9 (497)

- —---~~~~wmregu uwa oa genomowego

Ł»N A ( oczyszczenie DNA plazmidowego) Mimo, te W poszczególnych metodach etapy te przebiegają w odmienny sposób,

wykorzystuje się w nck dwie istotne różnice pomiędzy DNA genenaowyw E-coli a DNA plazmidowym:    ¹    —————

1.    DNA geaomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidowego.

2.    W czasie procesu otrzymywania DNA plazmidowego DNA eeoomowy /ostaje trwałe zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje na ogól w postaci kowaientme zamkniętych cząsteczek (tzw. forma CCC). Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem (np. ampicylina, kanamycyna). Po całonocnej hodowli, gdy bakterie osiągną fazę wzrostu S (stacjonarną) osadza się komom bakteryjne poprzez wirowanie. Następnie odwirowane bakterie poddawane są bzie np. pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl. Triton X-100), rozpuszczalników organicznych^ Hza alkahcznajlub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany iest również nzosym-enzym trawiący ścianę komórkową bakterii ( me działa w pH < 8.0)

W metodzie lny atfcabczae) tenor w wytototmy. Zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą liżę komórek. SDS niszczy błony komórkowe i denaturuje białka, odczyn zasadowy powoduje denatmację amoniowego DNA i rozpoczyna hydrolizę RN A. Plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zoenaturowany jedynie na mewidkrch odcinkach. Następnie roztwór jest zobojętniany poprzez dodanie octanu amonu. To powoduje wytrącenie się w postaci serowatego osadu /denaturowanych białek, chromosomowego DNA. Próba jest powtórnie wirowana, a uzyskany lizat zawiera plazmidowy DNA, który jako mały i superticltkalny łatwo ulega renaturacji po zobojętnieniu. Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izonopanoteni. Elektroforeza- to wędrówka obdarzonych tartakiem cząsteczek w polu ddtiyaayn. Ib technika stasowana przy rozdziale oczyszczaniu, analizie kwasów