P1100285
kolejności, jak ^stępfiją ^tdług swojej polarności) w szeregu eluolrorcwy^ Technika przemywania jest obecnie najczęściej stosowanym typem kohuriiidwe; chromatografii absorpcyjnej.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
Klasyczna chromatografia cieczowa na kolumnie jest dobrze znaną metodą rozdzielania. Kolumnę o różnych średnicach napełnia sic odpowiednio dobranym adsorbentem, faza ruchoma wolno przepływa przez kolumnę unosząc micszar.irę substancji, które podczas przechodzenia przez kolumnę rozdzielają się na poszczególne składniki, przestrzennie cd siebie oddzielone. Frakcje eluotu zbiera się i następnie analizuje. Rozdzielanie substancji tą tradycyjną rr.etcdą trwa jcdtiwk bardzo długo i efektywność stosowanych kolumn jest stosunkowo mała. Dlatego w ostatnim czasie skonstruowano przyrządy, które usuwają te wady i odznaczają się dużą szyb-kością analizowania i wysoką efektywnością stosowanych kolumn.
W skład wyposażenia nowoczesnego przyrządu do wysokosprawnej chromatografii cieczowe] wchodzą:
1) zbiornik z rozpuszczalnikiem, który może mleć także urządzenie do elucj gradientowej,
2) wydajna pompa gwarantująca działanie bezpulsowe,
3) układ inickcyjny do nanoszenia próbki,
4) kolumna (z możliwością zamontowania urządzeń dodatkowych, takich jak termostat),
5) detektor,
6) urządzenie rejestrujące.
V/ obecnym stanic znajomości podstaw teoretycznych najbardziej skomplikowanym problemem jest wybór fazy ruchomej. Dotąd nie istnieją powszechnie obowiązujące prawa, które można by było zastosować. Odpowiednio dobrana faza ruchoma musi spełnić następujące wymagania: być bardzo czysta; być odpowi*dniu do stosowanego typu detektora, być dobrym rozpuszczalnikiem analizowanej próbki\ powinna umożliwiać odzyskanie oddzielonych substancji (ważne w pracach prepam-tywnych), oraz musi mieć małą lepkość. Faza stacjonarna musi być stabilna przy zastosowanej fazie ruchomej.
Redznj fazy stacjonarnej ma również duże znaczenie w skutecznym prowrdzeniu procesu rord^alaiua. Ogólnie można powiedzieć, że nowoczesna, wysokospiawna chromatografia cieczowa charakteryzuje się wąskimi kolun.nami <1-3 mm), małą ziarnistością wypełniania kolumny (poniżej 50 pm), stosunkowo dużymi przepływami (1-5 ml/min) i stosowaniem wysokiego ciśnienia. Rozwój tego typu cieczowej chromatografii wymagał produkcji nowych, handlowo dostępnych wypełnień kolumny. Wypełnienia w zasadzie można podzielić na dwie główne kategorie:
I. Wypełniacze porowate są sferyczne albo o nieregularnych kształtach, mają dużą porowatość i są dostępne w szerokich rozmiarach ziar nistości. Ich główną zaletą jest duża pojemność, np. na wypełnienie z sitik&żelcm można nanieść do I ir.g próbki na 1 kg wypełniacza bez przebicia kolumny I obniżenia efektywności. Ze spadkiem rozmiarów cząstek zmniejsza się także długość porów. Zmniejszenie długości drogi dyfuzyjnej umożliwia większą prędkość przejścia substancji, rośnie takie
fctktywność kolumny i zdolność rozdzielcza. W ostatnim czasie powucchnie użtwt s;ę materiały o wielkości ziorn poniżej 20 pm.
Z Powierzchniowo porowate materiały (nazywane także warstwowymi materia-^ porowatymi, materiałami z kontrolov/aną aktywnością powierzchniową, albo ocśoiiuuni pclikularnymi) składają się ze stałego jądra i okalającej porowatej po-j Migracja substancji odbywa się tylko w powiece porowatej. Efektywność lco-
|tmny i zdolność rozdzielcza jest bardzo duża. Ich wadą jest mała pojemność. Ko-' gnmaz powierzchniowo porowatego silikażelu wysyca się już: 0,1 mg próbki na 1 g wypełniacza.
W ostatnim cznsic są dostępne gotowe kolumny do chromatografii cieczowej i (^pełnione adsorbentem o ziarnistości poniżej lO pm, które produkuje firma Varłan Acroeraph. Takie kolumny mają dużą efektywność rozdzielania. Na przykład na 1 (churmie o długości 15 cm można rozdzielić 9 różnię podstawionych azopocbodnych.
Aby usunąć niektóre trudności związane z przygotowaniem odpowiednich 1 wypełnień, opracowano metody otrzymywania chemicznie wiązanych faz na co-1 jnilcAch. W klasycznej chromatografii cieczowej faza ruchoma musi być w równo-I wadze z fazą stacjonarną. Związane są z tym pewne wymogi:
1) faza ruchoma musi być nasycona fazą stacjonarną, ponieważ w przeciwnym przypadku faza ruchoma zostałaby wymyta;
2) nie można stosować większych prędkości przepływu, ponieważ następuje
! fazy stacjonarnej z powierzchni nośnika;
3) eluat z kolumny jest właściwie fazą^ruchomą nasyconą fazą stacjonarną;
4) przy clucji gradientowej zachodzą dodatkowe trudności, ponieważ zmiana składu fazy ruchomej narusza równowagę faza ruchoma - faza stacjonarna i wy-
j i!g?u;« wymywanie fazy stacjonarnej z kolumny. Powyższe wymogi spełniają wy-| Tanienia handlowe, które są dostępne w kilku odmianach:
1. Wypełnienie C—H z osadzoną fazą typu Si—O—Si—C otrzymywane przez ‘sadzenie węglowodoru typu oktadecyl na silikażclu o wielkości cząstek lO um.
ruchomą stosuje się mieszaninę wody z aceton!trylem lub alkoholem.
2. Wypełnienie C=N zawiera grupy alkilonitrylowe otrzymywane przez osa-^enie np. /?, /J'-oksy dw u p ropion i trylu na silikażbclu. Nadaje się np. do oddzieleniu rakotwórczych nzopochodnych.
3. Wypełnienie NII3 zawiera pierwszorzędowe alkiloaminy wiązane na sili-kaiclu. Nadaje się do oddzielenia substancji o charakterze kwasowym lub zasadowym, substancji o charakterze sterydu lip.
Wiązania typu Si— O—C są mało odporne na hydrolizę i na podwyższoną ismpcraturę i dlatego rozpuszczalniki zawierające wodę będą te fazy hydrolizować. Wiązanie silikonowe typu Si—O—Si jest termicznie i chemicznie stabilniejsze. Dla-<g° fazy silikonowe są odpowiednie do pracy w wyższej temperaturze bez obawy niszczenia wypełnienia.
Dalszym ważnym problemem przy konstrukcji wysokosprawnyeh chroraato-pafów cieczowych są detektory. Obecnie stosuje się detektory, których działanie jiolega na adsorpcji światła w nadfioletowym lub widzialnym zakresie widma, na j pomiarze współczynnika załamania, przewodnictwa oraz detektory płomieniewo-jo-
440
Wyszukiwarka