Biotechnologia roślin

Pojęcie „biotechnologia”

Metody otrzymywania form haploidalnych i linii podwojonych haploidów

Wykład 1

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Sulechowie

2005/2006

Biotechnologia roślin ogrodniczych

Wykład dla studentów po kursie „Genetyki, biotechnologii i hodowli roślin”

Pojęcie biotechnologii

-wykorzystanie techniki kultur in vitro

-zastosowanie metod genetyki molekularnej do diagnostyki i selekcji

-przenoszenie genów na drodze pozageneratywnej

Biotechnologia -definicja

Biotechnologia - zastosowanie wiedzy naukowej i inżynierii do przetwarzania organizmów , komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania dóbr i usług

Kultura in vitro

Kultura in vitro jest specyficznym sposobem uprawy materiału roślinnego w warunkach sterylnych, w różnego rodzaju pojemnikach.

Technika ta pozwala z małego fragmentu pobranego z organu rośliny uzyskać wzrost, rozmnożenie materiału i odtworzenie całej rośliny.

Technika in vitro znalazła zastosowanie do:

otrzymywania form haploidalnych

-rozmnażania wegetatywnego cennych materiałów

-otrzymywania roślin wolnych od patogenów

- kultury zarodków

-kultury protoplastów (tworzenie mieszańców somatycznych)

-selekcji w kulturach in vitro

-produkcji metabolitów wtórnych, mikropropagacji i produkcji biomasy w bioreaktorach

-otrzymywania roślin transgenicznych

Niezbędnymi warunkami prowadzenia kultury in vitro jest dobór właściwego materiału roślinnego, pożywki do jej uprawy i warunków zewnętrznych - oświetlenia i temperatury.

Redyferencjacja

-Bodźcem wyzwalającym odróżnicowanie w kulturach in vitro jest odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce

Haploidy

Haploidy - organizmy o gametycznej liczbie chromosomów

Monoploidy - haploidy powstałe z organizmu diploidalnego

Polihaploidy - haploidy powstałe z organizmu pol

Haploidy

 Rośliny haploidalne w kulturach in vitro można otrzymać poprzez:

-  kultury pylników i mikrospor

- wykorystując zjawisko eliminacji chromosomów w zarodkach mieszańców oddalonych

-wykorzystując geny stymulujące proces powstawania form haploidalnych

- metodami chemicznymi

idalnego

Otrzymywanie haploidów w kulturach pylnikowych

Jest to proces złożony, zależny od wielu czynników:

stanu fizjologicznego rośliny, z której pobierane są pylniki

 sposobu traktowania ściętych kłosów przed wyłożeniem pylników na pożywkę

 stadium rozwojowego pyłku

 komponentów pożywek indukcyjnych i regeneracyjnych

 warunków fizycznych hodowli pylników

Androgeneza

Istnieją dwa zasadnicze kierunki rozwoju androgenicznego

- bezpośredni rozwój mikrospory w zarodek. W ciągu 4-8 tygodni z zarodków pojawiają się rośliny

-pośredni poprzez kalus

Wykorzystanie form haploidalnych

Wykorzystanie form haploidalnych i linii podwojonych haploidów w hodowli umożliwia skrócenie cyklu hodowlanego oraz zapewnia homozygotyczność form wyjściowych

Haploidy można wykorzystać w hodowli roślin jeśli:

- metodyka produkcji haploidów jest wydajna

- rośliny haploidalne powstają w sposób losowy (odpowiadają losowej segregacji gamet)

-znane są efektywne metody podwajania liczby chromosomów

Linie DH

Linie podwojonych haploidów (linie DH) są to formy powstałe w wyniku podwojenia liczby chromosomów u haploidów.



Podwajanie liczby chromosomów u haploidów przeprowadza się najczęściej przy użyciu kolchicyny.  

Kultura zarodków

Kultury zarodków wykorzystuje się w celu:

-  przerwania okresu spoczynku nasion

-  uzyskania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania

-  otrzymania roślin mieszańcowych

-  otrzymania form haploidalnych

Kultura zarodków

Okres spoczynku nasion jest cechą indywidualną i charakterystyczną dla danego gatunku.

