6

związane z przesiewaniem bezwzględnie beztlenowych organizmów tlenowrażliwych " prowadzi się w warunkach ścisłe beztlenowych (atmosfera gazów obojętnych).

Drobnoustroje beztlenowe hodowane są w pożywkach, w których został obniżony potencjał oksydoredukcyjny poprzez usunięcie rozpuszczonego w nich tlenu. W praktyce laboratoryjnej stosuje się kilka sposobów zapewniających beztlenowe warunki środowiska hodowlanego:

K

-    metody fizyczne, polegające na mechanicznym usunięciu tlenu lub absorpcji tlenu,

-    chemiczne, z zastosowaniem substancji redukujących tlen,

-    biologiczne, oparte na wspólnej hodowli organizmów tlenowych i beztlenowych.

i i

|| Ji K

Metody fizyczne

Metody fizyczne polegają między innymi na usunięciu tlenu z pożywki płynnej przez jej zagotowanie przed posiewem i szybkie schłodzenie, a następnie zalanie pożywki warstwą jałowego, płynnego oleju parafinowego lub agaru wodnego.

Inną metodą jest hodowla bakterii w anaerostacie w próżni lub w atmosferze gazu obojętnego (azotu, argonu, helu lub wodoru). Stosuje się również hodowlę mikroorganizmów w pożywce płynnej zawierającej tkankę roślinną (np. marchew, ziemniak) lub tkankę zwierzęcą (np. kawałki wątroby - pożywka Wrzoska, nerki lub mięśnia sercowego) (rys. I-5.9a), których zadaniem jest adsorpcja tlenu ze środowiska hodowlanego. Inną formą hodowli beztlenowców jest hodowla kłuta w wysokim slupie pożywki stałej (rys. I-5.9b).

m

Rys. 1-5.9. Metody fizyczne hodowli beztlenowców, a - pożywka Wrzoska; 1 - warstwa płynnej parafiny. 2 - pożywka bulionowa z wyciągiem wątrobowym. 3 - kawałek wątroby, b - wysoki stup pożywki

Innym rozwiązaniem prowadzącym do wytworzenia warunków beztlenowych jest zastosowanie komory do przeszczepień i hodowli, pozbawionej tlenu, wypełnionej azotem, argonem lub wodorem, bądź zastosowanie inkubatora do hodowli drobnoustrojów, wypełnionego azotem, dwutlenkiem węgla lub mieszaniną gazów, odpowiednią do hodowli danego drobnoustroju (rys. 1-5.10). Gaz jest podawany do urządzenia z góry i zawracany od dołu przez wentylator, co zapewnia homogenność stężenia gazu w inkubatorze.

TiTil

Rys. 1-5.10. Komora do przeszczepier i hodowli drobnoustrojów w warunkach beztlenowych

Metody chemiczne

Metody chemiczne polegają na wiązaniu tlenu przez substancje redukujące, łatwo utle-nialne. Substancje te mogą być dodane do pożywki lub też umieszczone poza nią. Najczęściej stosuje się dodatek: 0,5-1,0% glukozy lub 0,1% Na_:S0₃, opiłków żelaza zredukowanych w strumieniu H₂. Dodaje się również inne substancje, jak: cysteina, glutation, kwas askorbinowy, siarczan sodu (III), tioglikolan sodowy. Oprócz pożywki można stosować płyn Buchnera złożony z mieszaniny pirogalolu i wodorotlenku potasu lub nasyconego roztworu węglanu sodu w stosunku 1:1. Najczęściej stosuje się 10% roztwory wodne pirogalolu i wodorotlenku potasu, mieszane bezpośrednio przed użyciem. Piro-galol w roztworach alkalicznych utlenia się tlenem z powietrza, w wyniku czego powstaje trioksybenzol o zabarwieniu ciemnobrązowym:

3QH₃(OH), + NaOH + 0₂ -> Ci₈Hi₂O_s + 3H₂0 + NaOH

Przy zastosowaniu węglanu sodu reakcji towarzyszy silne wydzielanie dwutlenku węgla, co dodatkowo sprzyja uzyskaniu warunków beztlenowych. Płynem absorbującym tlen nasyca się korek z waty, który następnie wprowadza się nad hodowlę wewnątrz probówki lub też umieszcza się na dolnej części płytki Petriego pod hodowlą znajdującą się w górnej części płytki. Hodowlę szczelnie zabezpiecza się przed dostępem tlenu z powietrza, zamykając probówki korkiem gumowym lub uszczelniając płytkę parafiną (rys. 1-5.11).

Katalityczne wiązanie wodoru z tlenem zostało wykorzystane w specjalnych urządzeniach do hodowli beztlenowców. Obecnie dostępne są na rynku Gas-Pak (firmy bioMerieux) lub AnaeroGen (firmy Oxoid), zawierające zestawy odczynników: borowodorek sodu i/lub diwęglan sodowy. Odczynniki te umieszcza się w anaerostacie wraz z niewielką ilością wody oraz hodowlami beztlenowców (rys. 1-5.12). W wyniku reakcji chemicznej borowodorku sodu z wodą powstaje wodór, który w obecności katalizatora palladowego reaguje z tlenem obecnym w środowisku, czemu towarzyszy wydzielenie wody. Reakcja zachodzi bardzo szybko i w krótkim czasie można uzyskać środowisko beztlenowe.