1110

Ćwiczenia 2 część druga

A.    Izolowanie komórek zapalnych z ośrodkowego układu nerwowego (OUN)

1.    Mózg i rdzeń kręgowy myszy przetrzeć przez nylonowe sitko (70 pm, BD) nałożone na 50 ml probówkę i równocześnie przepłukiwać PBS-em (Phosphate Buffered Salinę, zbuforowany roztwór soli fizjologicznej).

2.    Próbki wirować przez 10 min, w 4°C, 350 x g.

3.    Powstały po wirowaniu supernatant wyrzucić, a osad zawiesić w 8 ml 40% Percollu (Sigma).

4.    Uzyskaną zawiesinę nawarstwić na 6 ml 70% Percoll.

5.    Próbki wirować przez 40 min, w 4°C, 700 x g.

6.    Zebrać interfazę pomiędzy 40%, a 70% Percollem (w tym miejscu gromadzą się komórki zapalne).

7.    Zebrane komórki przepłukać PBS-em poprzez wirowanie (10 min, 4°C, 350 x g).

Przygotowanie odczynnika Percoll

40% Percoll (na jedną próbkę).

3.2    ml odczynnika Percoll + 4,8 ml płynu Hanksa bez czerwieni fenolowej i bez jonów Ca²’ i

Mg²' (Hank’s Buffered Salt Solution).

70% Percoll (na jedną próbkę).

4.2    ml odczynnika Percoll + 1,8 ml płynu Hanksa z czerwienią fenolową i bez jonów Ca²" i

Mg²⁺

B.    Izolowanie komórek jednojądrzastych z węzłów chłonnych i śledziony

1.    Węzły chłonne pachowe i pachwinowe oraz śledzionę przetrzeć przez nylonowe sitka (70 pm) nałożone na 50 ml probówki i jednocześnie przepłukiwać PBS-em.

2.    Próbki wirować przez 10 min, w 4°C, 350 x g.

3.    Zebrać supernatant do osobnych 50 ml probówek.

4a. Komórki z węzłów chłonnych zawiesić w 5 ml PBS-u i policzyć z wykorzystaniem komory Burkera.

4b. Splenocyty po żwirowaniu zawiesić w 5 ml buforu RBC i inkubować 5 min na lodzie w celu zniszczenia czerwonych krwinek. Po tym czasie do splenocytów dodać 5 ml PBS-u i przepłukać poprzez wirowanie (10 min, 4°C, 350xg).

Przygotowanie odczynnika RBC (Red Blood Celi)