Schemat postępowania

-2

1 ml

10

■y /■»1 ml 2.Wykonanie szeregu rozcieńczeń

4-

1. Pobranie próby z kłodnicy. Założenie: Wvsteoują tam mikroorganizmy rozkładające fenol i katechol.

2. Szereg rozcieńczeń wykonano, by zmniejszyć ilość bakterii w jednostce objętości, by w późniejszym posiewie otrzymać pojedyńczą kolonie.

4. Po 48 godzinach inkubacji wybrano pojedyńcze kolonie bakterii i oczyszczono metodą posiewu redukcyjnego na płytkach ze zestalonym podłożem agarowym

0,1 ml

3. Wykonano posiew powierzchniowy na płytkach Petriego z podłożem mineralnym Kojima, wzbogaconym w a) fenol(lmM), b) katechol l(mM). Podłoże Kojima jest podłożem syntetycznym, posiada znany i ścisłe określony skład chemiczny, na którym wybrane mikroorganizmy mogą się rozwijać.

Fenol i katechol są jedynym źródłem węgla w celu wstępnego wyselekcjonowania mikroorganizmów zdolnych do rozkładania tych związków.

Posiew redukcyjny posłużył nam, do wyizolowania jednej, czystej kolonii bakterii, która rozwinęła się na podłożu Kojima. Prawdopodobnie kolonia rozkłada fenol lub katechol. Przy późniejszym doświadczeniu zobaczymy, czy nasza hipoteza potwierdziła się.

5. Po upływie następnych 48 godzin wybrano pojedyńczą kolonię bakterii i przesiano ją na skosy agaraowe w celu namnożenia biomasy.

Sporządzono preparaty mikroskopowe wybarwione metodą Grama, w celu zbadania morfologii bakterii.

6. Po namnożeniu się bakterii na skosach agarowych spłukano biomasę do kolb stożkowych zawierających płynną pożywkę Kojima z dodatkiem: a) fenolu (5 mM) bjkatecholu (5 mM)

Stężenie ksenobiotyków wynosi po 5mM w celu wyeliminowania bakterii niezdolnych do ich rozkładania, a zdolnych jedynie do przeżycia w niewielkich stężeniach tych związków' jednocześnie mogących przetrwać okresowy brak dostępu do źródła węgla dzięki zgromadzonym wewnątrz komórek substancjom zapasowym. Jednocześnie podwyższenie stężenia pozwala na wyselekcjonowanie bakterii o dużej oporności na obecność ksenobiotyków w środowisku i zdolnych do rozkładu tych substancji z dużą wydajnością.

7b. Do oznaczenia katecholu wykonano następujące czynności:

-    pobrano 1 ml supernatantu -dodano 1 ml 10% Na₂Mo04 • 2H₂0

-dodano 0,5 ml 0,5 M HCI

-    dodano 0,5 ml NaN02 -dodano 1 ml 10 % NaOH

▼

8. W spektrofotometrze zmierzono absorbancję przy długości fali (480 nm dla katecholu, 550 nm dla fenolu) wobec prób ślepych, w których supernatant zastąpiono wodą/ by zobaczyć, czy stężenie katecholu i fenolu zmalazło lub pozostałe nie zmienione. Fenol i katechol były jedynym źródłem węgla w tym podłożu.

Pomiar ten posłużył nam do potwierdzenia naszej hipotezy: czy mikroorganizmy, które wyselekcjonowaliśmy są zdolne do rozkładania katecholu i fenolu do związków nietoksycznych.

Oznaczono spektrofotometrycznie gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm wobec próby ślepej (wody destylowanej),aby zobaczyć, jaką mamy ilość biomasy przed inkubacją, oraz by później porównać, czy stężenie bakterii na podłożu zmalało czy wzrosło.

7.Po upływie 7 dni inkubacji dokonano pomiaru stężenia biomasy w założonych hodowlach metodą spektofotometryczną (absorbancja fali o długości 600nm). Pomiar ten wykonano by zobaczyć, ile biomasy wyszło nam po hodowli. Czy wyselekcjonowaliśmy bakterie, zdolne do rozkłady fenolu i katecholu, czy stężenie wzrosło, czy bakterie mają oporność na obecność ksenobiotyków. Etap ten jest po to, by przetestować przydatność wyizolowanych szczepów do wywołania odpowiednich przemian.

7a. Do oznaczenia fenolu wykonano następujące czynności:

-    pobrano 1 ml supernatantu -dodano 4 ml wody destylowanej -dodano 1 ml dwuazowanej para-nitroaniliny

-kolejno dodano 0,5 ml 10% NazCOsi 1 ml 10 % NaOH

-    uzupełniono do 10 ml wodą destylowaną