10 technologia DNA bmp

Streszczenie

•    Rekombinacyjna technologia DNA zrewolucjonizowała badania komórek, umożliwiają wybranie dowolnego genu spośród tysięcy genów zawartych w komórce i dokładne określenie jego struktury (po powieleniu — amplifikacjigenu).

•    Istotnym elementem tej technologii jest możliwość rozcinania długich cząsteczek DNA na specyficzne zestawy fragmentów za pomocą nukleaz restrykcyjnych, z których każda rozcina dwuniciową helisę DNA tylko w miejscu występowania określonych krótkich sekwencji nukleotydowych.

•    Fragmenty DNA można rozdzielać na podstawie ich wielkości za pomocą elektroforezy żelowej.

•    Są już dostępne techniki pozwalające szybko określać sekwencje nukleotydowe izolowanych fragmentów DNA.

•    Obecnie poznano już sekwencję nukleotydową genomów kilku organizmów jednokomórkowych (w tym kilku bakterii i drożdży). Należy się spodziewać, że w ciągu najbliższej dekady zostaną poznane genomy bandziej skomplikowanych organizmów (pewnego ni-cenia, muszki owocowej, kilku roślin, a nawet człowieka),

•    Za pomocą technik hybiydyzacyjnych można w mieszaninie kwasów nukleinowych wykryć dowolną sekwencją fragmentów DNA lub RNA. Techniki te po-kgąją na zdolności pojedynczych nici DNA lub RNA do tworzenia dwunicicwych helis tylko z łańcuchami o komplementarnej sekwencji nuklcotydów.

•    Jako sondy w reakcjach liybrydyzacji stosuje się jed-nonicicwe DNA o znanych sekwencjach, znakowane barwnikami fluorescencyjnymi lub radioizotopami. Hybrydyzację kwasów nukleinowych można wykorzystać do określenia lokalizacji genu w chromosomie lub RN\ w komórce albo w tkance.

•    Metodami chemicznymi (bez użycia enzymów) w laboratoriach można syntetyzować łańcuchy DNA o długości do 120 nukleotydów.

•    Za pomocą kloncwama spośród mrlronów rozmaitych cząsteczek DNA można wyselekcjonować DNA o określonej sekwencji i powielić go w czystej postaci w dowolnej ilości.

•    Stosując ligazę DNA możemy in vitro kowalencyjnie łączyć ze sobą fragmenty' DNA, uzyskująjc cząsteczki DNA nie występujące w warunkach naturalnych.

•    Pierwszym etapem typowej procedury' klonowania jest wprowadzenie fragmentu DNA, który' zamierzamy klonować, do cząsteczki DNA zdolnej do replikacji, takej jak plazmid lub genom wirusa. Zrekombi-ncwaną cząsteczkę DNA wprowadza się następnie do komórek ulegających szybkim podziałom, zwykle bakterii, tak by wprowadzony' DNA ulegał replikacji podczas każdego podziału komórkowego.

•    Kolekcję klonowanych fragmentów chromosomowego DNA, stanowiących kompletny genom jakiegoś organizmu, nazywamy biblioteką genomową. Bibliotekę taką często utrzymuje się w bakteriach. Każdy' z klonów zawiera inny' fragment genomu.

•    Klonowane kopie (w formie DNA) wszystkich niRNA określonego typu komórek lub tkanek nazywa się bibliotekami cDNA. Inaczej niż w przypadku klonów gcnomowych, klonowane cDNA zawierają tylko sekwencje kodujące białka. Nie ma w nich in-tronów, sekwencji regulatorowych ani promotorów. Są najbardziej przydatne do tego, by' doprowadzić do ekspresji genu na poziomie białka.

•    Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR) jest potężnymi sposobem amplifikacji DNA przeprowadzanej in vitro z użyciem polimerazy DNA. PCR wymaga wstępnej znajomości sekwencji oskrzydlających fragment DNA przeznaczony' do powielenia. Konieczne są dwa startery', komplementarne do sekwencji oskrzydlających powielany fragment.

•    Klonowane geny' można w sposób trwały'wprowadzić do genomu komórki lub oiganizmu za pomocą odpowiednich technik inżynierii genetycznej. Klonowany DNA można zmienić in vitro, tworząc na zamówienie gen zmutowany', któiy wprowadza się na powrót do organizmu, aby określić funkcję danego genu.

•    Inżynieria genetyczna ma dalekosiężne konsekwencje. Bakterie, drożdże i komórki ssaków można tak zmienić genetycznie, ty' syntetyzowały duże ilości określonego białka z dowolnego organizmu. Pozwala to badać białka, które w naturalnych warunkach występują w znikomych ilościach lub któiych izolowanie jest trudne z innych powodów.