Metody izolacji i oczyszczania DNA (1)

2.2. Izolacja całkowitego DNA - informacje ogólne

Wstępnym etapem w procesie izolacji jest liza komórek, w których znajduje się DNA. Dezintegrację komórek (rozpad błon komórkowych) przeprowadza się metodami fizycznymi, na przykład przez zamrażanie i rozmrażanie (w przypadku komórek prokariontów), lub metodami chemicznymi, na przykład przez dodanie detergentu, lizozymu albo innych enzymów trawiących błonę komórkową. W przypadku tkanek stałych przed zastosowaniem metody chemicznej należy je zawsze rozdrobnić.

Podczas izolacji DNA należy zapobiegać jego degradacji przez różnego rodzaju DNazy (enzymy trawiące DNA, mogące znajdować się również na dłoniach). Obecność czynników chelatujących, takich jak EDTA, zapobiega uaktywnieniu się DNaz, ponieważ enzymy te ulegają aktywacji w obecności dwudodatnich jonów metali, a substancje chelatujące je wiążą. Aby uniknąć nawet nieznacznych ilości DNaz, należy używać jałowych płynów, autoklawowanego sprzętu (probówki i końcówki do pipet) i wszystkie czynności wykonywać w jednorazowych rękawiczkach ochronnych.

Kolejny etap polega na usunięciu z roztworu frakcji komórkowych niezwiązanych z kwasem nukleinowym przez odwirowanie, a następnie oddzielenie DNA od związanych z nim białek histonowych. W tej procedurze najczęściej stosuje się proteinazę K lub pronazę - enzymy z klasy proteaz trawiące białka, i nasycony buforem roztwór fenolu, chloroformu z alkoholem izoamylowym lub kombinację tych roztworów.

Uwolniony DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropylowym w obecności soli (octanu potasu, sodu lub amonu albo chlorku sodu) lub rozpuszczany chloroformem. Aby usunąć RNA, który może znajdować się w otrzymanych izolatach, należy dodać RNazy (enzymy trawiące. RNA) lub wytrącić go selektywnie chlorkiem litu (wymagany jest specjalistyczny sprzęt). Otrzymany czysty DNA można zawiesić w roztworze buforu TE lub w jałowej wodzie i przechowywać w temperaturze +4°C lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20°C.

2.3. Metody ekstrakcji całkowitego DNA

W zależności od sposobu oczyszczania i wytrącania DNA wyróżnia się dwie główne metody ekstrakcji: fenolowo-chloroformową i solną. Obie metody mogą być stosowane wymiennie, niezależnie od rodzaju tkanki. Pierwsza, wykorzystująca roztwory fenolu i chloroformu, skutecznie wiąże zanieczyszczenia organiczne (proces czyszczenia może być powtarzany podczas ekstrakcji), ale źle usunięty z próbki fenol może być inhibitorem w późniejszej reakcji amplifikacji. Metoda wykorzystująca do wytrącania DNA 6M roztwór chlorku sodu jest bardzo wydajna, ale może nie usuwać wszystkich zanieczyszczeń organicznych, na przykład lipidów. Standardowo do obu typów izolacji potrzebnych jest od 300 do 1000 pi tkanek płynnych lub od 100 do 500 mg tkanek stałych. Dla szybkich i doraźnych analiz zamiast pozyskiwać oczyszczony DNA długotrwałą metodą można otrzymać jedynie lizat, czyli roztwór zawierający komórki z rozerwaną błoną i uwolnionym, ale pozostającym na białkach histonowych kwasem nukleinowym. Ta forma DNA jest nietrwała, po 24 godzinach od jej otrzymania ulega degradacji. Ekstrakcję DNA można również przeprowadzić jedynie z wykorzystaniem substancji chela-tujących; pozwala się wtedy na powolny rozpad błon komórkowych (w podwyższonej temperaturze i w obecności proteaz) i uwolnienie kwasu nukleinowego. Obecne w roztworze substancje chelatujące wiążą dwudodatnie jony metali, zapobiegając tym samym uwalnianiu się DNAz. W tej metodzie również nie stosuje się żadnych metod „doczyszczających”. W przeciwieństwie do lizatu próbkę otrzymaną w ten sposób można przechowywać przez długi okres w temperaturze -20°C. Dwóch ostatnich metod nie można stosować do tkanek miękkich i krwi obwodowej.

Wraz z rozwojem nowych technologii usprawniła się technika szybkiego pozyskiwania DNA wysokiej jakości z małych objętości tkanek. Złoża selektywnie wiążące DNA, tzw. kolumny, są membranami celulozowymi nasączanymi odpowiednimi związkami chemicznymi. Pozwalają one na otrzy-

— 14 —