P1100279

Rozwijanie

Rozwijanie chronmtogramu stanowi istotę procesu chromatograficznego. W dalszej części rozdziału będą omówione tylko podstawowe typy rozwijania chromatograficznego i urządzenia, które okazały się przydatne w laboratorium.

Technika rozwijania zstępująca. W tej klasycznej technice rozwijania bibułę z naniesionymi próbkami wkłada się górnym krańcem do naczynia z fazą ruchomą, która następnie spływa przez bibułę z góry w dół. Podstawę urządzenia tworzy zamknięta komoro. Jako komory można stosować różne naczynia, które mają odpowiedni kształt 1 wielkość. Na ogół są to komory szklane. Bardzo wygodne tą komory rozszerzone w górnej części, co umożliwia wstawianie łódki z rozpuszczalnikiem bez stosowania specjalnego rusztowania.

Technika rozwijania wstępująca. Różnica w porównaniu z poprzednią techniką polega na tym, że rozpuszczalnik wznosi się po bibule. To umożliwia prostszą konstrukcję komory. Fazę ruchomą nalewa się bezpośrednio na dno komory, bibułę zwija się w walce i wprost wstawia do rozpuszczaInlka.

Technika rozwijania krążkowa. W metodzie tej bibułę umieszcza się poziomo, a układ rozpuszczalników doprowadza się do środka bibuły. Układ można nanosić różnie (za pomocą knota, nakraplnniem, za pomocą stożka z bibuły itp.). Jako komory chromatograficzne dobrze służą szalki Pctriego. pokrywki cksykatoiów itp, między którymi umieszcza się arkusz bibuły z naniesionymi próbkami.

Ckromatografia dwukierunkowa. W tej technice chromatogram rozwija się na bibule o kształcie kwadratu, a próbkę analizowaną nanosi się na jednym rogu bibuły. Chromat ogram rozwija się w jednym kierunku jednym układem rozpuszczalników, a następnie rozwija się chromatogram w kierunku prostopadłym do kierunku rozwijania pierwszego chromatogramu, tym samym lub innym układem rozpuszczalników.

Detekcja

W literaturze dotyczącej chromatografii bibułowej są opisane różne rodzaje metod detekcji, z których vr praktyce stosuje się tylko niektóre. Najoszczędniejsze są metody fizyczne, które umożliwiają szybkie ustalenie położenia substancji a chrotnatogramie. Należy do nich głównie nbsorbeja promieniowania w zakresie widzialnym i fluorescencja w zakresie nadfioletu. Wyniki można znacznie uściślić przez wprowadzenie techniki radioizotopowej, która w połączeniu z chromatografią bibułową umożliwia lokalizowanie na bibule śladowych ilości substancji.

W laboratoriach są rozpowszechnione metody chemiczne, w których pfcnr? substancji można zabarwić odpowiednimi'odczynnikami chemicznymi. Roztwory odczynników wywołujących nanosi się na bibułę przez zanurzenie jej w roztworze odczynnika, przez położenie bibuły na płyt. ie pokrytej tym odczynnikiem, przez dodanie odczynnika wywołującego do układu rozwijanego, albo najczęściej pracz skropienie za pomocą specjalnych rozpylaczy.

Metody biologiczne można stosować do detekcji substancji na chromatofrs* mach bibułowych przez reakcje enzymatyczne i funkcje poszczególnych organów albo całych organizmów.

1    A tui U za f/ojc/oH'a

Substancje rozdzielone metodą chromatografii bibułowej można oniować ilwo-psa sposobami: bezpośrednio nu włóknach bibuły (insitu),lubpo wymyciu wbatancjł

s bibuły -

Metody in situ. We wszystkich metodach m situ porównuje wę anbtWncję aim-t?av»aną ze znaną Holcią tej samej substancji; próbka i wzorzec są chromalografo-tfanc równolegle* ponieważ zależność między wielkością rrierzouą a llo&ciuml Hibvumcji w plamie na ogół nie jest liniowa. W metodach tych wielkością nniczę-iaci mierzoną jest powierzchnia plamki, dla której jest spełniona w przybliżeniu liniowa, zależność

Ig m *■* kA

gdzie: m ~ zawartość substancji w plan.cc, A — płaszczyzna, plamki k — stała za-icżna od warunków eksperymentu.

Do oznaczania substancji można takie wykorzystać długość plamki, posługując jię zależnością

Ig m k Ig Ł

gdzie i m — zawartość substancji w pian ce, L — długość plamki k — stała.

Przy fotometrycznytn oznaczaniu oddzielonych substancji n.cłna mierzyć strumień promieniowania odbitego od plamki lub strumień piciLicłuowciua przechodzącego.

Można mierzyć strumień promieniowania pizcchrdżąccgo przez całą płaszczyznę plamki albo tylko przez środek plamki. Zaletą tych automatycznie pracujących, optycznych urządzeń jest to, że dają prawdziwy zapis i oszczędzają czas pracownika.

Z metod elektrochemicznych są stosowane np. pomiary wielkiej częstotliwości, potencjometr iii i polarografia.

Metody elucyjne. Oznaczanie jedną z metod po clucji zwykle poprzedza wymywanie substancji z bibuły. Oprócz tego cluiijc sic poszczególne wycinki chroń: biogramu z oddzi el onyrni substancjo nr. i wtedy, gdy trzeba je- poddać dalszej obróbce (wydzielenie, dalsze chromatograficzne rozdzielanie, przygctowimic pochodnych itp.).

Aby nie rozcinać chromatogramu na poprzeczne pcdi przypadkowo, przeprowadza się wstępne rozeznanie w ten sposób, że poddaje się detekcji tylko część, iwy kle brzeg chromatogramu.

Najprostszy sposób clucji polega na zanurzeniu cdcinkćw bibuły w rozpcsi-ctaliulru eluującym. O wiele efekty wniejszą techniką jest jednak chroir.atcgraF.e;r a kapiJtirtia elttcfd polegająca na przesiąkaniu rozpuszczalnika duującego ptzez dane pasmo; technika ta. umożliwia pracę z minimalnymi objętości a mi cluatu.

Do oinaczania oddzielonych substancji po tltcji można zastosować jakąkolwiek odpowiednią iretetię chcrrkvną, fizyczną lub biologiczną.

Prsparatywna chromatografia bibułową

W przypadku zastosowania bibułowej chromatografii podziałowej do celów prcpnnuywnych nic wystarczy technika że zwykłym paskiem bibuły, ale konieczne jest użycie jednej ze specjalnych technik.

429