72462 skanuj0010

Wynik końcowy oznaczania. Jako wynik końcowy oznaczania należy podać aktywność dehydrogenaz dla próbek z glukozą oraz dla próbek bez dodatku glukozy. Jeżeli aktywność dehydrogenaz w próbce z dodatkiem glukozy jest równa lub niższa niż aktywność dehydrogenaz w próbce bez dodatku glukozy, w której zachodzi oddychanie endogenne, oznacza to, że dodana glukoza nie stanowi źródła węgla dla mikroorganizmów osadu, a więc osad czynny wykazuje aktywność tylko® stosunku do substratów komórkowych.

2.    Przygotowanie krzywej wzorcowej TF

Przygotowanie roztworu roboczego TF. Do kolby miarowej ..o psj. 50 ntl pobrać 5; ml podstawowego, uzupełnić do kreski alkoholem n-butylowym i wymieszać. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 0.2 pmola TF.

Przygotowanie krzywej wzorcowej. Do siedmiu cylindrówS^poj, fft ml odmierzyć kgjijńo OĄll.O, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 i 10 ml roztworu roboczego tjS i uzupełnić alkoholem ig$tg|g)owym: $ TffiMkłftii 50 ml. Tak przygotowane wzorce zawierają odpowiednio: 0.1,,0,2, 0.4, 0.8, 1.2, f;.#i^.O pmola TF we wzorcu. Z każdego przygotowanego wzorca pobrać próbkę i zmierzyć jej absorbancję przy długości fali 490 nm, stosując jako odnośnik alkohol n-butylowy.

3.    Oznaczanie zawartości białka osadu czynnego

5 ml osadu wirować przez 5-10 minut przy 10000-15000 obr/min. Płyn znad osadu zlać, a osad rozpuścić w 5 ml 1 M NaOH. Próbkę ogrzewać przez 5 minut na wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodzić i żwirować przez 10 minut przy 10000 obr/min. Zlać płyn nadosadowy i oznaczyć, w nim zawartość białek. W tym celu do probówek pobrać po 50 pi płynu nadosadowego i dodać 2.5 ml odczynnika Bradforda rozcieńczonego 1:4. Następnie po 5 minutach dokonać pomiaru spektrofotometrycznego względem próby ślepej (niezawierającej białka - woda destylowana) przy długości fali 595 nm. Zawartość białka w próbie (5 ml) odczytać z krzywej standardowej. Wynik podać w mg/ml.

Wykonanie krzywej wzorcowej. Z roztworu podstawowego albuminy (rp) o stężeniu 500 pg/ml przygotować rozcieńczenia o stężeniach: 50,100,200,300,400 pg/ml w następujący sposób:

0.0 ml rp + 1 ml fizjologicznej lub wody dest.    ,    = 0 pg/ml

0.1 ml ip + 0.9 ml soli fizjologicznej lub wody dest. = 50 pg/ml 0.2 ml rp    + 0.8 ml    soli fizjologicznej    =100    pg/ml

0.4 ml rp    + 0.6 ml    soli fizjologicznej    = 200    pg/ml

0.6 ml rp    + 0.4 ml    soli fizjologicznej    = 300    pg/ml

0.8 ml rp + 0.2    ml    soli fizjologicznej    ⁼    pg/ml

Z każdego rozcieńczenia + kontrola (woda destylowana) pobrać po 50 ul do probówki i dodać 2.5 ml odczynnika Bradforda rozcieńczonego 1:4. Po 5 min. dokonać pomiaru spektrofotometrycznego względem próby ślepej,