Obraz2

A)

Szczelina ok. 1 mm

Przekładki grubości 1 mm

Rys. 3. Schemat przygotowania płytek szklanych do polimeryzacji mieszaniny akrylamid : metyleno-bis-akrylamid i komórki (enzym)

A) widok w przekroju B) widok z góry ; 1 - dolna płytka, 2 - górna płytka

b)    Przygotowanie mieszaniny do polimeryzacji i otrzymanie membrany enzymatycznej W zlewce 50 ml zmieszać kolejno:

3,6 ml mieszaniny akrylamid / metyleno-bisakrylamid

2.1    ml 0,1 M bufom Tris_octan o pH 6

2.1    ml wody redestylowanej 0,5 ml preparatu inwertazy

10 ul TEMED (pod wyciągiem)

— odgazować ^ mieszaninę pod próżnią pompki wodnej (lub pompy olejowej) Dodać 30 ul 10% roztworu nadsiarczanu amonu (katalizator polimeryzacji) i niezwłocznie wylać mieszaninę na dolna płytkę tak, aby wypełniła przestrzeń pomiędzy płytkami*'*

Obciążyć płytki ciężarkiem aby zapewnić dobry docisk do przekładek i pozostawić do polimeryzacji która powinna zajść po około 30 minutach w temperaturze pokojowej.

Po zakończonej polimeryzacji ostrożnie rozdzielić płytki, powierzchnię żelu (membrany) pozostałego na płytce delikatnie przemyć woda destylowaną celem usunięcia niespoli-

-    meryzowanych monomerów.

Przy pomocy korkobora o średnicy 1 - 1,5 cm wyciąć z membrany krążki które zostaną użyte bezpośrednio do dalszych doświadczeń lub przechowywać je w 50 mM buforze octanowym o pH 5, w temperaturze ok. 4°C, trwałość około miesiąca.

^ Odgazowanie mieszaniny usuwa rozpuszczony tlen który hamuje polimeryzację. Polimeryzacja żelu pomiędzy szybkami szklanymi również zabezpiecza mieszaninę przed kontaktem z tlenem obecnym w powietrzu, ponadto pozwala na otrzymanie gładkiej, jednorodnej membrany o grubości równej grubości użytych przekładek. W przypadku cienkich membran (np. do biosensorów) delikatny żel można wzmocnić przez polimeryzację na podłożu takim jak gaza bawełniana lub flizelina które ulegną „wtopieniu” w spolime-

-    ryzowany żel nadając mu dużą odporność mechaniczną.

c)    Zbadać przebieg hydrolizy sacharozy przez inwertazę pułapkowaną w żelu poliakrylamidowym w zależności od czasu inkubacji oraz ilości enzymu (ilości

3