Untitled 

w różnych fazach rozwojowych roślin, względnie w różnych warunkach zewnętrznych np. pod wpływem stresu. Cele te można osiągnąć przy użyciu zaproponowanej przez Lianga i Pardee (1992) metody określającej zróżnicowanie składu produktów,. RT-PCR (DDRT-PCR). W pierwszym etapie część cząsteczek mRNA jest poddawaną|. odwrotnej transkrypcji przy użyciu startera komplementarnego do ogona poli(A); który zawiera dwa losowe nukleotydy selekcyjne od końca 3', np. 5'-T,,C«® Otrzymane nici cDNA są następnie amplifikowane w reakcji PCR z użyciem Sfc

T_nCA i startera d/.iesięcionukleotydowego o losowej sekwencji. Produkty ampli-fikacji, znakowane radioaktywnie, są rozdzielane na długim żelu sekwencyjnym,-^' ze względu na dużą liczbę prążków otrzymywanych na autoradiogramach. Metodą"; tą można porównywać skład mRNA nie tylko w różnych tkankach rośliny^ lecz również w liniach izogenicznych różniących się pod względem alleli ko|| dujących ważną cechę użytkową, np. odporność na patogena. Przy tak zapk nowanym doświadczeniu metoda DDRT-PCR może doprowadzić do wykr markera molekularnego sprzężonego z loeus cechy użytkowej lub do identyfd właściwego genu.

Markery AFLP

Polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP) jest metodą i liwiającą fingerprinting DNA, która łączy zalety PCR i k* LP [331. Picrwsz etap AFLP polega na trawieniu oczyszczonego DNA dwoma enzymami restrykc nymi (rys. 8.2.5). Jeden z enzymów, rozpoznający sekwencje sześcionukleotydó| (np. EcoRl) przecina dwuniciowy DNA znacznie rzadziej niż drugi enzym |

MseI) właściwy dla sekwencji czteronukleotydowych. Do tak otrzymanych fragnij tów restrykcyjnych przyłączane są z obu stron krótkie adaptory. Dwa startery słu do preamplifikacji mają sekwencję komplementarną do części adaptorowej i miejs restrykcyjnego oraz jeden selekcyjny nukleotyd na końcu 3'. Zadaniem nukleotydójjf selekcyjnych jest ograniczenie liczby amplifikowanych fragmentów. Po wstępną^ amplifikacji, w mieszaninie reakcyjnej znajdują się liczne fragmenty DNA, której rozcieńczeniu będą stanowić materiał matrycowy dla właściwej, selektywn amplifikacji. Jest ona prowadzona z użyciem starterów, różniących się od tyć z pierwszej fazy ocecnością dwóch dodatkowych nukleotydów selekcyjnych! końcach 3'. Starter wiążący się z miejscem EcoRl jest wyznakowany izotopem i Powielone fragmenty zostają rozdzielone w sekwencyjnym, denaturującym poliakryloamidowym. Autoradiogram otrzymany po ok. 1 dniu ekspozycji składąsję na ogół z ok. 50-100 prążków tworzonych przez wyznakowane, jednoniciov fragmenty EcoRMMsel. Ze względu na duże zagęszczenie prążków odczytywain autoradiogramu znacznie ułatwia komputerowa analiza obrazu.

Markery AFLP są przeważnie dominujące, lecz mimo to znajdują przede,f wszystkim zastosowanie w konstrukcji silnie zagęszczonych map genetycznych?-Ich główną zaletą jest możliwość analizy' wielu segregujących loci na jednym ; autoradiogramic. Ze względu na dużą rozdzielczość i wiarygodność, AFLP jest wykorzystywany do identyfikacji odmian hodowlanych.

Genomowy DNA po oczyszczeniu

3GAATTCE

■ CTTAAG1

■AAT

trawienie DNA EcoRI orazMsel

[ Fragmenty EcoRI/Msel^

i*

AATTCESS3EESIT

G    AAT ₅’

ligacja 7 adaptorami |

1	Przyłączenie starterów preseleklywnych	<-CAATEZJ SnAATTCA-► i ■i TT AA G AAm

PCR

właściwa selokcja fragmentów

5’issiaattc

Przyłączanie starterów selektywny .h (starter EcoHł znakowany radioaktywnie)

I (starter

I l^fadioa>

Namnożone (ragmenły zawierające sekwencje ACG/ATG

1

OTAATTCAC ■TTAAGTl

amplifikacja selektywna |

J

Rozdzielone tragmenty o różnej długości uwidocznione na kliszy rentgenowskiej

⁵ aa AATTCACGtSSSBSSSSATGTTACE! m TTAAGTGCa*a««TACAAT» ₅

ełoktroforeza denaturującym żelu poliakrylamidowym_

⁵'ee*] AATTcosssssassrrABa

	Fragmenty EcoRl/Msel po ligacji z adapiorami		MTTAAGHi	■MMIAAIU
t			PCR wstępna selekcja fragmentów

Rys. 8.2.5. Strategia otrzymywania markerów AFLP

Biotedinntrto;-