIIa) oraz 120 kDa (ciężki łańcuch GPIIb).

Ćwiczenie 4.26. Izolowanie fragmentów Fab i Fc immunoglobulin za pomocą białka A (G. Stingl i wsp. 1977: Naturę, 268: 245-246)

Zasada: Cząsteczka immunoglobuliny G składa się z 2 łańcuchów ciężkich i 2 lekkich. Integralność cząsteczki zapewniają mostki disulfidowe, łączące ze sobą części składowe cząsteczki. Cząsteczka IgG przypomina kształtem literę Y (rys. 4.21).

fragmenty Fc    fragment Fc

Rys. 4.21. Cząsteczka IgG oraz produkty jej trawienia pepsyną lub papainą (wg katalogu PIERCF 1994/1995). Przez trawienie pepsyną można uzyskać dwuwalencyjny fragment F(ab')₂ oraz liczne fragmenty Fc. Natomiast trawienie papainą prowadzi do powstania jcdnowalencyjnych fragmentów Fab oraz fragmentu Fc. Różnica ta wynika z różnego miejsca ataku enzymów. Pepsyna trawi ciężkie łańcuchy IgG w regionie pomiędzy dwoma mostkami S—S. natomiast papaina atakuje te łańcuchy powyżej mostków S—S.

Ramiona tej litery zbudowane są z łańcuchów lekkich oraz fragmentów łańcuchów ciężkich, natomiast jej „nóżka” składa się tylko z pozostałych części fragmentów łańcuchów ciężkich. Miejsca wiążące antygen znajdują się na końcach ramion cząsteczki. Łańcuchy ciężkie połączone są ze sobą dwoma mostkami disulfidowymi w regionie zawiasowej ruchomości ramion cząsteczki. Enzymatyczne trawienie cząsteczki IgG za pomocą pepsyny lub papainy prowadzi do podziału cząsteczki na fragmenty. Pepsyna odcina fragmenty ciężkich łańcuchów poniżej pierwszego wiązania disulfidowego w regionie zawiasowym. W wyniku tego powstaje dwuwalencyjny fragment (Fab')₂, złożony z ramion IgG połączonych mostkiem disulfidowym, oraz fragmenty Fc zawierające pozostałość łańcuchów ciężkich. Podczas hydrolizy papainą wiązania disufidowe pozostają w obrębie fragmentu Fc, natomiast ramiona cząsteczki IgG występują osobno jako jcdnowalencyjnc fragmenty Fab.

Złoże z kowalencyjnie związanym białkiem A można wykorzystać do szybkiego oczyszczenia fragmentów Fab i (Fab')₂ z fragmentów Fc. W celu ich wyodrębnienia, produkty hydrolizy przepuszcza się przez kolumnę ze złożem zawierającym kowalencyjnie związane białko A. W trakcie przepływu mieszaniny białek przez kolumnę białko A selektywnie wychwytuje fragmenty Fc oraz niestrawione cząsteczki IgG. W wycieku natomiast znajdą się fragmenty Fab lub (Fab')₂ zależnie od użytego enzymu. Po elucji ze złoża materiału związanego z białkiem A można oczyścić fragmenty Fc z całych cząsteczek IgG przez filtrację żelową. Pozwala na to znaczna różnica między masami cząsteczkowymi tych białek (IgG 160 kDa, a Fc 50 kDa).

159