1111

Skład:

150 mM NH₄C1 ImM KHCO3

0.1 mM Na2EDTA

Dopełnić do 500 ml wodą podwójnie destylowaną i ustalić pH 7.2. Bufor przechowywać w 4-8°C.

Liczenie komórek w komorze Burkera (Merck)

W tym celu komórki należy wybarwić błękitem trypanu (Sigma). Do 80 pi PBS-u należy dodać 10 pl błękitu trypanu i 10 pl zawiesiny komórek. Błękit trypanu umożliwia rozróżnienie populacji komórek żywych i martwych. Ilość żywych komórek należy policzyć wg wzoru: (średnia liczba komórek z 4 dużych kwadratów komory/10)*objętość (ml), w której zawieszono komórki.

Magnetyczne sortow anie komórek CD4 z wybranej tkanki

Komórki, które nie są komórkami CD4+ (cytotoksyczne komórki T, komórki B, NK, komórki dendrytyczne, makrofagi, granulocyty) są wyznakowane magnetycznie poprzez koktajl przeciwciał skoniugowanych z biotynąoraz anty-biotynowe kulki magnetyczne. Komórki wyznakowane magnetycznie są usuwane poprzez ich zatrzymanie w polu magnetycznym, natomiast komórki CD4+ przechodzą przez kolumnę.

Przygotować:

-    zawiesinę komórek z wybranej tkanki,

-    zestaw^r do sortowania: CD4+ 4' celi Isolation Kit II Mouse (.Miltenyi Biotec),

-    kolumnę MS,

-    separator magnetyczny.

Wykonanie doświadczenia:

1.    Policzyć wyizolowane z wybranej tkanki komórki i przygotować zawiesinę 10⁷ komórek.

2.    Komórki żwirować (10 min, 4°C, 350 x g).

3.    Całkowicie usunąć supernatant.