W rodzaju Irys okres spoczynku wynosi do kilkudziesięciu miesięcy. Przerwanie okresu spoczynku nasion można uzyskać między innymi poprzez izolację zarodków z nasion na pożywki sztuczne.

Uzyskiwanie roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania

Często w nasionach mieszańcowych bielmo ulega znacznym zaburzeniom w swoim rozwoju. Zarodek pozbawiony substancji odżywczych jakich dostarcza bielmo nie ma w warunkach naturalnych żadnych szans rozwoju. Przeniesienie takiego zarodka na pożywkę sztuczną zastępującą bielmo pozwala uzyskać wiele różnych mieszańców międzygatunkowych lub haploidów. W przypadku roślin ozdobnych metoda ta znajduje zastosowanie w hodowli róż.

Kultura niezapłodnionych zalążków

Jest to metoda alternatywna do techniki uzyskiwania haploidów drogą androgenezy. Wykorzystuje się tu zjawisko gynogenezy, czyli rozwoju zarodków z niezapłodnionych komórek gametofitu żeńskiego w warunkach kultury in vitro zarodków). U roślin ozdobnych stosunkowo łatwo jest uzyskać haploidy tą techniką u Gerbery

Kultura zalążków

W praktyce często zamiast izolować zarodki, przenosi się całe zalążki zawierające zarodki we wczesnych stadiach embriogenezy. W przypadku roślin ozdobnych technika ta znalazła wykorzystanie w takich gatunkach jak Pisum, Helianthus, Glycine. Technika ta jest szczególnie przydatna w produkcji siewek storczyków, z uwagi na bardzo małe nasiona tego gatunku.

Kultury protoplastów

Kultury protoplastów pozwalają na otrzymywanie mieszańców somatycznych nie tylko przez połączenie jąder komórkowych, ale również przez zlanie się cytoplazmy partnerów, wnoszące dodatkowo cechy dziedziczone plazmatycznie (poprzez informację zawartą w mitochondriach i chloroplastach).

Kultury protoplastów

Protoplastem nazywamy komórkę roślinną pozbawioną ściany komórkowej, najczęściej wskutek trawienia enzymami. Za pomocą łączenia protoplastów różnych gatunków można otrzymać mieszańce somatyczne między odległymi systematycznie roślinami.

Mieszańce somatyczne są to komórki i zregenerowane z nich rośliny otrzymane w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych

Mieszańce somatyczne

W procesie otrzymywania mieszańców somatycznych wyróżniamy następujące etapy:

-izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów form przeznaczonych do fuzji

-fuzja protoplastów spowodowana czynnikami powodującymi bezpośredni kontakt błon protoplastów (czynnikami chemicznymi lub elektrofuzją), ich odwracalne niszczenie i odbudowanie

-identyfikacja i selekcja komórek mieszańcowych

-kultura in vitro komórek mieszańcowych i regeneracja roślin.

Kultury protoplastów 

Bezpośrednio po fuzji cytoplazma komórek mieszańcowych zawiera wszystkie organelle obu komponentów fuzji. Z upływem czasu skład takiej komórki znacznie się zmienia, tak że w końcu powstają na ogół komórki o składzie genetycznym znacznie różniącym się od wyjściowego.

Selekcja w kulturach in vitro

Warunkiem skuteczności selekcji w kulturze in vitro jest występowanie korelacji między reakcją komórki lub tkanki w kulturze, a reakcją otrzymanej z niej rośliny. Selekcja jest prowadzona zazwyczaj przy użyciu czynnika selekcyjnego. W przypadku hodowli odpornościowej mogą być to np. mykotoksyny a hodowli na suszę określone sole.

