309 (23)

lub uwzględniając wielkości dostępne w pomiarach:

(12.13)

s • /

"^m7H

p&ite m - droga migracji ccfttki. t - długotf notfnika rwd/iału. / - CW uwania dcktroforc/y. U - przyłożona różnica potmejatfw

Elektroforezę przeprowadza się. stosując natężenie poła w zakresie do 10 V/m (elektroforeza niskonapięciowa) lub w warunkach chłodzenia przy natężeniu pola około 100 V/m (elektroforeza wysokonapięciowa). W tabeli 12.1 przedstawione są różne odmiany elektroforezy. Podstawowe odmiany elektroforezy to: elektroforeza swobodna i elektroforeza na nośnikach.

Elektroforeza swobodna jest procesem rozdzielania cząstek, wskutek kh różnych ruchliwości, zachodzącym w roztworze Klasycznie do realizacji tego rozdziału wykorzystuje się naczynia typu U-rurki (obecnie do analizy niskomolckulamych jonów - jónofore/y używana jest kapilarna elektroforeza pasmowa). Korzystniejszy niż uzyskany metodą klasyczną rozdział mieszaniny białek może być zrealizowany za pomocą swobodnej elektroforezy przepływowej. W tym przypadku pole elektryczne jest przyłożone w kierunku prostopadłym do kierunku przepływającego między płytami szklanymi roztworu białek, co prowadzi do różnicowania frakcji w wycieku. Elektroforeza swobodna może być traktowana jako metoda preparatyw-na.

Dużo sprawniejsze w zakresie preparaty w nym i analitycznym są metody elektroforem na nośnikach. które występują w postaci żelu lub folii. Szczególnie wartościowa jest metoda z zastosowaniem żelu poliakrylamidowego (dla białek) i agaro-zowego (dla DNA). Występuje tu połączenie efektu elektroforezy oraz sita molekularnego. Zmiana usieciowama żelu i składu środowiska umożliwia rozdział ze względu na masę cząsteczkową, punkt izoclcktryczny (ogniskowanie i/oelek-trycznc) oraz biospccyficzność (immunoclekirofurcza).

W celu uzyskania pasm rozdziału, zarówno przy elektroforezie białek, jak i DNA (RNA). stosuje się specyficzne ich barwienie lub autoradioRrafię (przy posługiwaniu się znakowanymi radioizotopami składników roztworów). Wyznaczenie ruchliwości elektroforetyczncj wymaga dokładnego oznaczenia położenia pasm. co można uzyskać, posługując się mikrodensytometrem umożliwiającym określenie absorbancji wzdłuż żelu. na który m prowadzono rozdział (ryc. I2.l2a). Kalibracja wstępna układu z wykorzystaniem białek, oligopeptydów lub oligonuklcotydów umożliwia oznaczenia masy cząsteczkowej występujących frakcji (ryc. I2.l2b).

W warunkach oznaczeń analitycznych w odniesieniu do danej, wyróżnionej frakcji białek lub kwasów nukleinowych wykorzystuje się efekt elucji W przypadku białek korzysta się z metody elektrolitycznego przenoszenia frakcji na uczuloną (immobili/owaną) Nonę PVDF (polyviny!idcnc difluoridc) metodą ..clectroblo-tting". a następnie sckwcncjonowonia aminokwasów wykorzystując sekwentator według Edmana i Begga.

Elektroforeza jest zatem użyteczną metodą analityczną i preparaty wną

309