Elektrofereza (1)

Natężenie pola elektrycznego. Przy niskim natężeniu pola migracja fragmentów liniowego DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jednakże ruchliwość fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej nie wzrasta w sposób proporcjonalny, dlatego też efektywny zakres rozdziału w żelu agarozowym można uzyskać przy napięciu 5 V*cnr'.

Skład buforu do elektroforezy. Ponieważ ruchliwość elektroforetyczna DNA zależy od składu i siły jonowej buforu, w którym przeprowadzamy elektroforezę, więc w roztworach o małej sile jonowej DNA migruje bardzo wolno, natomiast w buforze o zbyt dużej sile jonowej (np. 10 ^x stężony bufor TBE) przepływ ładunku powoduje wydzielanie się znacznej ilości ciepła. To z kolei może doprowadzić do zmian konsystencji żelu ze stałej w płynną i denaturacji DNA. Najczęściej stosuje się bufor TBE lub TAE o pH 7,5-7,8. Ze względu na większą pojemność buforową, jaką posiada TBE, jest on częściej stosowany do rozdziału elektroforetycznego niż TAE. W laboratoriach używa się-buforów elektrodowych sporządzonych ze stężonych roztworów: 50 * TAE lub 10 ^x TBE, które to stężone roztwory przechowuje się w temperaturze pokojowej.

3.2. Elektroforeza pozioma w żelu agarozowym

Elektroforeza w żelu agarozowym jest to standardowa metoda, służąca do identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania fragmentów DNA. Wizualizacja cząsteczek DNA następuje w świetle promieni UV (przy długości fali 312 nm) dzięki barwnikowi fluoryzującemu - bromkowi etydyny, który dodany do żelu wbudowuje się między zasady DNA. Stosując bromek etydyny (bromek 2,7-diamino-N-etylo-6--fenylo-fenantrydyny), można wykryć kilka nanogramów DNA, gdyż fluorescencja kompleksu bromek etydyny-DNA jest dziesięciokrotnie wyższa od fluorescencji samego bromku. Występuje tu zjawisko interkalącji, czyli tworzenia stabilnych kompleksów pomiędzy DNA a planarnymi Ugandami, które mają zdolność (dzięki swej płaskiej konformacji) wsunięcia się pomiędzy sąsiadujące ze sobą pary zasad nukleinowych w DNA. Takimi ligandami, zwanymi interkalatorami, są bromek etydyny i azotan srebra.

Wraz z DNA wprowadzane są do studzienek specjalne bufory, które zwiększają gęstość próbek — „obciążają” je, dzięki czemu następuje właściwe ich umiejscowienie. Bufory takie można podzielić na denaturujące i niedenaturujące. W tych pierwszych głównym składnikiem jest formamid (> 90%), w drugich sacharoza (> 50%), oprócz tych substancji w buforach obciążających dodaje się barwniki (np. błękit bromofenolowy). Migracja barwnika zawartego w buforze jest ściśle skorelowana z migracją cząsteczek DNA o określonej masie, ułatwiając w ten sposób obserwowanie prawidłowości rozdziału. Przed nałożeniem próbek DNA do studzienek żelu należy je zmieszać z buforem obciążającym w odpowiednich proporcjach. Dzięki temu możemy być pewni, że próbka opadnie na dno studzienki i dodatkowo będziemy mogli śledzić jej migrację podczas elektroforezy.

W każdym rozdziale elektroforetycznym obok próbek DNA powinno umieszczać się w dodatkowej studzience wzorzec mas (standard mas). Migrując w żelu równolegle z próbką, pomaga on zorientować się, czy otrzymany został pożądany produkt. Pozwala także na przybliżone określenie wielkości fragmentów DNA. Wzorzec mas to fragmenty o ustalonej wielkości. Jest to zazwyczaj wyizolowany DNA fagów pocięty odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Przy ogromnej liczbie produkowanych komercyjnie wzorców bez trudu dobierzemy taki. który' z największą dokładnością pozwoli określić wielkość badanych fragmentów. Należy pamiętać, aby przy wyborze wzorca kierować się zasadą, że fragmenty wzorca muszą być zbliżone do fragmentów, których się spodziewamy. Jeśli nie wiemy, jakiej wielkości fragmenty otrzymamy, możemy posłużyć się wzorcami uniwersalnymi, złożonymi na ogół z około 10 fragmentów zróżnicowanych w równym stopniu, na przykład o 50 pz. Oznacza to, że najmniejszy fragment ma długość 50 pz, następny 100 pz, kolejny 150 pz, a ostatni na przykład 500 pz. Stan-dardowe żele agarozowe mają małą rozdzielczość, fragmenty rozróżnialne do rozdziale musza różnić sie