Zalety selekcji w kulturze in vitro
-możliwość oceny dużej liczby komórek lub osobników na małej powierzchni (przy założeniu iż istnieje szansa znalezienia korzystnego rekombinanta z częstotliwością 1:10000, u ogórka 10 płytek Petriego o średnicy 6 cm zastępuje 30 ha doświadczeń polowych)

-możliwość badania wielu osobników równocześnie

-uniezależnienie się od występowania interakcji genotypowo-środowiskowej

-ochrona środowiska przed szkodliwością czynnika selekcyjnego.

Wykład 2

Mikrorozmnażanie roślin

Produkcja materiału rozmnożeniowego, wolnego od patogenów

Zmienność somaklonalna

Kwalifikowany materiał rozmnożeniowy

Uzyskany na drodze mikrorozmnażania materiał musi być wolny od patogenów.

Producent powinien wydać certyfikat międzynarodowy (ISO-9001 lub HACCP) gwarantujący jakość produktu jak i zachowania odpowiednich procedur w procesie produkcji

Materiał rozmnożeniowy musi spełniać jakościowe normy genotypu

OWT (oryginalność, wyrównanie, trwałość)



Prawidłowa kondycja roślin

Adaptacyjność rozwojowa

Zanieczyszczenia mikrobiologiczne eksplantatów
Patogeny

Epifity

-mikoplazmy (charakteryzują się brakiem ściany komórkowej)

-bakterie

Bakterie epifityczne

Bakterie gramujemne na ogół stymulują mechanizmy odpornościowe roślin na niesprzyjające warunki środowiska, oraz mechanizmy obronne na patogeny grzybowe i bakterie



Występują zarówno pojedynczo jak i w grupach często w trudno dostępnych miejscach (pod łuskami przylistkami, w pąkach itp..). Trudne do dezynfekcji.

Endofity

Endofity- grzyby i bakterie przeżywające większą część życia wewnątrz organizmów. Często uważa się, że żyją w symbiozie z rośliną.

Przykłady: bakterie tzw. brodawkowe (Acetobacter)

Bakterie wydzielające toksyczne dla owadów i nicieni metabolity (lolitrem B i ergowalinę). Ochraniają rośliny przed tymi organizmami

pZapobieganie infekcji materiału w stadium początkowym kultury in vitro

Pojawiające się w początkowym okresie kultury in vitro drobnoustroje na eksplantatach lub pożywce są wnoszone z eksplantatami

Zapobieganie : specjalne traktowanie roślin w fazie prekultury (poprzedzającej pobieranie eksplantatów), tzw. stadium „0”

Prekultury (stadium „0”)

Prekultura - zespół zabiegów pozwalających otrzymać odmłodzone eksplantaty , częściowo lub całkowicie wolne od patogenów.

Selekcja wartościowych okazów , które będą podlegały klonowaniu

Prekultury (Stadium „0”)

1. Zabezpieczenie roślin przed infekcją (opryski, sposób podlewania

2. Zidenyfikowanie bakterii i grzybów Test ELISA, PCR i inne)

3. Przygowanie rośliny , części roślin lub eksplantatów do kultury in vitro, termoterapia

4. Dezynfekcja powierzchniowa

5. Dezynfekcja wewnętrzna (np. zieleń malachitowa)

6. Stosowanie fungicydów i pestycydów

Stabilizacja eksplantatów (Stadium 1)

Cel: uzyskanie eksplantatów wolnych od patogenów

Stabilizacja eksplantatów (Stadium 1)

Zapobieganie infekcjom:

-umiejętna sterylizacja

-sprawny sprzęt (kontrola sterylności pomieszczeń, stołów laminarnych)

-eliminacja eksplantatów zaatakowanych patogenami

-indeksacja roślin matecznych

Indeksacja roślin matecznych

Indeksację na obecność patogenów można przeprowadzać bezpośrednio na roślinach matecznych lub/i eksplantatach

Dwustopniowość kontroli poprzez testowanie roślin matecznych i test izolowanych z nich eksplantatów stanowi wystarczającą gwarancję , że nie będą namnażane tkanki z bakteriami wolno rosnącymi lub trudnymi do wykrycia

l Na podstawie obecności bakterii lub grzybów w eksplantatach w fazie stabilizacji kultury można wnioskować stanie zdrowotności roślin donorowych.

