P1100225

po przekształceniu

l-JL-iwiO-**    (21.3)

Skąd wynika, żc

-0 - *o(l -10“^)    (2Wl

Podstawiając ten wzór do równania (2LI), można otrzymać podstawowy zależności natężenia fluorescencji od stężenia. Aby otrzymać prawidłowe wartafci mierzonej wielkości, należy do prawej strony podstawowego wzoru wprowadał stałą przyrządu k, która uwzględnia warunki pomiaru (np. fluofesccncja, która jut emitowana we wszystkich kierunkach, jest mierzona tylko w- jednym kienmb)

«p_r = kę*o( i - io-*9    (0

Równanie (21.5) można przekształcić, rozwijając wyraz 10'^rfc =* exp(-2,3«.Yi w szereg potęgowy

exp * * 1 + jV +^{+    +    +} —    W

Jeżeli wykładnik potęgi jest mały (,v < 0,05), to trzeci i dalsze wyrazy szeregu (21.6) można pominąć, wówczas

CJtp (-2,3c/c) - I -2Mc    (21.7

Po uwzględnieniu powyższego warunku natężenia fluoresccncji

% =» k&o 2,3c/c    (2M|

W roztworach bardzo rozcieńczonych natężenie fluoresccncji jest wprost proporcjonalne do stężenia. Gdy stężenie wzrasta, to zależność ta staje się krzywoliniowi i zbliża-się do granicznej wartości oczywiście przy założeniu, że kwantom wydajność fluorescencji wynosi I. Założenie to jest spełnione, gdy substancja fluoryzująca jest rozpuszczona w rozpuszczalniku o dużej lepkości. Wówczas czas k-laksacji cząsteczek jest dłuższy od czasu trwania stanu wzbudzonego. Niska temp:-ratura jest korzystna i dlatego roztwory zamraża się w temperaturze ciekłego azotu Jeżeli temperatura jest wyższa (np. pokojowa) i lepkość środowiska mała, to $ nie osiąga granicy k<P₀ i zaczyna maleć w obszarze dostatecznie wysokich stężeń Zjawisko to spowodowane jest snmoobsorpcją fluorescencji.

Do celów analitycznych najlepiej nadaje się obszar liniowy zależności natężenia fluorescencji od stężenia. Współczynnik proporcjonalności tej zależności cbff muje tj. strumień światła źródła wzbudzającego. Stosując duże wartości 4> można zwiększyć czułość metody. Jest to wygodne w porównaniu z metodami spd-trofotometrycznymi, w których najniższe oznaczane stężenie zależy od moilńwiw oznaczania różnicy •*©-$. Granicą oznaczalności metody fluory metrycznej ślepa próba (fluoryzujące domieszki), szumy elektryczne w obwodzie detektor/-ewentualnie reakcja fotochemiczna, gdy stosuje się duży strumień światła źrWi wzbudzającego. Miino to czułość metod fluory metrycznych jest o dwa rzędy wy fan

od ciulości absorpcyjnych metod spcktrofotometryc/nych. Często można mierzyć fluoresccncję roztworów o stężeniu 10 g/ml, a zależność g>_F od stężenia jest liniowa aż do stężeń rzędu ok. 10"⁵ g/ml.

21.3.4. Przyrządy stosowane do pomiarów fluorescencji

Przyrządy stosowane do pomiarów konstruowane są zależnie od wymogów analizy. W najprostszych przyrządach fluorescencję obserwuje się wizualnie. Fluory-metry z filtrami (rys. 21.3) mają często wbudowane jako detektor fotopowiclacz lub

•c

Rys. 21.3. Schemat fluorymetru z filtrami

1 — lampa rtęciowa, 2 — próbka, i — filtr pierwotny, 4 — filtr wtórny. 5 - detektor.

6 — przyrząd pomiarowy

PrrjfmtruswaiHt f l ncr+szenafiM

fotokomórkę. Pomiary wykonuje się w kierunku prostopadłym do kierunku padania światłu wzbudzającego. Źródłem wzbudzenia jest zwykła lampa rtęciowa¹*. Z jej liniowego widmu za pomocą filtru wstępnego (jest to wąskopasmowy filtr) wyodrębnia się tylko jedną linię, który wzbudza fluorescencję próbki. Filtr wtórny umieszcza się przed detektorem w celu zabezpieczenia detektora przed odbitym lub rozproszonym promieniowaniem wzbudzającym. Równocześnie absorbuje on główne linie rama-nuwskie rozpuszczalnika. Nutomiast przepuszcza promieniowanie fluorescencyjne. Jako filtr wtórny stosuje się filtry przepuszczające promieniowanie o długości fali większej od pewnej określonej długości (są to filtry charakteryzujące się tzw. krawędzią absorpcji). Stosując fluorymetr z filtrem, mierzy się względne natężenie fluorescencji w stosunku do wybranego wzorca.

Do pomiaru fluorescencji często stosuje się przystawki fluorescencyjne do produkowanych spektrofotometrów. Wyposażone są one oprócz źródła światła wzbudzającego i filtru pierwotnego również w układ optyczny, który skierowuje emitowaną fluorescencję do monochromatora spektrofotometru. Z drugiej strony produkowane spektrofotometry wykorzystują swoje źródło światła monochromatycznego do wzbudzania fluorescencji, która kierowana jest do detektora bez monochroma-lyzacji. Umożliwia to uzyskanie widma przedstawiającego zależność całkowitej fluorescencji od długości fali promieniowania wzbudzającego.

¹¹ Obecnie stosuje tlę również lampy ksenonowc i lasery — przyp. tłum.

21 rityciM metody

321