img004 (3)

KIK

Do sporządzam* rozeieńczeń stosuje s« roztwór fizjologiczny (0,85% NitCl), płyn Ringera tub 2-procentowy roztwór cytrynianu sodu. Zaleconym rozcieńczalnikiem przez ISO, organizacje zajmująco sie opracowywaniem międzynarodowych norm, jest roztwór fizjologiczny z 0,1 % peptonu.

Pierwsze wyjłciowc rozcieńczenie (1:10), należy przygotować wg następującego schematu: 10 g (10 cm³) próby dodaje sie do 90 cm⁷ roztworu do rozcieńczeni. Do sporządzenia dalszych rozeieńczeń naiezy przygotować kilka probówek zawierających po 9 cm³ jałowego rozcieńczalnika. Kolejne 10-krotne rozcieńczenia przygotowuje sie, uzywąjąc do każdego rozcieńczenia sterylnej pipety. Z rozcieńczenia wyjściowego lub hodowli pobiera się jałową pipeta i cm³ i przenosi do probówki zawierającej 9 cm³ rozcieńczalnika, a następnie wykonuje się dalsze rozcieńczenia. Z każdego rozcieńczenia wykonuje się posiew na płytki i do probówek, po czym pipeta jest „odrzucana",

rsiiluiiniapi mnruńiirnniitnisr. starannie Wymieszać przez 10-krotne wciąganie płynu jałową pipeta iub jeszcze lepiej w sposób mechaniczny. Materiał z zewnętrznej powierzchni pipety należy starannie usunąć jałowa bibuta.

Stopień rozcieńczenia zalezy od przypuszczalnej liczby drobnoustrojów w badanej próbie.

Gdy rozcieńczenie wyjściowe materiału wynosi -i rłO, dalsze rozcieńczenia w probówkach przedstawiają sie następująco:

probówka nr	i	2	3	4
rozcieńczenie	i:10tt	1:10tXI	1:10000	1:100000
masa produktu (g)	0,01	0,001	0,0001	0,00001
lub	I0'^2g	I0'^3g	lO^g	io-^5g

POSIEW ILOŚCIOWY METODA PŁYTKOWA

Metoda płytkowa wprowadzona została przez Roberta Kocha > oprócz liczenia znalazła zastosowanie do izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych kolonii mikroorganizmów, Posiewu można dokonać w dwojaki sposób; albo przez wprowadzenie badanej próbki do płytki i zalanie jej upłynnionym podłożem stałym (metoda zalewowa), albo przez wprowadzenie próbki na powierzchnie zastygłego podłoża i rozprowadzeniu za pomocą głaszczki (metoda posiewu powierzchniowego).

W metodzie zalewowej z przygotowanych rozeieńczeń posiewa się jałowo do płytek po i cm³ zawieśmy.

Przed przystąpieniem do posiewów należy opisać płytki, to znaczy odnotować na wieczku rodzaj próby, podłoże, rozcieńczenie, datę posiewu oraz nazwisko wykonującego posiew. Posiewy na płytki można wykonywać równolegle z rozcieńczeniami, jak podano wyżej, lub po zakończeniu sporządzania rozeieńczeń. Wówczas można jedna sterylna pipeta dokonać posiewu jednej próbki, zaczynając od największego rozcieńczenia,

Po posianiu zawiesiny do płytki wlewa sie podłoże agarowe upłymone t ostudzone do 50°C. W tej temperaturze agar jeszcze me krzepnie, natomiast przy wyzszej mogłyby ulec zabiciu niektóre drobnoustroje.

Do płytek wlewa sie około 15 cm³ podłoża i bardzo starannie miesza, ostrożnie poruszając płytkę ruchem kolistym po powierzchni stołu, tak aby mc zamoczyć brzegów płytki i wieczka. Zazwyczaj podłożami ss bulion zestalony agarem lub bulion agarowy z dodatkiem ekstraktu drożdżowego, brzeczka agarowa ftp.

Po zakrzepnięciu pożywki płytki wstawia sie do termostatu o określonej temperaturze. Płytki z pozywku agarowa ustawia się w termostacie odwrócone dnem do góry, a płytki zestalono żelatyna ustawia sie normalnie.

Zakresy temperatur oraz czas hodowli dla bakterii: psychrofile 0 - 2tf*C 4 -14 dni mezofile    30-37°C    48 - 72 godzin

termofile    55 - 65°C    24 - 48 godzin

grzyby    22 - 28°C    72 - 96 godzin

Po inkubacji liczy sie wyrosłe kolonie na trzech równoległych płytkach. Do liczenia wybiera się płytki z tych rozeieńczeń, którycn liczba wyrosłych kolonii nie przekracza 300. Licząc kolonie natęży zaznaczać je dermografem. Aby otrzymać liczbę drobnoustrojów w I g lub I cm³, średnia wartość z trzech płytek należy pomnożyć przez odwrotność rozcieńczenia. Wynik należy przedstawić jako liczbę miedzy 1,0 a 9,9 pomnożoną przez I0\ gdzie x jest odpowiednim wykładnikiem potęgi 10.

PRZYKŁAD: w rozcieńczeniu I0² wyrosło na płytkach: 53, 56, 62 kolonii. Średnia x (53 + 56 + 62) . 3 = 57 kolonii. W jednostce miarowej (1 cm³, I g) znajduje sie 57 x I O² komórek, to jest 3,7 x I0³,

OZNACZENIE LICZBY DROBNOUSTROJÓW METODA POSIEWU POWIERZCHNIOWEGO

Przy ilościowym oznaczaniu określonych grup drobnoustrojów na podłożach wybiórczych stosuje się posiew powierzchniowy na pożywki uprzednio rozlane i zestalone w płytkach. Najczęściej posiewa się po 0,1 łub 03 cm³ z odpowiednich rozeieńczeń próbki i natychmiast rozprowadza równomiernie po cuicj powierzchni za pomocą specjalnie wygiętej jałowej bagietki (głaszczki).