Pozwala na eliminację z mateczników roślin chorych, a w szczególności roślin zainfekowanych patogenami kwarantannowymi (np. Phytophthora, Xanthomonas)

Indeksacja pozwala więc ograniczyć liczbę eksplantatów odrzucanych w procesie produkcji z powodu zainfekowania patogenami

Metody identyfikacji patogenów

obserwacje właściwości fizjologicznych i biochemicznych na pożywkach wybiórczo-różnicujących

-testy bakteriologiczne oparte na wykorzystywaniu różnych źródeł węgla przez badane szczepy bakterii (kupuje się gotowe zestawy).

-

-techniki oparte na markerach molekularnych (PCR)

Namnażanie roślin (faza 2)

testowanie kultury in vitro na obecność patogenów (monitoring kultur)

• kontrola procesu mikrorozmnażania (monitoring kultur

Monitoring kultur

Produkcja wielkotowarowa jest stale monitorowana mikrobiologicznie

Monitorowanie przeprowadza się poprzez testowanie fragmentów eksplantatów na specjalnej pożywce (pożywce testowej dla wykazania obecności bakterii lub grzybów)

Test ten pozwala na ujawnienie 50-70% wniesionych do pożywki z eksplantatem drobnoustrojów

Biotyzacja (faza 3)

Biotyzacja- wprowadzenie do pozywki mikroflory korzystnej dla rozwoju roślin

Aklimatyzacja (faza 4)

Aklimatyzacja- przygotowanie roślin do wysadzenia w szklarnii

Kontrola stabilności genetycznej i zdrowotności dla uzyskania certyfikatu (faza 5)

Zmienność somaklonalna

Otrzymane w wyniku mikrorozmnażania rośliny z tego samego genotypu mogą fenotypowo różnić się od siebie przez pewien czas lub na stałe.

Zmienność somaklonalna - definicja

Pojawienie się nowych cech u roślin uzyskiwanych z kalusa w hodowli tkankowej. Zmienność taka jest wynikiem mutacji punktowych, translokacji chromosomowych.

Zmienność somaklonalna wywoływana kulturą in vitro jest indukowana na skutek wzrostu komórek, tkanek, zachodzenia procesu regeneracji itp. w oderwaniu od środowiska naturalnego jakim jest cały organizm rośliny

Źródła zmienności somaklonalnej

1. Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego

2. Zmienność wywołana kulturą in vitro

Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego

Eksplantaty mogą posiadać komórki o różnej ploidalności i zmutowane komórki somatyczne, które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazania zmienionych cech drogą generatywną.

Podatność na zmienność somaklonalną

Podatność zależy od:

1. Gatunku rośliny

-nie ulegają zmienności somaklonalnej lilia i hiacynt

-podatne tytoń, trzcina cukrowa

2. Ploidalności (poliploidalne łatwiej ulegają zmianą)

3. Fragmenty poprane ze starszych fragmentów organów zwiększają częstotliwość pojawiania się zmienności somaklonalnej

4. Sposób prowadzenia kultury

-Pasaże

-Płynne pożywki

-Regulatory wzrostu (szczególnie 2,4D)

Zmienność somaklonów charakteryzuje się dużą niestabilnością a kierunek zmian nie jest możliwy do przewidzenia.



Selekcja pozytywna jest wykorzystywana w hodowli dla poszerzenia zakresu zmienności genetycznej

Zmienność somaklonalna wywiera niekorzystny wpływ na proces uzyskiwania roślin modyfikowanych genetycznie (GMO)

Odmiany wyhodowane z wykorzystaniem zmienności somaklonalnej

Najwięcej odmian roślin ozdobnych z wykorzystaniem zjawiska zmienności somaklonalnej wyhodowano u D. Grandiflora, Ficus sp., Orchids sp., Pelargonium sp., Syringa.,

---