P1100278
314. TYPY CHROMATOGRAFU PODZIAŁOWEJ
31.4.1. Kolumnowa chromatografia podziałowa
W metodzie tej w stoli laboratoryjnej pracuje się m kolumnach konstruowa, nych rajczęśriej ze szklanych rurek o odpowiednich rozmiarach, które są napełnia/# obojętnym nośnikiem z osadzoną fazą. Przez slup nośnika przecieka faza ruchoma Słup nośnika zabezpiecza się na dnie kolumny wtopionym spiekiem ceranucr. nym, szklaną kulką i krążkiem bibuły lub igłą WiHstfittera i filtrem. Kolumny moża* napełniać w różny sposób. Najczęściej stosuje sio nasypywanie, tłoczenie i nalewa, nic zawiesiny w fazie ruchomej. Jako obojętne nośniki najczęściej stosuje się dla osadzanej fazy polarnej ziemię okrzemkową, silikaźeł, skrobię i sproszkowaną celulozę a dla niepolaraej fazy osadzanej silikonowaną ziemię okrzemkową, kauczuk i celu-łozę acetylowaną lub inną.
Roztwór próbki nanosi się na kolumnę, najczęściej w fazie ruchomej, w postaci jak najwęższego pasma równomiernie rozłożonego na powierzchni nośnika.
W kolumnowej chromatografii podziałowej stosuje się w zasadzie trzy metody detekcji: substancje są widoczne w kolumnie, substancje poddaje się odpowiedni detekcji i rejestracji w wycieku z kolumny, substancje są wykrywane w szeregu pobranych jednakowych frakcjach eluatu.
Do regeneracji nośnika w większości przypadków wystarczy przemywanie ko. lumny większą objętością fazy ruchomej. Wymywa się również najwolniejsze składniki mieszaniny i przygotowuje kolumnę ponownie do pracy. Lepiej jest jednak przemywać nośnik zarówno fazą stacjonarną, jak i ruchomą.
W ostatnich latach nastąpiła odnowa klasycznych metod kolumnowej chroma-wgrani podziałowej w nowej postaci, jako tzw. wysokosprowna chromatografia cieczom. Technika ta jest Ściśle związana z teorią adsorpcyjnej chromatografii i z teorią chromatografii na sitach molekularnych, co będzie dokładniej omówione w rozdz. 33.
3L4.2. Bibułowa chromatografia podziałowa
rnw 1
Bibuła
Jest to podstawowy nośnik w bibułowej chromatografii podziałowej. Do produkcji bibuły chromatograficznej jest używany linters. który sic czyści, bieli i prasuje na pojedyncze arkusze. Powierzchnia dobrych bibuł chromatograficznych nie mek być bardzo chropowata i musi mieć strukturę homogeniczną. Jako bibuły standardowe, które nadają się do większości prac chromatograficznych, poleca się bibuły Whatnuin 1, Schleicher-Schfill 2043b. Do celów specjalnych stosuje się bibuły odpowiednio modyfikowane,
Rozpuszczalniki i okłady rozpuszczalników UF
Wszystkie rozpuszczalniki organiczne stosowane w chromatografii podziałowej można odpowiednio sklasyfikować na podstawie ich polamości, albo zdolności tworzenia mostków wodorowych. Rozpuszczalniki uszeregowane według tych uh* snofci tworzą tzw. miksotropowy szereg rozpuszczalników.
Odpowiedni uklid rozpuszczalników w bibułowej chromatografii podziałowej powinien spełniać następujące wymagania:
1. Analizowane substancje w wybranym układzie powinny mleć wartości Rw 0,15-035. Dla identyfikacji substancji naloty dążyć, aby aartoM Jt, wynosiła ok. 0.5.
2. Układ powinien dobrze rozdzielić dwie albo więcej substancji o podobnej strukturze, przy czym różnica wartości Rp powinna być co najmniej 0,0$.
3. Izoterma podziału substancji w wybranym układzie powinna być liniowa, tj. plama substancji powinna być okrągła, u jej kształt i wartość łtr nie powinny tlę zmieniać ze zmianą stężenia.
4. Układ nie powinien powedować zmian chemicznych analizowanych substancji.
5. Układ nic powinien obniżać czułości reakcji stosowanych w detekcji.
6. Skład układu powinien być stały i odtwarzalny.
W literaturze fachowej dla większości popularnych związków chemicznych można znaleźć wiele układów rozpuszczalników, które są odpowiednie do rozdzielania chromatograficznego. Odpowiedni układ dobiera się zależnie od charakteru analizowanej substancji.
Przygotowanie próbki
Chromatografia czystych substancji lub mieszanin substancji pcdobnych zwykle nie wymaga specjalnego wstępnego przygotowania próbek. Natomiast w przypadku rozdzielania substancji o różnym charakterze, próbkę należy wstępnie przygotować tak, aby usunąć różne domieszki, które przeszkadzałyby w chromatografowaniu. Najczęściej polega to na usuwaniu dał białkowych, cukrów, rozkładzie tłuszczów względnie dc mineralizacji.
Nanoszenie próbki E
Miejsce na chromatogrrmie, gdzie nanosi się próbkę, należy najpierw oznaczyć miękkim, czarnym ołówkiem, najlepiej według szablonu. Rozmiar i umieszczenie startu na chroma tog ramie są okrcilcne rozmiarami c hromatograten i techniką chromatograficzną (zstępująca, wstępująca, krążkowa ilp.).
Wielkość plamy. Mała kropka lub wąskie poprzeczne pasmo polepszają ostrość rozdzielania. Tolcca się do każdego typu rozdzielania wyznaczyć maksymalnie dopuszczalną ilość laką, która jeszcze nic ma ujemnego wpływu na jakość rozdzielania. Optymalna wielkość średniej plamy wynosi 5-6 ir.m, a optymalna naniesiona objętość 5-10 ąl.
Technika nanoszenia próbki. Próbkę najczęściej odmierza się i nanosi mikro-pipetą. Do zwykłych prac stosuje się pipety serologiczne, do większych objętości — 2wyozajnc pipety. Do nanoszenia bardzo małych objętości okazały się przydatne różne mikropipety. do dokładnego nanoszenia różnych objętości można stosować X powodzeniem mikrobiurety albo strzykawki do zastrzyków z mikrametrycznym przesuwaniem tłoka.
Wyszukiwarka